王 旭，關(guān) 靜，張 勇

心血管疾病是全球最常見的死亡原因，嚴(yán)重危害人類的健康和生存質(zhì)量（世界衛(wèi)生組織，2017年）。心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一種常見的心血管疾病，可由冠狀動脈閉塞引起，持續(xù)的缺血可造成不可逆的心肌損傷和病理性心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致心力衰竭[1]。傳統(tǒng)的MI治療方法有應(yīng)用β受體阻滯劑、抗血小板藥物、抗凝藥物等藥物療法，以及包括溶栓治療和心臟介入手術(shù)的心肌再灌注治療[2]。由于心肌再生能力有限，傳統(tǒng)的治療方法僅能改善MI的癥狀，或延緩心臟功能的惡化，無法實現(xiàn)梗死后心肌功能的重建。心臟移植雖是替代MI終末期心力衰竭患者受損心臟的有效療法，但由于供體器官緊缺、免疫排斥反應(yīng)和器官移植后感染等問題的存在，仍亟需一種可促進(jìn)心肌再生、重建梗死心肌功能的新療法。

心肌組織工程學(xué)是一門基于工程學(xué)和生命科學(xué)技術(shù)與原理，在體外利用種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞因子合成具有功能性的心肌組織替代物，旨在實現(xiàn)MI后受損心肌組織的修復(fù)、再血管化與功能重建的新興學(xué)科[3]。正常生理條件下，心肌細(xì)胞通過協(xié)調(diào)動作電位和鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)實現(xiàn)興奮-收縮偶聯(lián)[4]。因而，理想的工程化心肌組織除了具有優(yōu)異的生物相容性及與心肌相一致的機(jī)械性能，還應(yīng)具有匹配天然心肌電生理特性的導(dǎo)電性，為心肌提供適宜的導(dǎo)電微環(huán)境，重建心肌興奮-收縮偶聯(lián)。導(dǎo)電納米材料，如碳納米材料、金屬納米粒子、MXenes、導(dǎo)電聚合物等，均具有與天然心肌相匹配的電導(dǎo)率，為構(gòu)建心臟類器官提供了可能，并已應(yīng)用于心肌組織工程，可有效恢復(fù)心臟功能。應(yīng)用含金屬納米粒子、二維（two-dimensional，2D）過度金屬碳/氮化物MXenes及導(dǎo)電聚合物的工程化心臟貼片[5，6]均可顯著降低MI后的MI面積。碳納米材料，如碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）和石墨烯因其獨特的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

1 碳納米管

CNTs是由石墨烯卷曲而成的無縫、中空、圓柱形納米管結(jié)構(gòu)，可根據(jù)石墨烯的層數(shù)分為單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs），每層管壁中的碳原子均以SP2雜化方式形成蜂窩狀原子層[7]。以SP2方式雜化的碳鍵具有更大的強(qiáng)度，使CNTs具有更高的機(jī)械強(qiáng)度，單個MWCNTs的彈性模量約為1 TPa，抗拉強(qiáng)度為100 GPa，這種機(jī)械強(qiáng)度高于工業(yè)纖維10倍以上。同時基于SP2方式雜化的碳結(jié)構(gòu)具有更快的電荷遷移速率，使CNTs具有良好的導(dǎo)電性能，MWCNTs可攜帶高達(dá)109A/cm2的電流[8]。典型的SWCNTs直徑為0.8~2.0 nm，MWCNTs的直徑為5~20 nm，長度可從數(shù)十納米至幾厘米不等[8]，這種極高的長徑比，可模擬天然組織固有的各向異性。目前CNTs的合成方法包括物理方法（電弧放電法、激光消融法）和化學(xué)方法（化學(xué)氣相沉淀法）。

