陸 敏 陸 舜

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺惡性腫瘤的85%，根據(jù)分期、病理及分子病理分型的不同，患者可選擇性地接受手術(shù)、放療、化療、靶向治療或免疫治療[1,2]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)是NSCLC中重要的驅(qū)動(dòng)基因，其選擇性抑制劑AZD4547已進(jìn)入肺癌的Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段[3,4]。以免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)為代表的免疫治療在NSCLC中應(yīng)用廣泛，除了已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床治療的程序性死亡-1(programmed death-1，PD-1)抗體，淋巴細(xì)胞激活基因-3(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3，又稱CD223)抗體的相關(guān)臨床試驗(yàn)也在多個(gè)瘤種內(nèi)開展[5]。研究顯示，F(xiàn)GFR抑制劑聯(lián)合PD-1抗體在小鼠中重塑腫瘤免疫微環(huán)境，并產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，而FGFR抑制劑與LAG-3抗體聯(lián)用的抗腫瘤效應(yīng)尚不明確[6,7]。本研究旨在探究FGFR抑制劑聯(lián)合LAG-3抗體在小鼠肺癌模型中的抗腫瘤效應(yīng)及其對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的影響，為治療NSCLC提供更多的聯(lián)合用藥依據(jù)。

材料與方法

1.主要材料和試劑：6～8周齡的雄性C57BL/6小鼠(SPF級(jí))購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司，經(jīng)過上海交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)MED-X研究院SPF無菌動(dòng)物房。小鼠LLC細(xì)胞系傳代自本實(shí)驗(yàn)室既往凍存細(xì)胞株。AZD4547(瑞典AstraZeneca公司)、LAG-3抗體(GoInVivoTMPurified anti-mouse LAG-3，美國(guó)Biolegend公司)、對(duì)照IgG抗體[Rabbit (DA1E) mAb IgG XP?Isotype Control，美國(guó)CST公司)、APC-Cy7 anti-mouse CD3ε 500μg(美國(guó)Biolegend公司)、Ms CD8a FITC 53-6.7 500μg(美國(guó)BD Pharmingen公司)、Ms TNF PE MP6-XT22 100μg(美國(guó)BD Pharmingen公司)、Ms IL-2 BV421 JES6-5H4 50μg(美國(guó)BD Pharmingen公司)購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司。LiberaseTMDL Research Grade(瑞士Roche公司)、細(xì)胞濾網(wǎng)(美國(guó)BD FALCON公司)、紅細(xì)胞裂解液(FS1143)購(gòu)自上海復(fù)申生物科技有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮中取出凍存的LLC細(xì)胞，37℃水浴解凍，離心并重懸于完全培養(yǎng)液(DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10% FBS+1%青霉素-鏈霉素雙抗)中，在 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3天換液，密度達(dá)到80%～90%時(shí)傳代，直至接種皮下瘤模型。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液、FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗、PBS等細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑(美國(guó)Invitrogen Gibco公司)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

3.模型構(gòu)建：胰酶消化貼壁培養(yǎng)的LLC細(xì)胞，PBS洗兩遍，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用PBS 重懸至5×106/ml，暫存冰上。在SPF動(dòng)物房?jī)?nèi)，向每只小鼠的左側(cè)脅肋部皮下注射100μl細(xì)胞懸液，每天觀察小鼠狀態(tài)。自接種后第7天起，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)定皮下瘤體積，皮下瘤體積(V)=(L×W2)/2(其中V是腫瘤體積，L是最長(zhǎng)徑長(zhǎng)度，W是最短徑長(zhǎng)度)。

4.藥物干預(yù)：自接種后第7天起，AZD4547以12.5mg/(kg·d)的劑量灌胃給藥，6～8周齡的小鼠約為0.02千克/只，故B組和D組小鼠AZD4547的給藥量為0.25毫克/(只·天)，A組和C組給予空白溶劑(PBS+2%DMSO)。接種皮下瘤后的第7天、第10天、第13天和第16天，LAG-3抗體以100微克/只的劑量腹腔注射給藥，C組和D組給予小鼠LAG-3抗體，A組和B組給予等量對(duì)照 IgG抗體。

5.標(biāo)本處理：至腫瘤接種后第19天，快速頸椎脫臼處死小鼠，完整剝離皮下瘤，取魚肉樣組織分為兩部分，置于冰上暫存。一部分組織放入用鉛筆寫有編號(hào)的包埋盒，4%PFA固定并過夜，次天用水沖洗并用乙醇梯度脫水，轉(zhuǎn)移至通風(fēng)櫥后，二甲苯處理、浸蠟、包埋和切片(厚度10μm)，常溫下保存。另一部分組織用手術(shù)刀切碎，放入含0.1mg/ml Liberase DL(cat 5401160001, 美國(guó)Sigma Aldrich公司)的DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，組織破碎機(jī)處理40min后，將絮狀混合物用直徑70μm的濾網(wǎng)過濾，離心、洗滌、裂紅后，用直徑40μm的濾網(wǎng)再次過濾，離心后重懸為單細(xì)胞懸液，用于流式細(xì)胞術(shù)。

