張 媛，盛 蕾，劉小瑋，韋 娟，劉秀娟，張念云，王子藝

(1.南京體育學院運動健康學院，江蘇 南京 210014；2.上海交通大學系統(tǒng)生物醫(yī)學研究院運動轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心，上海 200240；3.無錫惠山康復醫(yī)院，江蘇 無錫 214100)

我國肥胖人口已位居世界首位[1]。不合理飲食習慣(膳食結(jié)構(gòu))和不良生活方式(缺乏運動)是導致個體出現(xiàn)高血壓、高血糖、高血脂和肥胖等疾病的危險因素。肥胖個體由于長期攝入熱量過剩，脂肪合成過多并超過肝細胞的負荷能力，肝內(nèi)脂肪的分解利用出現(xiàn)障礙，導致肝臟發(fā)生脂質(zhì)沉積[2]。成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)是具有多種代謝功能的成纖維細胞生長因子家族中的一員，在調(diào)節(jié)碳水化合物和脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用[3]，多項研究表明，F(xiàn)GF21可直接調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減少肝臟脂質(zhì)積累，被認為是治療糖尿病、脂肪肝等代謝并發(fā)癥的一個新靶點。諸多研究顯示：不同運動方式可介導肝臟適應性改變，阻止體內(nèi)脂肪過量累積，明顯改善肝臟脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象[1,4,5]。FGF21在運動改善肝臟脂肪代謝的過程中發(fā)揮何種作用目前尚不清楚，因此，本研究采用持續(xù)性運動(continuous exercise training,CT)和高強度間歇運動訓練(high-intensity interval exercise training,HIIT)兩種運動方式，探討FGF21參與運動調(diào)節(jié)正常、肥胖大鼠肝臟脂肪代謝的作用機制，為運動防治慢病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件

SPF級4周齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只，購買于上海斯萊克實驗動物有限公司。所有大鼠在室溫20℃±5℃，相對濕度50%～60%條件下分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。普通膳食飼料購買于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖中心，高脂飼料購自Research Diets公司。

1.2 實驗分組與肥胖造模

所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為兩組，普通飼料喂養(yǎng)組(30只)和高脂飼料喂養(yǎng)組(30只)。高脂飼料采用Research Diets 公司45%高脂飼料(貨號：D12451)，8周喂養(yǎng)后，以空腹條件下高脂飼料喂養(yǎng)大鼠平均體重超過普通飼料喂養(yǎng)大鼠平均體重20%時為大鼠肥胖造模成功[6]。造模成功后，將普通飼料喂養(yǎng)的正常鼠和高脂飼料喂養(yǎng)的肥胖大鼠隨機分為正常安靜組(LC)、正常高強度間歇運動訓練組(LHI)、正常持續(xù)性運動訓練組(LCT)、肥胖安靜組(OC)、肥胖高強度間歇運動訓練組(OHI)及肥胖持續(xù)性運動訓練組(OCT)，每組10只，肥胖大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)過程中及時記錄大鼠進食、飲水及生長情況，每周固定時間稱測體重并記錄。

1.3 運動訓練方案

運動訓練組大鼠進行為期8周負重游泳運動訓練干預，玻璃泳池寬0.5 m、高0.6 m，水溫31℃±1℃，每周訓練5次，負重游泳采用大鼠尾部負重，按照標準稱取一定重量金屬片裝在氣球中系于尾部。CT組每天訓練1次，每次30～60 min，HIIT組前4周每天訓練5組，每組1 min，后4周每天訓練14組，每組20 s，具體方案詳見表1[7]。5-6周HIIT組負重超過體重10%，運動強度大，持續(xù)時間短，大鼠能夠完成訓練方案。游泳過程中，若大鼠出現(xiàn)運動協(xié)調(diào)性下降，反復下沉時，即刻撈出休息30 s，若大鼠在游泳過程中漂浮于水面不積極游動，則進行適當驅(qū)趕，以保證其運動質(zhì)量。運動干預過程中，每天觀察大鼠運動能力，恢復狀況，檢查身體是否帶傷并做及時記錄。

Tab. 1 High intensity interval training and continuous training protocol

1.4 實驗標本取樣

8周運動訓練干預結(jié)束，各組大鼠禁食24 h后按30 mg/kg體重腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈取血，裝入采血管靜置30 min后3 000 r/min離心5 min，上清即為血清，吸取血清轉(zhuǎn)至凍存管-80℃凍存。斷頭處死，隨后取新鮮肝臟放至生理鹽水中潤洗后稱重，小心取肝組織，包裹OCT置于液氮速凍制作冰凍切片，剩余肝臟組織凍存管分裝立即置于液氮速凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待后續(xù)Western blot檢測。