基于CNTs在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出的應(yīng)用潛力，CNTs除了被應(yīng)用于體內(nèi)細(xì)胞示蹤、藥物及基因輸送，還可與其他材料相混合制成支架，應(yīng)用于心肌組織工程，以改善支架導(dǎo)電性。Kharaziha M等[9]將CNTs平行地嵌入明膠納米纖維支架中，顯著改善了支架材料的導(dǎo)電性和柔韌性。CNTs的嵌入模擬了天然心肌各向異性的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了心肌細(xì)胞在支架上的黏附、滯留及排列，增強(qiáng)了心肌細(xì)胞的活性和成熟度。在含CNTs的支架上種植的心肌組織更均質(zhì)，具有更高的跳動率和更低的興奮閾值。Liu Y等[10]利用CNTs調(diào)節(jié)電紡纖維支架的導(dǎo)電性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)混入超過3%的CNTs后纖維支架中可形成導(dǎo)電網(wǎng)絡(luò)，使心肌細(xì)胞活性增加，形態(tài)伸長并可同步搏動。Mombini S等[11]以聚乙烯醇、殼聚糖和CNTs為底物，利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建了納米纖維支架，并通過電刺激成功誘導(dǎo)了支架上大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs）向心肌細(xì)胞的分化，其中含1%CNTs的改良支架展現(xiàn)出了最佳的心肌細(xì)胞分化性能。CNTs也可與1，2，4-丁三羧酸酯等聚合物組合制成支架，與純聚合物支架相比，含CNTs的聚合物支架上接種的心肌細(xì)胞有更高的成熟度和更早的心臟搏動[12]。隨著對導(dǎo)電納米材料研究的不斷深入，越來越多的導(dǎo)電納米材料被應(yīng)用在了心肌再生領(lǐng)域，Lee J等[13]分別用CNTs、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）和還原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO）制成甲基丙烯?；髂z（gelatin methacryloyl，GelMA）水凝膠，并比較了這3種碳納米材料水凝膠對心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。研究表明，在CNTs-和rGO-GelMA支架上培養(yǎng)的心肌細(xì)胞具有更理想的細(xì)胞形態(tài)和更高的功能性心臟標(biāo)志物表達(dá)，且CNTs-GelMA可介導(dǎo)整合素，激活Yes相關(guān)蛋白/轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基序（Yes-associated protein/transcriptional coactivator with a PDZ-binding domain，YAP-TAZ）通路促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟，使工程化心肌組織的成熟標(biāo)志物表達(dá)水平達(dá)到天然心臟組織成熟標(biāo)志物表達(dá)水平。此外，由不同支架構(gòu)建的工程化心肌組織具有不同的心肌細(xì)胞表型，CNTs-GelMA呈心室樣、GO-GelMA呈心房樣、rGO-GelMA呈心室/心房混合型。綜上，在CNTs支架上生長的心肌細(xì)胞可展現(xiàn)出更規(guī)律的排布與搏動，使CNTs在工程化心肌組織的支架材料中展現(xiàn)出更大的優(yōu)勢。

但是關(guān)于CNTs體內(nèi)應(yīng)用的細(xì)胞毒性問題一直存在爭議。部分證據(jù)表明，CNTs在體內(nèi)可誘發(fā)炎癥、上皮樣肉芽腫、纖維化和氧化應(yīng)激，但也有研究表明CNTs的毒性取決于它的長度和表面修飾[14]。過長的CNTs被細(xì)胞吞噬時可能會使細(xì)胞膜破裂，提示人們通過化學(xué)氧化法制備縮短的CNTs在心肌組織工程中的應(yīng)用潛力[14]。為了提高CNTs的生物相容性，Zhao G等[15]研發(fā)了一種全水相工藝，用以合成定向排列的CNTs/絲素蛋白電紡支架。該支架不僅可促進(jìn)心臟組織的定向生長、肌節(jié)及縫隙連接的仿生分布，全水相工藝的應(yīng)用還提高了支架的生物相容性。Shokraei N等[16]采用電噴涂技術(shù)將MWCNTs添加到聚氨酯納米纖維上制備了具有更好的細(xì)胞相容性的導(dǎo)電納米纖維貼片。工程化心肌組織常通過侵入性手術(shù)植入人體，為克服這一局限性，Pe?a B等[17]研發(fā)了一種具有CNTs功能化的可注射反向熱凝膠，該凝膠在達(dá)到人體體溫后可轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂腥S（three-dimensional，3D）結(jié)構(gòu)的凝膠基質(zhì)。這種凝膠可促進(jìn)心肌細(xì)胞的排列和增殖，改善心肌細(xì)胞功能，同時也提出了一種通過微創(chuàng)手術(shù)將CNTs支架植入人體的新方法。此外，研究表明CNTs在生物降解過程中存在潛在毒性[18]，因而在評估CNTs本身毒性的同時，CNTs分解產(chǎn)物的毒性還有待更全面的評估。

