郭紅艷，徐亞茹，李耕慧，孫曉杰，趙正林，吳 琦，劉 波

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生化教研室，2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科，3.齊齊哈爾市第一醫(yī)院老年科，4.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床生化教研室，5.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院辦公室，齊齊哈爾 161006)

胃癌(gastric cance，GC)是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其在中國的發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢。越來越多的證據(jù)顯示，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LincRNA)參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，與胃癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等相關(guān)[1，2]。Linc00673于2015年被鑒定為胰腺癌易感基因，可作為胰腺癌的預(yù)后診斷標(biāo)志物[3，4]。最近研究顯示，Linc00673在多種人類腫瘤組織中高表達(dá)，其在胃癌組織中的表達(dá)程度與胃癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)[5-7]。本文利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)Linc00673重組慢病毒載體，通過慢病毒包裝和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立過表達(dá)Linc00673的胃癌MGC-803細(xì)胞系，探討Linc00673過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人腎細(xì)胞293T、人胃粘膜細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞系MGC-803、BGC-823、AGS由本室凍存；本研究所用重組慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒pLVX-Puro-Linc00673由上海捷瑞生物工程有限公司構(gòu)建并測序鑒定，對照空載體質(zhì)粒pLVX-NC和慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院黃常志教授惠贈；RPMI 1640、DMEM、胎牛血清(FBS)和胰酶購自Gibco公司；嘌呤霉素、MTT和碘化丙啶(PI)購自Sigma-Aldrich公司；RT-qPCR試劑盒為翊圣生物公司產(chǎn)品；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為4A Biotech公司產(chǎn)品；所用抗體均為Cell signaling公司產(chǎn)品。

1.2 RT-qPCR檢測胃癌細(xì)胞中Linc00673基因的表達(dá)

細(xì)胞用含10% FBS的RPMI 1640(GES-1、MGC-803和BGC-823)或DMEM(AGS和293T)培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，0.25%的胰酶消化傳代。采用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用QuantStudioTM7 Flex 系統(tǒng)(ABI，美國)進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，檢測上述細(xì)胞系中Linc00673的表達(dá)。引物由Invitrogen公司合成，引物序列見表1，反應(yīng)條件如下：95℃，30 s預(yù)變性；95℃，10 s變性、60℃，30 s退火及延伸，循環(huán)40次，3個復(fù)孔/樣品，2-ΔΔCt計算基因的相對表達(dá)量。

1.3 慢病毒包裝與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

利用慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2，由PEI介導(dǎo)，將重組質(zhì)粒pLVX-Linc00673和空載體質(zhì)粒pLVX-NC分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得過表達(dá)Linc00673的慢病毒和對照空載體病毒。常規(guī)培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到20%～30%左右，分別用上述病毒感染細(xì)胞，48 h后用2 μg/ml嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)Linc00673的MGC-803細(xì)胞系和對照空載體細(xì)胞系，RT-qPCR方法鑒定Linc00673基因的表達(dá)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖

0.25%胰酶消化細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染pLVX-Linc00673和pLVX-NC的MGC-803細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔1 000個細(xì)胞，6個復(fù)孔/組，常規(guī)培養(yǎng)，每天取一塊培養(yǎng)板，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗，加110 μl MTT染液培養(yǎng)4 h，棄上清后加150 μl DMSO溶解沉淀，測492 nm吸光度值(OD492)，連續(xù)5 d。

1.5 克隆形成實驗

消化對數(shù)生長期細(xì)胞，制備各組單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后將細(xì)胞分別以200個/孔和500個/孔分散均勻接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)18 d，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染液染色15 min，拍照、計數(shù)細(xì)胞集落的形成。

1.6 細(xì)胞周期與凋亡檢測

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，0.25%無EDTA的胰酶消化后PBS洗滌，Annexin V-FITC/PI雙染，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡(BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀，USA)，CellQuest軟件分析結(jié)果；PI染色檢測細(xì)胞周期，ModFit軟件分析結(jié)果。

1.7 細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)檢測

消化對數(shù)生長期細(xì)胞，采用Trizol試劑提取總RNA，RT-qPCR試劑盒檢測細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子基因表達(dá)。引物序列(5'→3')見表1，PCR反應(yīng)條件同前所述。