6.免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry, IHC)：將石蠟切片脫蠟、修復(fù)抗原后， 3%過氧化氫溶液孵育、PBS(pH7.4)洗滌，稍甩干水分。用5%BSA按一定比例稀釋好的小鼠CD8一抗(GB13429，武漢賽維爾生物科技有限公司)覆蓋表面，平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，次日洗去一抗，加入二抗(HRP標(biāo)記)稀釋液室溫孵育50min。PBS洗滌3次，滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色，最后復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片。在正置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)下，在10倍目鏡、20倍物鏡下攝片。

7.流式細(xì)胞術(shù)：洗滌單細(xì)胞懸液并用新鮮配置的細(xì)胞因子激活液[Cell Activation Cocktail (with Brefeldin A)，美國(guó)Biolegend公司]重懸細(xì)胞，37℃溫箱內(nèi)孵育6h，結(jié)束后離心、洗滌，與細(xì)胞表面分子抗體混合物冰上避光孵育30min，使用細(xì)胞固定試劑盒(Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set，美國(guó)eBioscience公司)進(jìn)行破膜、透化處理，再與細(xì)胞因子抗體混合物冰上避光孵育50min。洗滌并用PBS(1%EDTA、2%BSA)重懸細(xì)胞至200～300μl，置于冰上暫存，上機(jī)前將EP管里的細(xì)胞吹打均勻，過濾后轉(zhuǎn)移到流式管中，在BD Fortessa流式細(xì)胞儀中檢測(cè)。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用 FlowJo 10.0.7軟件分析流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)。使用Prism 7.0a軟件分析4組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，應(yīng)用非配對(duì)t檢驗(yàn)和Welch′s校正。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除另有說明外，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。所有圖像均具有代表性。

結(jié) 果

1.各組皮下瘤生長(zhǎng)曲線比較：為了對(duì)比抗FGFR、抗LAG-3以及聯(lián)合用藥的抗腫瘤效果，本研究設(shè)置了4個(gè)對(duì)照組，分別是A組(空白對(duì)照)、B組(AZD4547)、C組(LAG-3抗體)和D組(AZD4547聯(lián)合LAG-3抗體)，于皮下瘤接種后第19天瘤體進(jìn)行攝片(圖1A)，同時(shí)繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(圖1B)。結(jié)果顯示，C組對(duì)比A組提示LAG-3抗體僅能輕微抑制腫瘤生長(zhǎng)(P<0.05)；B組對(duì)比A組提示AZD4547可部分抑制腫瘤生長(zhǎng)(P<0.001)；D組對(duì)比A組(P<0.001)、B組(P<0.05)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示AZD4547聯(lián)用LAG-3抗體具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)(圖1)。

圖1 AZD4547聯(lián)合LAG-3抗體在小鼠體內(nèi)顯著抑制皮下瘤生長(zhǎng)A.小鼠皮下瘤接種后第19天，取出瘤體拍攝體積對(duì)比圖；B.皮下瘤的腫瘤生長(zhǎng)曲線(n=5，*P<0.05，**P<0.001)

2.各組CD8抗體IHC染色比較：新鮮皮下瘤組織經(jīng)過石蠟包埋、切片處理，通過CD8抗體染色來反映腫瘤微環(huán)境內(nèi)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平。與A組比較，B組CD8表達(dá)少量增加，C組CD8表達(dá)增加更明顯，而D組CD8表達(dá)增加最為顯著(圖2)。

圖2 AZD4547聯(lián)合LAG-3抗體促進(jìn)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)(HE，×200)A.A組；B.B組；C.C組；D.D組。各組皮下瘤組織的IHC染色圖(n=5)，棕黃色為CD8+T細(xì)胞，用紅色箭頭指出

3.各組CD8、TNF-α、IL-2流式檢測(cè)結(jié)果比較：另一部分新鮮皮下瘤組織處理成單細(xì)胞懸液后用熒光標(biāo)記的抗體染色，用于反映腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫特征。結(jié)果顯示，與A組比較，B組的CD8、TNF-α、IL-2表達(dá)僅為輕度升高(P<0.05)，C組的CD8、TNF-α、IL-2表達(dá)升高更為明顯(P<0.01)，提示AZD4547和LAG-3抗體對(duì)于免疫微環(huán)境具有不同程度的抗腫瘤效應(yīng)；而D組CD8、TNF-α、IL-2的表達(dá)水平較C組輕度升高(P<0.05)、較B組升高更為明顯(P<0.01)，提示兩藥聯(lián)用的抗腫瘤免疫激活作用較單獨(dú)給藥更強(qiáng)(圖3)。

