董昭櫻，張新杰，支秀芳，范文軒，張玉琴，舒劍波，蔡春泉，李 東

琥珀酸半醛脫氫酶缺陷癥（succinate semialdehyde dehydrogenase deficiency，SSADHD）是一種罕見(jiàn)的代謝紊亂性疾病，常染色體隱形遺傳，主要受醛脫氫酶5家族成員A1基因（aldehyde dehydrogenase 5 family member A1 gene，ALDH5A1）所影響。這種疾病會(huì)妨礙γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的正常降解并導(dǎo)致4-羥基丁酸 （γ-hydroxybutyric，GHB）在尿液和腦脊液中的累積。SSADHD在臨床表型上具有高度異質(zhì)性，沒(méi)有典型的臨床表征，有的患者無(wú)明顯臨床癥狀，有的患者則表現(xiàn)為非常嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。對(duì)SSADHD致病基因ALDH5A1的基因突變篩查，將有助于SSADHD的診斷、治療及后續(xù)研究。高分辨率熔解（high resolution melting，HRM）曲線是近年來(lái)開(kāi)始流行且發(fā)展很快速的一項(xiàng)基因突變篩查技術(shù)，其高靈敏度可檢測(cè)出基因中單個(gè)堿基的差異。該研究以之前發(fā)現(xiàn)的4例SSADHD患兒及其親屬為研究對(duì)象，擬利用一代測(cè)序結(jié)果，建立HRM曲線法對(duì)ALDH5A1熱點(diǎn)致病基因突變位點(diǎn)c.1529C>T的快速篩查方法，并隨機(jī)對(duì)80例患兒樣本進(jìn)行篩查分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 臨床材料

4例SSADHD患兒既往已報(bào)道[1]，現(xiàn)病史簡(jiǎn)述如下。先證者1，86 d男性患兒，因間斷抽搐2個(gè)月余，加重2 d入院；24 h腦電圖未見(jiàn)異常；頭MRI示雙側(cè)額、頂葉片狀稍長(zhǎng)T2信號(hào)，腦室、腦外間隙增寬，雙側(cè)上頜竇黏膜增厚；遺傳代謝病尿篩查提示GHB尿癥。先證者2，4個(gè)月男性患兒，因精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后就診；24 h腦電圖未見(jiàn)異常；頭MRI示腦室、腦外間隙增寬；遺傳代謝病尿篩查示GHB尿癥。先證者3，8個(gè)月女性患兒，因精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后就診；頭MRI示腦室腦溝增寬，髓鞘發(fā)育延遲；肌電圖示神經(jīng)電圖正常。先證者4，7個(gè)月男性患兒，因反復(fù)抽搐、發(fā)熱入院；頭MRI示中腦及雙側(cè)基底節(jié)區(qū)對(duì)稱(chēng)性長(zhǎng)T1、長(zhǎng)T2信號(hào)病變。80例患兒樣本均來(lái)自天津市兒童醫(yī)院生物樣本庫(kù)，年齡（7.5±3.9）歲；其中男性48例，女性32例；均無(wú)基礎(chǔ)病。

1.1.2 主要儀器與試劑

HRM試劑選用Forget-Me-NotTMEvaGreen qPCR Master Mix（貨號(hào)31042-1；Biotum，美國(guó)）。血DNA提取試劑盒為Blood Genomic DNA MiniKit（康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó)）。

儀器及分析軟件選用LightCycler?480高通量實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）系統(tǒng)（Roche，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

用EDTA抗凝管收集患者外周血2 mL，然后用Blood Genomic DNA MiniKit提取基因組DNA。

1.2.2 ALDH5A1基因測(cè)序

參考筆者所在課題組之前針對(duì)ALDH5A1的10個(gè)外顯子所設(shè)計(jì)的測(cè)序用引物[2]，委托金唯智生物科技有限公司進(jìn)行引物的合成及后續(xù)的基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中美國(guó)國(guó)家生物信息中心參考序列（NM_001080.3/NP_001071.1）進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 建立高分辨率熔解曲線的突變篩查方法