1.5 HE與油紅O染色檢測肝細胞形態(tài)及脂質(zhì)含量

HE染色：1)取新鮮肝臟組織4%多聚甲醛固定并包埋，制作石蠟切片；2)切片下行梯度乙醇脫蠟，蘇木精與伊紅染色，樹膠封片；3)鏡下采集視野。油紅O染色：1)新鮮肝臟組織OCT包裹后制作冰凍切片；2)切片入油紅染液浸染，75%酒精稍分化，蒸餾水洗；3)蘇木精復染,鹽酸酒精快速分化1 s，蒸餾水洗；4)氨水水溶液返藍,蒸餾水洗；5)甘油明膠封片,顯微鏡鏡檢。圖像采集分析,其中脂滴呈橘紅色至鮮紅色，細胞質(zhì)為紫色，細胞核藍色。

1.6 采用GPO-PAP法測定肝臟TG含量

各組大鼠取定量肝臟組織充分勻漿，無水乙醇提取勻漿介質(zhì)，酶標儀測定吸光(OD)值，代入公式計算。

1.7 血清炎癥因子、FGF21及肝臟脂代謝酶含量檢測

采用ELISA法檢測血清MCP-1、IL-1β、TNF-α及FGF21含量，檢測肝臟組織LPL、FAT/CD36、CPT-1α、β-HAD酶含量。

1.8 Western blot法檢測肝臟組織FGF21蛋白含量

1)肝臟組織蛋白提??；2)SDS-PAGE凝膠電泳配膠；3)上樣；4)電泳；5)100 mv恒壓轉(zhuǎn)膜；6)5%脫脂奶粉封閉；7)4℃孵育一抗FGF21(1∶1 000，美國Abcam公司)、GAPDH(1∶5 000，美國proteintech公司)過夜；8)洗膜；9)二抗室溫孵育60 min；10)洗膜；11)凝膠成像；12)Image Lab Software 5.2分析成像結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重變化

與正常大鼠相比，肥胖大鼠體重在8周干預期內(nèi)均顯著增高。8周HIIT和CT干預后，與LC組相比，LHI、LCT組體重顯著降低(P<0.05)。與OC組比較，OHI、OCT組體重顯著降低(P<0.01)，其中HIIT組體重降低幅度更大(表2)。

Tab. 2 Changes of body weight in rats ( g, n=10)

2.2 各組大鼠血清炎癥因子含量

肝指數(shù)結(jié)果顯示，與LC組相比，OC組肝指數(shù)顯著增高(P<0.05)，OHI與OCT組肝指數(shù)在運動干預后顯著降低(P<0.05)。與正常大鼠相比，肥胖大鼠血清中炎癥因子MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量顯著增高，經(jīng)過8周HIIT和CT干預后均顯著降低(P<0.05)，而8周運動訓練干預對正常大鼠血清中MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量無顯著影響(表3)。

2.3 各組大鼠肝臟組織脂質(zhì)含量

肥胖大鼠肝臟組織HE染色較正常大鼠出現(xiàn)明顯脂肪變形，細胞核形態(tài)異常，肝臟甘油三酯(TG)含量顯著增高。油紅染色顯示，肥胖大鼠肝臟組織脂滴面積百分比較正常大鼠顯著增加(P<0.05，圖1，表4)。8周運動訓練干預后，肥胖大鼠肝臟結(jié)構(gòu)和組織學形態(tài)發(fā)生明顯改善，TG含量及油紅染色結(jié)果表明HIIT運動方式干預效果更加顯著，其中肝組織TG含量LHI組與LC組相比下降35.8%，OHI組與OC組相比下降21.8%(表4)。

Tab. 3 The serum levels of MCP-1,IL-1β and TNF-α in rats of each group

Fig. 1 Oil red O staining of liver tissues in rats of each group(×400)

Tab. 4 Changes of liver Triglyceride content and fat droplet area by Oil red O staining in rats of each group n=8)

2.4 各組大鼠肝臟脂代謝酶含量

肥胖大鼠肝臟LPL、FAT/CD36酶含量較正常大鼠無顯著變化，CT干預可提高正常、肥胖大鼠LPL、FAT/CD36酶含量。8周HIIT干預使正常、肥胖大鼠肝臟組織CPT-1α、β-HAD酶含量均顯著增高，而CT干預對其調(diào)節(jié)無顯著影響(表5)。

Tab. 5 Changes of liver lipid metabolic enzymes activity in rats of each group (U/g protein，

2.5 各組大鼠血清與肝臟FGF21水平

與正常大鼠相比，肥胖大鼠血清FGF21水平顯著增高(表6)，肝臟FGF21蛋白含量顯著下降(圖2，表6)，8周運動訓練干預使正常、肥胖大鼠血清、肝臟FGF21水平均增高，其中CT對肝臟FGF21蛋白含量的影響比HIIT顯著(表6)。

Fig. 2 FGF21 relative protein amount changes in liver tissue of each group

Tab. 6 Changes of serum FGF21 level and liver FGF21 protein content in rats of each group n=8)