Tab. 1 Primer sequences of RT-qPCR

1.8 免疫印跡實驗檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵因子

采用RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白，測蛋白濃度，取各組40 μg總蛋白進(jìn)行SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min，分別以1∶1 000稀釋一抗Bcl-2、pAkt、NF-κB、EZH2、β-catenin以及GAPDH，4℃孵育過夜，加二抗(1∶ 5 000)，37℃孵育1 h，ECL顯色后化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)檢測目的條帶，蛋白表達(dá)以靶蛋白/GAPDH積分光密度表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞中Linc00673基因的表達(dá)增高

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示：Linc00673基因在三種胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803和BGC-823中的相對表達(dá)量分別為4.384±0.501、4.551±0.214和4.510±0.278，在正常人胃粘膜GES-1細(xì)胞中的表達(dá)量為1.043±0.341，即Linc00673在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)高于正常胃粘膜細(xì)胞(P<0.05)，本文選擇胃低分化粘液腺癌細(xì)胞株MGC-803進(jìn)行過表達(dá)實驗研究。

2.2 RT-qPCR方法鑒定MGC-803細(xì)胞中Linc00673基因的過表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pLVX-Linc00673和pLVX-NC的MGC-803細(xì)胞，其Linc00673基因的相對表達(dá)量分別為0.999±0.019和200.096± 54.527，即后者Linc00673的表達(dá)比pLVX-NC組增加了200倍(P<0.01)。表明成功建立穩(wěn)定過表達(dá)Linc00673的MGC-803細(xì)胞系。

2.3 Linc00673過表達(dá)促進(jìn)MGC-803細(xì)胞生長

如表2所示，Linc00673過表達(dá)的MGC-803 細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體pLVX-NC細(xì)胞相比，細(xì)胞增殖速度加快，細(xì)胞生長第3、4、5日，pLVX-Linc00673組OD492均高于pLVX-NC組(P<0.05)。

Tab. 2 MTT assay was performed to assess cell viability of MGC-803 cells

2.4 Linc00673過表達(dá)促進(jìn)MGC-803細(xì)胞克隆增殖

克隆形成實驗結(jié)果顯示，在分別接種200和500個細(xì)胞培養(yǎng)18 d后，轉(zhuǎn)染空載體pLVX-NC組細(xì)胞的克隆數(shù)分別為73.33±12.67和190.67±26.16，而轉(zhuǎn)染pLVX-Linc00673組分別形成127.00±24.33和338.67±38.14細(xì)胞克隆，二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，圖1)。

Fig. 1 Overexpression of Linc00673 promoted cell proliferation Cell colony formation assay was performed to assess cell proliferation after transfection with pLVX-NC and pLVX-Linc00673 in MGC-803 cells

2.5 Linc00673過表達(dá)對MGC-803細(xì)胞周期與凋亡的影響

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，pLVX-Linc00673組G0/G1期、S期、G2/M期占比分別為67.52%±1.63%、28.87%±0.30%和3.62%±1.72%；pLVX-NC組G0/G1期、S期、G2/M期占比分別為69.72%± 2.88%和25.82%±1.41%和4.46%±1.54%。兩組間比較S期占比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2A )。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，pLVX-Linc00673組細(xì)胞早期凋亡率(LR)和總凋亡率(LR+UR)分別為 0.52%±0.02%和4.09%±0.36%，而對照組分別為 3.90%±0.39%和5.52%±0.29%，即Linc00673過表達(dá)的胃癌細(xì)胞早期凋亡和總凋亡率均低于對照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2B)。

2.6 Linc00673過表達(dá)對細(xì)胞周期調(diào)控基因表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，Linc00673過表達(dá)使MGC-803細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因CCNG2和p19的表達(dá)量降低，而CDK1的表達(dá)量顯著增高，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，表3)

Fig. 2 The effects of Linc00673 overxpression on MGC-803 cell cycle and apoptosis

Tab. 3 Overexpression of Linc00673 affected the expressions of cell cycle regulators in MGC-803 cells

2.7 Linc00673過表達(dá)影響細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制

Western blot方法在蛋白水平檢測各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵分子pAkt及其下游靶因子NF-κB和Bcl-2蛋白的表達(dá)，同時還檢測細(xì)胞增殖相關(guān)因子β-catenin和EZH2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，過表達(dá)Linc00673的細(xì)胞中上述因子的表達(dá)量均明顯增高(P<0.01,圖3，表4)。