2 石墨烯及其衍生物

石墨烯是由1個碳原子與3個相鄰碳原子通過SP2雜化形成的具有蜂窩狀結(jié)構(gòu)的2D碳原子單層，具有優(yōu)異的導(dǎo)電性[粉末狀樣品電導(dǎo)率為（2 500±20）S/m]，是迄今為止最薄、最堅韌的材料。GO是一類重要的石墨烯衍生物，表面有豐富的官能團(tuán)（環(huán)氧基、羥基、羧基），具有水溶性，在水介質(zhì)中能穩(wěn)定存在，可應(yīng)用于體內(nèi)藥物或基因的傳送[19]。GO是一種絕緣體[粉末狀樣品電導(dǎo)率為（0.021±0.002）S/m]，經(jīng)熱還原為rGO后可恢復(fù)導(dǎo)電性[粉末狀樣品電導(dǎo)率為（2 400±200）S/m][20]。

石墨烯及其衍生物具有較大的比表面積，出色的電學(xué)、光學(xué)特性，并有研究報道與CNTs相比，石墨烯具有更低的細(xì)胞毒性[21，22]，因此被廣泛應(yīng)用于生物傳感、生物成像和組織再生等領(lǐng)域。Hitscherich P等[23]利用靜電紡絲技術(shù)，將石墨烯納米粒子添加到聚己內(nèi)酯[poly（caprolactone），PCL）支架中，石墨烯在PCL中的均勻分布提供了局部導(dǎo)電位點，可通過電刺激石墨烯位點對整個支架實施外部電刺激。該支架對小鼠胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞（mouse embryonic stem cell derived cardiomyocytes，mES-CM）展現(xiàn)出了良好的生物相容性和增強(qiáng)的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力。MI后M1型巨噬細(xì)胞在MI區(qū)域形成的局部炎癥環(huán)境，可加重心力衰竭。Han J等[24]合成了一種靶向巨噬細(xì)胞的GO復(fù)合物，該復(fù)合物不僅可減少細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平來緩解炎癥，還可分泌細(xì)胞因子促進(jìn)心肌修復(fù)。Zhou J等[25]將GO摻入富馬酸寡聚（聚乙二醇）[oligo（poly（ethylene glycol））fumarate，OPF]制備了一種具有半導(dǎo)體性能的水凝膠。GO的功能團(tuán)豐富，易于與傳統(tǒng)支架材料通過共價結(jié)合形成復(fù)合支架，隨后可通過對復(fù)合支架還原處理，恢復(fù)石墨烯的導(dǎo)電性。Norahan MH等[26]通過冷凍干燥法制備了膠原支架，與GO包覆后用還原劑處理支架，獲得了具有促血管生成特性的導(dǎo)電心臟貼片。rGO-Gel-MA支架[27]、rGO-海藻酸鹽水凝膠[28]及rGO-銀-聚氨酯納米纖維支架[29]均在心肌組織工程中顯示出了良好的應(yīng)用前景。且該支架中rGO具有抗菌特性，可通過氧化應(yīng)激破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，為應(yīng)用的心臟貼片提供抗菌微環(huán)境[30]。Stone H等[31]采用超聲法和粒子浸出法相結(jié)合的新技術(shù)，將rGO摻入電紡聚（酯酰胺）[poly(ester amide)，PEA]支架，研發(fā)出了高孔隙率的導(dǎo)電支架。除了生物相容性，理想的心臟支架還需具有3D結(jié)構(gòu)，以模擬天然心肌組織微環(huán)境。Bahrami S等[32]以泡沫鎳作為模板，利用化學(xué)氣相沉淀法制備了具有更大比表面積的3D石墨烯泡沫，并研討了其在心肌組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。以石墨烯及其衍生物為支架的工程化心肌組織可以修復(fù)心臟組織、恢復(fù)心功能。Tsui JH等[33]利用3D生物打印技術(shù)成功將脫細(xì)胞豬心肌細(xì)胞外基質(zhì)-rGO雜化水凝膠構(gòu)建成工程化心肌組織，實現(xiàn)了心臟藥物毒性的測定，也為建立高通量藥物篩選平臺提供了可能。