（1）PCR引物設(shè)計(jì)：應(yīng)用Primer Premier5軟件針對(duì)ALDH5A1第10外顯子中c.1529設(shè)計(jì)HRM曲線引物，正向引物5'-CATGGTTGGCGTCAACGAAGG-3'，反向引物5'-ATCAATGCCATACTTGGACCCCTC-3'。

（2）擴(kuò)增產(chǎn)物大小103 bp，PCR總體積為20μL，其中Mix 10μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板5 ng，用ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，共45個(gè)循環(huán)。PCR完成后直接進(jìn)行HRM曲線分析。HRM曲線分析參數(shù)：95℃1 min，40℃1 min，數(shù)據(jù)收集從65℃~95℃，溫度上升為1℃/s，且每高1℃進(jìn)行25次數(shù)據(jù)采集。將所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行HRM曲線和差異圖分析。

2 結(jié)果

2.1 ALDH5A1基因突變分析

對(duì)4例先證者ALDH5A1上10個(gè)外顯子分析并測(cè)序。在先證者1的DNA標(biāo)本中只檢測(cè)到c.1529C>T的純合突變，其母親為該位點(diǎn)的雜合攜帶者，其父親正常，懷疑非生物學(xué)父親或存在單親二體性；在先證者2的DNA標(biāo)本中同樣只檢測(cè)到c.1529C>T的純合突變，父母雙方均雜合攜帶；在先證者3的DNA標(biāo)本中檢測(cè)到復(fù)合雜合突變c.1529C>T和c.1383-2delA，前者遺傳自母親，后者遺傳自父親。在先證者4的DNA標(biāo)本中檢測(cè)到復(fù)合雜合突變c.691G>A和c.1529C>T，前者遺傳自母親，后者遺傳自父親。見(jiàn)圖1。

圖1 4例先證者在ALDH5A1第10外顯子上的基因突變測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequencing results of variants in exon 10 of ALDH5A1 of 4 probands

2.2 高分辨率熔解曲線建立情況及80例隨機(jī)樣本的篩查結(jié)果

選取先證者家系中c.1529位點(diǎn)純合突變基因型T/T、雜合突變基因型C/T和正?；蛐虲/C進(jìn)行擴(kuò)增，第10外顯子序列信息（圖2）。擴(kuò)增產(chǎn)物的HRM曲線良好，沒(méi)有非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)。完善已有4例先證者家系中所有成員，針對(duì)ALDH5A1中該位點(diǎn)進(jìn)行PCR-HRM曲線分析，其結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相一致。HRM曲線分析對(duì)于此位點(diǎn)有良好的檢出效果。80例隨機(jī)患兒樣本HRM曲線分析結(jié)果與先證者家系中正?；蛐虲C的HRM曲線相吻合（圖3），說(shuō)明80例患兒樣本沒(méi)有此位點(diǎn)的純合突變和雜合攜帶。

圖2 ALDH5A1的PCR-HRM曲線引物及c.1529突變位點(diǎn)Fig.2 PCR-HRM curve primers and c.1529 mutation of ALDH5A1

圖3 80例兒童ALDH5A1上c.1529的HRM曲線篩查結(jié)果Fig.3 HRM curve screening results of c.1529 of ALDH5A1 in 80 children

3 討論

SSADHD在臨床上可分為早發(fā)型和晚發(fā)型，但這并不意味著晚發(fā)型患者的癥狀更輕，此病病程進(jìn)展緩慢，有隨著年齡的增加病情愈發(fā)嚴(yán)重的情況[3]。有研究表明，在已確診的23例患者中就有7例在早期生活中表現(xiàn)與正常人無(wú)異，且沒(méi)有任何臨床癥狀[4]。SSADHD的確診主要依靠尿液或血液中有機(jī)酸的分析[5]。但是在新生兒期GHB在尿液中的累積并不顯著升高，雖然隨著患兒年齡的增長(zhǎng)會(huì)有所變化，但這個(gè)的水平變化不足以給予患者明確診斷[4]。這些都為臨床診斷帶來(lái)了不小的困難。而明確致病基因突變位點(diǎn)，對(duì)熱點(diǎn)突變進(jìn)行篩查，將有助于SSADHD的診斷治療及后續(xù)研究。