Fig. 3 The expressions of PI3K/Akt signaling pathway-related molecules were detected by Western blot in cells of each group

Tab. 4 Effects of Linc00673 overexpression on PI3K/Akt signal pathway

3 討論

胃癌是全球常見癌癥之一，給患者帶來極大困擾。多年來，學(xué)者們一直致力于對該病發(fā)病機(jī)制、診療方面進(jìn)行研究[8，9]，近年來LncRNA在胃癌中的作用逐漸引起關(guān)注，Linc00673定位于人染色體17q24.3，最初被證實為胰腺癌易感基因，具有抑癌基因的作用[10]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Linc00673在肺癌、乳腺癌等多種人類腫瘤中表達(dá)增高，屬于癌基因，細(xì)胞水平實驗證實其過表達(dá)可促進(jìn)肺癌、肝癌、乳腺癌以及甲狀腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[11-15]，本課題組前期研究顯示，Linc00673在胃癌患者血清中的表達(dá)明顯高于正常人，但其過表達(dá)對胃癌細(xì)胞的調(diào)控作用及相關(guān)分子機(jī)制卻鮮有報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，Linc00673在MGC-803、BGC-823以及AGS等多種胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)量均顯著高于正常胃粘膜細(xì)胞，因此推測Linc00673的異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生和發(fā)展可能存在相關(guān)性。進(jìn)而通過細(xì)胞水平實驗證實，胃癌細(xì)胞MGC-803中過表達(dá)Linc00673導(dǎo)致細(xì)胞生長和克隆增殖加快；流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，MGC-803細(xì)胞過表達(dá)Linc00673產(chǎn)生S期比例增高、細(xì)胞早期凋亡及總凋亡比率降低等生物學(xué)改變，上述結(jié)果提示其在GC的發(fā)生發(fā)展過程中起到一定的致癌、促癌作用。

多種LincRNA通過PI3K/Akt信號通路途徑發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控作用，如沉默STXBP5-AS1和Linc00673基因均可抑制該通路，進(jìn)而影響GC、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移等一系列生物學(xué)行為[16，17]。為了探討Linc00673過表達(dá)影響MGC-803細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)制，本研究在蛋白水平對PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵分子Akt及其下游靶標(biāo)NF-κB和Bcl-2進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，過表達(dá)Linc00673的細(xì)胞中不僅PI3K下游分子磷酸化Akt(pAkt)表達(dá)增高，而且NF-κB和Bcl-2的表達(dá)量亦顯著增高，NF-κB蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖，而Bcl-2則是細(xì)胞凋亡抑制蛋白，這些蛋白表達(dá)增加將導(dǎo)致PI3K/Akt信號通路活性增強(qiáng)。

細(xì)胞周期進(jìn)程有一系列正負(fù)性調(diào)節(jié)因素，如Cyclin 家族中的CDKs 起正性調(diào)節(jié)作用，而 CCNG2 、p19則起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，過表達(dá)Linc00673后，胃癌細(xì)胞上述細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)均發(fā)生了變化。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Linc00673過表達(dá)導(dǎo)致β-catenin和EZH2蛋白表達(dá)量也顯著上調(diào)，二者均與細(xì)胞增殖相關(guān)，其中EZH2還與細(xì)胞的運(yùn)動遷移相關(guān)。因此，Linc00673過表達(dá)可能通過PI3K/Akt信號通路影響細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

值得一提的是，本研究顯示Linc00673在GC中表達(dá)較高，也有報道持其他觀點，此外，β-catenin是Wnt信號通路的關(guān)鍵分子，多種癌基因、抑癌基因以及LincRNA可通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如LincRNA CASC11可通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)宮頸癌的遷移和侵襲[18]，最近有文獻(xiàn)報道Linc00673通過該信號通路促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)程[19]。細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，信號通路之間亦存在著相互調(diào)節(jié)和關(guān)聯(lián)，Linc00673是否可能也通過其他信號通路對GC的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行調(diào)控，其機(jī)制如何？尚需進(jìn)一步的研究證實。

綜上所述，LincRNA 00673在GC中表達(dá)較高，且其過表達(dá)可通過PI3K/Akt信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，可能是GC患者的分子診斷中的生物標(biāo)志物和治療靶點。