郭亞凈，任 靜，劉 寒，李亭亭，張 帥，王 洪

(河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)具有很高的死亡率和致殘率，幸存者會遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙[1,2]。大量研究表明，除了ICH后血腫壓迫引起的原發(fā)性腦損傷之外，血腦屏障破壞、腦水腫、炎癥反應(yīng)、凝血酶毒性效應(yīng)等繼發(fā)性腦損傷是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，造成不良預(yù)后的主要原因。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(the pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)炎性小體被激活后，促進(jìn)半胱天冬酶-1(cysteiny aspartate specific proteinase-1,caspase-1)的活化，caspase-1在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的同時，還介導(dǎo)細(xì)胞焦亡[3]。有研究顯示，ICH后NLRP3炎性小體被激活，并通過GSDMD在細(xì)胞膜上形成的小孔釋放IL-1β和IL-18等炎性因子，促進(jìn)血腫周圍組織中性粒細(xì)胞的浸潤和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重腦水腫和神經(jīng)功能障礙[4]。

本研究利用自體血注射大鼠模型，給予NLRP3炎性小體選擇性抑制劑MCC950，觀察抑制NLRP3炎性小體激活是否可以改善ICH后的神經(jīng)損傷，為尋找有效改善ICH預(yù)后的措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠72只，體重約250～300 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：CSXK[京]2016-0006。飼養(yǎng)條件，溫度恒定為(22±1)℃，濕度為(50±20)%，光照條件為晝夜各12 h，自由飲食水。動物實驗操作嚴(yán)格遵守河北中醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑

MCC950(APExBIO公司)；Fluoro-Jade?C(Millipore公司)；TUNEL檢測試劑盒(Roche公司)；蘇木精染液、伊紅染液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢塞維爾生物科技有限公司)；抗NLRP3抗體(Novus公司)；抗ASC、caspase-1、GSDMD抗體(Santa Cruz公司)；抗IL-1β、IL-18抗體(Abcam公司)。

1.3 主要設(shè)備

全自動腦立體定位儀(51700，stoelting公司，美國)；烘箱(UF160，MEMMERT公司，德國)；正置熒光顯微鏡(DMEB5300，Leica公司，德國)；全自動酶標(biāo)分析儀(EPOCH，Thermo Fisher公司，美國)；電泳儀(PowerPac Universal，Bio-Rad公司，美國)；半干轉(zhuǎn)印槽(Trans-BLot Smidry，Bio-Rad公司，美國)；多功能成像系統(tǒng)(Vilber Fusion FX5 Spectra，Vilber Lourmat，法國)。

1.4 動物分組與模型建立方法

將SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=24)：sham組、ICH組和MCC950組。參考相關(guān)文獻(xiàn)，建立ICH模型[4]。ICH組和MCC950組大鼠，1%戊巴比妥鈉，100 μl/g腹腔注射麻醉后，將其固定于全自動腦立體定位儀上。剪開頭部正中皮膚約1 cm，以前囟作為原點(diǎn)，向前0.12 mm，向右旁開3.8 mm，標(biāo)記為穿刺點(diǎn)。用顱鉆鉆開直徑約1 mm的小孔。取100 μl尾尖非抗凝血至微量注射器中，將微量注射器向下5.5 mm穿刺進(jìn)入紋狀體，以10 μl/min的速度注入血液，結(jié)束后停針20 min，緩慢退針。骨蠟封閉小孔，縫合切口。sham組除不注入血液外，其余操作均相同。手術(shù)時，房間內(nèi)溫度維持在24℃，同時監(jiān)測動物的體溫、血氧、血壓等。造模結(jié)束后，將MCC950溶解于PBS中，濃度為2 mg/ml。腹腔注射MCC950(10 mg/kg)[5]，在相同時間點(diǎn)連續(xù)注射3 d。sham組和ICH組僅注射等體積的PBS。