圖3 聯(lián)合用藥顯著提高CD8+T細(xì)胞、TNF-α和IL-2表達(dá)水平A. CD3+細(xì)胞群中CD8+的百分比；B. CD8+細(xì)胞群中TNF-α+的百分比；C.CD8+細(xì)胞群中IL-2+的百分比。將皮下瘤消化為單細(xì)胞懸液并進(jìn)行流式染色分析，該圖顯示了CD8+T細(xì)胞的特征(n=5，*P<0.05，**P<0.01，*** P<0.001)

討 論

既往研究顯示，F(xiàn)GFR抑制劑在多種實(shí)體瘤的動(dòng)物模型中展示出了對(duì)腫瘤免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，包括單藥或聯(lián)合免疫治療對(duì)CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的激活或抑制效應(yīng)[6,8～10]。在原發(fā)性肺腺癌的基因工程小鼠模型中，F(xiàn)GFR抑制劑(厄達(dá)替尼)聯(lián)合應(yīng)用小鼠PD-1抗體后，T淋巴細(xì)胞的克隆多樣性增加和抗腫瘤免疫反應(yīng)增強(qiáng)，提示FGFR抑制劑與PD-1抗體對(duì)于NSCLC具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，但FGFR抑制劑聯(lián)合其他類型免疫治療的研究尚無報(bào)道[6]。

LAG-3主要表達(dá)于耗竭的CD4+和CD8+腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞，其表達(dá)水平升高與各類型腫瘤的疾病進(jìn)展、不良預(yù)后相關(guān)，因此LAG-3是一類具有治療價(jià)值的免疫檢查點(diǎn)，目前已研發(fā)出十余種LAG-3阻斷藥物[5,11,12]。已報(bào)道的兩項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床研究顯示，抗LAG-3聯(lián)合抗PD-1治療在多種實(shí)體瘤中耐受性良好，在部分患者中展現(xiàn)出持續(xù)臨床反應(yīng)和免疫特征調(diào)節(jié)作用[13,14]。然而，LAG-3的分子調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能仍有待進(jìn)一步探究，該分子通路是否與其他腫瘤調(diào)控通路交互作用尚未明確，同時(shí)缺乏與其他類型靶向或免疫藥物聯(lián)用的方案設(shè)計(jì)。

基于以上現(xiàn)狀，本研究首先用LL2小鼠NSCLC細(xì)胞系構(gòu)建了同源性的小鼠皮下瘤模型，通過AZD4547和LAG-3抗體的給藥與否將小鼠分為4組，對(duì)比不同給藥方式下腫瘤直徑的差異；同時(shí)取出皮下瘤進(jìn)行腫瘤組織內(nèi)CD8+T細(xì)胞的數(shù)量、活性的檢測(cè)，以評(píng)估藥物對(duì)于腫瘤免疫微環(huán)境的影響。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AZD4547聯(lián)合LAG-3抗體在小鼠肺癌模型中展示出了協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，增加了CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)，提高了CD8+T細(xì)胞中激活性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，這提示同時(shí)抑制FGFR和LAG-3是治療NSCLC的一個(gè)潛在用藥組合。

在目前的晚期NSCLC治療手段中，靶向治療和ICIs是繼傳統(tǒng)化療藥物以后最主要的抗腫瘤藥物類型，前者通過阻斷細(xì)胞生存相關(guān)的信號(hào)通路來抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而后者則通過激活CD8+T細(xì)胞、自然殺傷T淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)[15,16]。靶向藥物面臨著響應(yīng)期短的困境，而免疫治療的抗腫瘤反應(yīng)具有持續(xù)性激活的特點(diǎn)，二者聯(lián)合應(yīng)用可能提高整體藥物響應(yīng)率[2,17]。多項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)探索了“靶向+免疫”模式的療效和安全性，其中厄洛替尼聯(lián)合納武利尤單抗、吉非替尼聯(lián)合度伐利尤單抗在FGFR突變的NSCLC 患者中展示出了可接受的安全性并使部分患者獲益[18,19]。而本研究通過在小鼠NSCLC模型中嘗試其他靶點(diǎn)的聯(lián)合治療，為更多患者提供了潛在的用藥方案，如攜帶FGFR擴(kuò)增或染色體易位、高表達(dá)LAG-3以及對(duì)PD-1抗體產(chǎn)生耐藥的患者，以及存在其他未知敏感突變的患者。

本研究也存在一些不足：①未進(jìn)行FGFR與LAG-3信號(hào)通路相關(guān)性的細(xì)胞機(jī)制研究；②未能采用證據(jù)等級(jí)更高的原位瘤模型、自發(fā)性肺癌模型、人源性模型；③未探究?jī)伤幝?lián)用的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物[6,12,20]。綜上所述，本研究表明，F(xiàn)GFR抑制劑與LAG-3抗體聯(lián)合用藥在小鼠皮下瘤中抑制癌細(xì)胞增殖并激活CD8+T細(xì)胞，具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。