與SSADHD有關(guān)的致病基因現(xiàn)今為止只發(fā)現(xiàn)了ALDH5A1[6]，位于6號(hào)染色體短臂上22.3區(qū)，總長(zhǎng)度超過(guò)38 kb，其中開(kāi)放閱讀框1 605 bp，包含10個(gè)外顯子，共編碼535個(gè)氨基酸。有研究發(fā)現(xiàn)ALDH5A1上不同的突變位點(diǎn)對(duì)琥珀酸半醛脫氫酶的活性及穩(wěn)定性的影響是不同的[7]。而且不同地區(qū)、不同人群中ALDH5A1基因突變譜有很大的不同。在2003年有文獻(xiàn)[8]對(duì)全球范圍內(nèi)54個(gè)無(wú)親緣關(guān)系的家系進(jìn)行整理，總結(jié)了35個(gè)ALDH5A1的致病基因突變，其中26個(gè)點(diǎn)突變，4個(gè)插入，5個(gè)缺失。在26個(gè)點(diǎn)突變中有7個(gè)影響剪切位點(diǎn)的突變，7個(gè)無(wú)義突變，12個(gè)錯(cuò)義突變。到2014年，又有8例病例家系被報(bào)道[9]并在原有基礎(chǔ)上增加了9個(gè)新的致病基因突變位點(diǎn)，關(guān)于SSADHD的致病基因突變譜也一直在不斷增加補(bǔ)充中。該病在中國(guó)內(nèi)地很少見(jiàn)，只有很少的案例被報(bào)道過(guò)[9~11]。在2015年北京大學(xué)第一醫(yī)院報(bào)道了4例年齡分布在50 d~1歲的SSADHD患兒，以及6個(gè)在ALDH5A1上的新致病基因突變[12]，其中就有c.1529C>T突變。琥珀酸半醛脫氫酶位于線粒體上，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴(lài)性的酶，而c.1529C>T這個(gè)錯(cuò)義突變就位于NAD結(jié)合區(qū)域，當(dāng)正常的胞嘧啶被胸腺嘧啶所替代后，將會(huì)引起所編碼的蛋白由絲氨酸（Ser）到苯丙氨酸（Phe）的轉(zhuǎn)變（p.Ser510Phe），即中性氨基酸被非極性疏水性氨基酸替代，查詢(xún)ClinVar顯示此突變?yōu)橐饬x未明[13]。筆者研究中4例先證者也同樣帶有c.1529C>T位點(diǎn)突變，推測(cè)此位點(diǎn)可能為津冀地區(qū)SSADHD兒童患者一種常見(jiàn)的且重要的致病突變。

HRM曲線技術(shù)是近幾年新興的可用于基因突變鑒定的新技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和快速、簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)勢(shì)。在HRM曲線檢測(cè)技術(shù)中PCR和HRM曲線分析這兩個(gè)步驟可以在同一個(gè)平板上進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了完全的閉管操作，降低了污染風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)節(jié)省了時(shí)間。HRM曲線技術(shù)篩查致病基因突變已經(jīng)成功被應(yīng)用于多種遺傳性疾病的檢測(cè)中，包括蠶豆病、成骨不全、地中海貧血、多囊腎病等[14~17]。而國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有應(yīng)用HRM篩查SSADHD ALDH5A1致病基因突變的報(bào)道，筆者研究致力于應(yīng)用HRM曲線的方法來(lái)對(duì)SSADHD中熱點(diǎn)致病變異c.1529C>T進(jìn)行篩查，使其成為篩查的一種有效手段。