1.5 神經(jīng)功能評價

(1)前肢放置實驗用于評價大鼠的感覺運(yùn)動功能。測試者握住大鼠背部皮膚使四肢懸空，將大鼠胡須接觸桌面邊緣誘導(dǎo)其將前肢放置于桌面上，紋狀體受損大鼠，其受損對側(cè)肢體將出現(xiàn)不同程度的放置能力缺失。大鼠每側(cè)受測10次，左側(cè)前肢成功放置的百分率反應(yīng)損傷情況。(2)轉(zhuǎn)角實驗用于評價大鼠肢體協(xié)調(diào)功能。將大鼠放入一個兩塊板所形成的30°夾角內(nèi)，使其轉(zhuǎn)身，觀察并記錄大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)身的次數(shù)。每只大鼠重復(fù)放置10次，每次間隔至少30 s。左側(cè)轉(zhuǎn)身次數(shù)百分率反應(yīng)損傷情況。(3)mNSS神經(jīng)功能評分用于評價大鼠的運(yùn)動、感覺、平衡和反射功能。評分范圍為0～18分，分值越高，其神經(jīng)損害越嚴(yán)重。評分方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]。

1.6 新鮮腦組織切片

快速分離大鼠腦組織，以進(jìn)針點(diǎn)冠狀切面為起點(diǎn)，分別向前后以2 mm的厚度，將腦組織進(jìn)行切片，然后與標(biāo)尺同時拍照記錄。用Image J軟件測量各切片的血腫面積，血腫面積乘以切片厚度的總和得到血腫體積(mm3)。

1.7 干濕比重法

將腦組織分為病灶側(cè)皮質(zhì)、病灶側(cè)基底、病灶對側(cè)皮質(zhì)、病灶對側(cè)基底及小腦五部分，分別放入錫紙中，稱量濕重。然后，將烘烤后的腦組織取出稱量干重。利用公式：(濕重-干重)/濕重×100%，計算得到腦組織水含量。

1.8 標(biāo)本的留取和制備

暴露大鼠胸腔，用冰冷的PBS溶液將心血管系統(tǒng)內(nèi)的血液沖洗干凈。取出大腦，以進(jìn)針點(diǎn)冠狀面為基準(zhǔn)，分別向其前后延伸1 mm距離，切取厚約2 mm腦組織。用于病理學(xué)檢測的組織放入4%組織細(xì)胞固定液進(jìn)行固定、蠟塊包埋和組織切片；留取患側(cè)腦組織用于Western blot檢測，液氮中存放24 h后，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱備用。

1.9 蘇木精-伊紅(HE)染色

用于觀察血腫周圍腦組織病理學(xué)變化及水腫情況。正置顯微鏡下，每張切片選取4個視野，每只動物觀察3張切片。

1.10 Fluoro-Jade?C(FJC)染色

腦組織石蠟切片脫蠟至水后，用PBS沖洗3次，將切片浸入0.06%的髙錳酸鉀溶液中(在搖床上輕搖)，10 min后取出，PBS沖洗3次。在避光環(huán)境下，將切片浸入0.0001%的FJC染色液中染色。30 min后用蒸餾水沖洗3次。干燥后，將切片置于二甲苯中進(jìn)行透明，用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下，每張切片選取血腫周圍組織4個視野，并進(jìn)行FJC陽性細(xì)胞計數(shù)。

1.11 TUNEL染色

石蠟切片脫蠟至水后，蛋白酶K修復(fù)，然后用破膜工作液破膜，滴加buffer室溫平衡10 min后，滴加含有TDT酶、dUTP和buffer的反應(yīng)液(1∶5∶50)，37℃孵育2 h。最后，DAPI染核、抗熒光淬滅封片劑封片。在正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并采集圖像，每個切片在血腫周圍選取3個視野，每個腦組織選取3個切片。

1.12 Western blot

用RIPA裂解液將腦組織勻漿后，在4℃下，12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉PVDF膜后，孵育NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-1β和β-actin抗體，于4℃過夜。TBST洗滌后孵育二抗，隨后進(jìn)行ECL顯影，在多功能成像系統(tǒng)(Fusion FX5 Spectra,Vilber,Paris,France)上進(jìn)行拍照。用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，將目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

1.13 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MCC950對ICH大鼠神經(jīng)功能的影響

2.1.1 前肢放置實驗 與sham組比較，ICH大鼠左側(cè)前肢放置成功百分比顯著下降(P<0.01)；與ICH組比較，MCC950組大鼠左側(cè)前肢放置成功百分比顯著升高(P<0.05，表1)。