目前石墨烯主要的制備方法包括氧化還原法和化學(xué)氣相沉淀法。氧化還原法適合大規(guī)模生產(chǎn)，但純度較低，生成的GO有下調(diào)神經(jīng)元信號傳導(dǎo)的風(fēng)險[34]。化學(xué)氣相沉淀法應(yīng)用更廣，但獲得的石墨烯底物不易處理不利于體內(nèi)植入，且常需摻入其他蛋白來增強(qiáng)生物功能。為此Hernandez Y等[35]開發(fā)了液相剝離技術(shù)，以大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)量高、未氧化、適合生物應(yīng)用的單層石墨烯；Ryan AJ等[36]探討了該技術(shù)的商業(yè)可行性、生物相容性和在心肌組織工程中的應(yīng)用前景。關(guān)于石墨烯合成的方法、復(fù)合的支架材料及支架結(jié)構(gòu)的選擇，還需根據(jù)心臟生理學(xué)、MI病理學(xué)基礎(chǔ)，進(jìn)行更深入的探究。研究表明，20～300 nm大小的GO可被細(xì)胞攝取[37，38]，同時石墨烯較高的縱橫比，常會導(dǎo)致合成石墨烯形狀的不確定，研制能夠控制聚合產(chǎn)物形狀，如寬度、長度、邊緣結(jié)構(gòu)的石墨烯納米帶的合成方法也將推動石墨烯在臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。部分研究表明，石墨烯可能會通過物理作用擾亂細(xì)胞骨架組織、有絲分裂、細(xì)胞器完整性、細(xì)胞運(yùn)動及細(xì)胞分泌，或可能通過氧化應(yīng)激產(chǎn)生潛在毒性[39]。因而在活體動物的研究中，還需評估石墨烯在體內(nèi)的生物分布、生物持久性和慢性毒性。

3 總結(jié)與展望

具有優(yōu)異導(dǎo)電性的CNTs和石墨烯常被作為心肌組織工程的支架材料，CNTs或石墨烯的添加不僅能賦予工程化心肌組織優(yōu)越的機(jī)械性能和柔韌性，還可通過共價或非共價官能化調(diào)節(jié)心肌的電生理。表1、2分別總結(jié)了基于CNTs和石墨烯及其衍生物的工程化心肌組織的支架類型及特性。碳納米材料應(yīng)用于心肌組織工程的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究仍有很多局限性亟待臨床突破。首先，碳納米材料作為組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)中的新興材料，需加強(qiáng)其臨床前安全性評價。明確應(yīng)用碳納米材料的有效劑量，材料本身及其降解產(chǎn)物在體內(nèi)的分布、存留時間及毒性，并通過官能團(tuán)修飾等方式提高碳納米材料的生物相容性。另外，需對碳納米材料在心肌組織工程中的應(yīng)用作全面的臨床有效性評價。除嚙齒類動物，還需增加豬等大型動物樣本量，延長隨訪時間，觀察長期治療效果及可能存在的副作用。研究表明，碳納米材料可介導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)典Wnt信號通路[25]，或通過增加細(xì)胞膜膽固醇量活化G蛋白偶聯(lián)受體P2Y受體（purinoceptor 2Y），進(jìn)而激活細(xì)胞信號通路[40]。因而深入了解碳納米材料的生物學(xué)作用，也有益于進(jìn)一步評估碳納米材料的有效性。最后，碳納米材料常通過心肌內(nèi)注射或心臟貼片等方式植入體內(nèi)，為了減少開胸手術(shù)對患者造成的傷害，需開辟微創(chuàng)介入等植入工程化組織的新途徑。相信隨著工程技術(shù)與醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)的交叉融合將攻破心肌組織工程的關(guān)鍵技術(shù)，實現(xiàn)這項創(chuàng)新醫(yī)療產(chǎn)品的成果轉(zhuǎn)化，使基于碳納米材料的工程化心肌組織成為治療MI的常規(guī)備選方案之一。

表1 基于CNTs的工程化心肌組織的支架類型和特性Tab.1 Support types and properties of engineered myocardial tissue based on CNTs

表2 基于石墨烯及其衍生物的工程化心肌組織的支架類型和特性Tab.2 Support types and properties of engineered myocardial tissue based on graphene and its derivatives