3 討論

眾所周知運動訓練是降低肥胖個體體重的有效方式之一。持續(xù)性訓練(CT)是較傳統(tǒng)的運動訓練方式，其可改變身體成分，提高心肺功能，降低血脂及胰島素抵抗水平[8]，然而，近些年高強度間歇訓練(HIIT)逐漸備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，與CT相比，HIIT在代謝、心血管功能改善方面效果更佳，6周間歇性運動對肥胖大鼠體成分產(chǎn)生了良好的干預效果，且短時間高頻率間歇性運動效果可能更好[9-11]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)CT對正常大鼠體重的影響較為顯著，而HIIT對降低肥胖大鼠體重的效果更加明顯。

研究證實超重和肥胖均是一種促炎癥狀態(tài)[12]：Selvaraju等人就正常體重和超重/肥胖兒童唾液肥胖標志物的水平與肥胖的關(guān)系以及這些標志物之間的相互關(guān)系進行研究，發(fā)現(xiàn)超重或肥胖個體唾液中MCP-1、TNF-α、IL-6、CRP水平均顯著增高，而運動訓練可促進骨骼肌分泌IL-6，進而刺激血液循環(huán)中抗炎癥因子IL-1、IL-10增加，抑制促炎細胞因子TNF-α的生成[13]。本研究發(fā)現(xiàn)：與正常大鼠相比肥胖大鼠血清中炎癥因子MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量均顯著增高，說明肥胖與炎癥反應具有較高的相關(guān)性，CT與HIIT均可顯著降低肥胖大鼠血清炎癥因子MCP-1、IL-1β、TNF-α的含量，其中CT的抗炎效果比HIIT更加顯著，同時研究發(fā)現(xiàn)不同運動訓練方式對正常大鼠血清炎癥因子水平無影響，可能由于正常大鼠機體炎癥反應水平較低所致。

高脂膳食顯著增加機體體重的同時常常會伴隨肝臟組織脂質(zhì)代謝異常，致使脂肪異位沉積，誘發(fā)非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)[14,15]。盧漫漫等人研究亦顯示有氧運動可顯著改善肥胖小鼠肝臟脂肪堆積及代謝紊亂[16]。高強度間歇性訓練使肝內(nèi)TG含量下降27%，同時降低機體脂肪含量及血清ALT、ASL水平。本研究發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)CT相比，HIIT對緩解肝臟脂肪沉積的干預效果更佳。研究表明：與正常個體相比，NAFLD患者肝臟和骨骼肌中脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36(FAT/CD36)蛋白表達水平顯著增高[17]。脂蛋白脂肪酶(LPL)與FAT/CD36活性可調(diào)節(jié)循環(huán)脂肪酸代謝水平，本研究得出：與正常大鼠相比，肥胖大鼠LPL、FAT/CD36酶含量顯著增高，CT運動訓練對正常、肥胖大鼠LPL及FAT/CD36酶含量影響較顯著，而HIIT對LPL及FAT/CD36酶含量無顯著影響，可能是由于CT運動強度較低，對脂肪代謝的依賴性更高，因此對循環(huán)脂肪酸代謝水平調(diào)節(jié)作用顯著。另一方面，Astorino等人報道HIIT可顯著提高機體脂肪氧化水平，同時伴隨羥酰輔酶A脫氫酶(β-HAD)、檸檬酸合成酶(CS)含量顯著增高[17]。與其研究結(jié)果一致，本研究同樣發(fā)現(xiàn)HIIT干預顯著影響大鼠肝臟線粒體脂肪氧化酶含量，這與HIIT供能方式有關(guān)，即HIIT更依賴于糖代謝，血液循環(huán)中高水平脂肪酸輸入肝臟較多，肝臟線粒體功能及脂肪酸氧化酶含量的提高促進肝臟脂質(zhì)沉積的進一步改善[18,19]。

FGF21是成纖維細胞生長因子家族中特殊的一員，近期報道，F(xiàn)GF21是首個被發(fā)現(xiàn)的線粒體功能受損標志性因子，線粒體功能抑制將誘導活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)依賴性FGF21表達，從而改善飲食誘導的小鼠肥胖和胰島素抵抗現(xiàn)象[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，肥胖大鼠血清FGF21水平顯著增高，而肝臟組織FGF21蛋白表達水平顯著下降。與安靜組大鼠相比，CT干預后使正常、肥胖大鼠血清、肝臟FGF21水平均顯著增高，而HIIT對正常大鼠血清FGF21水平無顯著影響。提示：不同運動方式均可上調(diào)肝臟FGF21表達水平，肥胖大鼠血清高水平FGF21為體內(nèi)異常糖脂代謝產(chǎn)生的代償效應，CT干預提高肥胖大鼠血清FGF21水平可作用于循環(huán)脂肪酸代謝，可能與提高周圍組織對FGF21的敏感性有關(guān)。

綜上所述，HIIT與CT兩種運動方式均可緩解肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)沉積，但作用特點存在差異：HIIT使線粒體脂肪氧化酶含量顯著提高，促進肝內(nèi)TG氧化分解，對緩解肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)沉積效果顯著，而CT可通過對血清、肝臟組織FGF21水平調(diào)節(jié)，增加參與肝臟攝取脂肪酸相關(guān)酶含量，對緩解肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)沉積效果有限。