2.1.2 轉(zhuǎn)角實驗 與sham組比較，ICH大鼠左側(cè)轉(zhuǎn)身的百分比顯著下降(P<0.05)；與ICH組比較，MCC950組大鼠左側(cè)轉(zhuǎn)身的百分比顯著升高(P<0.05，表1)。

2.1.3 mNSS評分 與sham組比較，ICH大鼠的mNSS評分顯著升高(P<0.01)；與ICH組比較，MCC950組大鼠mNSS評分顯著下降(P<0.01，表1)。

Tab. 1 The results of forelimb placement test,corner test and mNSS neurological function n=12)

2.2 MCC950對ICH大鼠神經(jīng)損傷的影響

2.2.1 新鮮腦組織切片 與sham組比較，ICH大鼠腦內(nèi)存在較大體積的血腫(0.00±0.00 mm3vs26.37±1.65 mm3，P<0.01)；與ICH組比較，MCC950組大鼠血腫的體積顯著減小(26.37±1.65 mm3vs13.80±1.82 mm3，P<0.01，圖1)。

Fig. 1 Representative images of changes in hematoma volume in each group of rats

2.2.2 干濕比重 與sham組比較，ICH大鼠病灶側(cè)基底含水量顯著增多(P<0.05)；與ICH組比較，MCC950組大鼠病灶側(cè)基底含水量顯著減少(P<0.05)。然而，在病灶側(cè)皮質(zhì)、病灶對側(cè)皮質(zhì)、病灶對側(cè)基底及小腦，腦組織含水量沒有明顯變化(表2)。

Tab. 2 Water content of brain tissue in Ipsi-BG,Ipsi-CX,Con-BG,Con-CX and cerebellum(%, n=6)

2.2.3 FJC染色 與sham組比較，ICH大鼠血腫周圍腦組織中FJC陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(623.90±99.92 cells/mm2vs894.20±112.30 cells/mm2，P<0.05)；與ICH組比較，MCC950組大鼠FJC陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(894.20±112.30 cells/mm2vs637.10±82.950 cells/mm2，P<0.05，圖2)。

Fig. 2 Representative images of changes in the number of FJC positive cells in each group of rats (FJC ×400)

2.2.4 HE染色 Sham組大鼠血腫周圍腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)排列整齊，分布勻稱，細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)染色均勻。ICH組大鼠血腫周圍腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，排布不均，部分細(xì)胞固縮性壞死，染色加深。MCC950組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞腫脹明顯減輕，固縮壞死細(xì)胞數(shù)量減少(圖3)。

Fig. 3 Representative images of histopathological changes in each group of rats (HE ×400)

2.3 MCC950對NLRP3炎性小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡及炎癥的影響

2.3.1 TUNEL染色 與sham組比較，ICH大鼠血腫周圍腦組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(546.10±115.81vs1059.00±126.50 cells/mm2，P<0.05)；與ICH組比較，MCC950組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(1059.00±126.50 cells/mm2vs665.70±76.44 cells/mm2，P<0.05，圖4)。

Fig. 4 Representative images of changes in the number of TUNEL positive cells in each group of rats (TUNEL ×400)

2.3.2 Western blot 與sham組比較，ICH大鼠腦組織中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、caspase-1/pro-caspase-1比值、GSDMD-N、GSDMD、GSDMD-N/GSDMD比值、IL-1β和IL-18均顯著升高(P<0.05,P<0.01)；與ICH組比較，MCC950組大鼠腦組織中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、caspase-1/pro-caspase-1比值、GSDMD-N、GSDMD、GSDMD-N/GSDMD比值、IL-1β和IL-18均顯著降低(P<0.05,P<0.01，圖5，表3，表4)。

3 討論

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是神經(jīng)外科常見的腦血管疾病，具有致殘率高和致死率高的特點(diǎn)。ICH占所有腦卒中的比例，在美國、歐洲及澳大利亞約為10%～15%，在亞洲地區(qū)高達(dá)到20%～30%[7]。并且，僅有20%患者的神經(jīng)功能可在6個月內(nèi)完全恢復(fù)。隨著我國老年人口數(shù)量的逐漸增加，ICH發(fā)病人數(shù)也隨之增加，給眾多家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[8]。目前，盡管針對ICH的臨床治療方法有了明顯的改進(jìn)，但對于病人的預(yù)后并沒有明顯的改善。造成不良預(yù)后的原因主要是ICH后的腦組織損傷，通常在出血后數(shù)小時內(nèi)發(fā)生原發(fā)性腦損傷，主要由不斷增大的顱內(nèi)血腫壓迫周圍組織造成，逐漸誘發(fā)腦水腫和神經(jīng)損傷[9]。繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，造成不良預(yù)后的主要原因，包括血液成分溶解和血管中炎癥因子釋放的造成的血腦屏障破壞、腦水腫、炎癥反應(yīng)、凝血酶毒性效應(yīng)等[10]。

Tab. 3 Comparison of the expressions of proteins in brain tissue of each group by Western n=6)

Tab. 4 Comparison of the expressions of proteins in brain tissue of each group by Western n=6)

Fig. 5 Expressions of NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis and inflammation-related proteins in each group of rats brain tissues (n=6)

NLRP3炎性小體由模式識別受體蛋白NLRP3，凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和半胱天冬酶-1前體(pro-caspase-1)組成。當(dāng)NLRP3受體與其配體結(jié)合后被激活，pro-caspase-1自體水解為具有活性的P20和P10大小的兩個caspase-1亞基，亞基可形成異二聚體并進(jìn)一步形成四聚體，最終形成具有活性的caspase-1。活化的caspase-1進(jìn)一步促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的成熟[11,12]。NLRP3炎性小體在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的同時，還可介導(dǎo)細(xì)胞焦亡[4]。細(xì)胞焦亡是一種依賴炎癥性caspase的細(xì)胞程序性死亡方式?；罨腸aspase-1切割GSDMD，形成含有氮端活性域的GSDMD肽段，與細(xì)胞膜融合，誘導(dǎo)其穿孔，使細(xì)胞發(fā)生破裂，釋放IL-1β、IL-18炎性因子等內(nèi)容物，引起周圍組織更加強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[13]。同時，焦亡細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，DNA斷裂，所以焦亡細(xì)胞TUNEL染色為陽性[14]。

NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)被證實參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦缺血再灌注模型中，抑制NLRP3炎性小體激活或敲除NLRP3基因可減少IL-1β和IL-18的分泌，改善早期腦損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15-17]。在胰島素抵抗小鼠，抑制NLRP3炎性小體可以降低海馬內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白和炎癥因子的表達(dá)[18]。有研究顯示，ICH后NLRP3炎性小體被激活并促進(jìn)炎性反應(yīng)[19]。因而，抑制NLRP3炎性小體的激活可能是改善ICH后神經(jīng)損傷和神經(jīng)功能的重要機(jī)制。

本研究利用大鼠自體血注射ICH模型，觀察NLRP3炎性小體抑制劑MCC950對ICH后神經(jīng)損傷和神經(jīng)功能的影響。研究結(jié)果顯示，抑制NLRP3炎性小體顯著增加ICH大鼠前肢放置實驗中左側(cè)前肢的放置成功百分比、轉(zhuǎn)角實驗中左側(cè)轉(zhuǎn)身的百分比，降低ICH大鼠的mNSS評分，表明抑制NLRP3炎性小體可以改善ICH大鼠的神經(jīng)功能障礙。同時，抑制NLRP3炎性小體顯著減小ICH大鼠血腫的體積，改善組織病理學(xué)變化和腦組織水腫，減少FJC陽性細(xì)胞數(shù)量，表明抑制NLRP3炎性小體可以有效改善ICH大鼠的神經(jīng)損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ICH大鼠腦組織中NLRP3、ASC和caspase-1的表達(dá)及激活水平顯著升高，抑制NLRP3炎性小體有效地降低NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)及激活水平，表明抑制NLRP3炎性小體激活有效的抑制其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。另外，抑制NLRP3炎性小體顯著降低GSDMD的表達(dá)及激活并減少腦組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量，表明抑制NLRP3炎性小體激活有效的抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。

綜上所述，NLRP3炎性小體選擇性抑制劑MCC950可以通過抑制NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡改善ICH后的神經(jīng)損傷和神經(jīng)功能障礙。為有效改善ICH病人的預(yù)后提供理論依據(jù)。