董孝杰 陸嘉惠 陶雨晨

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes, MDS)是一種血液系統(tǒng)髓系惡性腫瘤，其特征是造血干細胞克隆性增殖、反復(fù)遺傳異常、骨髓增生異常、造血功能低下、外周血細胞減少以及向急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)轉(zhuǎn)化為特征的異質(zhì)性髓系腫瘤性疾病[1]。約80%的MDS患者可以檢測出至少1種類型的基因突變，這些基因是MDS發(fā)病機制的核心，其主要包括RNA剪接基因、DNA甲基化基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、DNA修復(fù)基因、染色質(zhì)修飾基因和黏蛋白復(fù)合物等[2]。

剪接體基因是MDS患者常見的突變靶點之一，這些突變在50%～60%的MDS患者中發(fā)生，常見的突變基因有U2AF1、SF3B1、SRSF2和ZRSR2等[2]。剪接機制被認(rèn)為是產(chǎn)生成熟mRNA分子的必要條件，現(xiàn)也被廣泛理解為一種共轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機制，除了能改變基因產(chǎn)物功能外，對基因的表達和調(diào)節(jié)也至關(guān)重要[3]。U2AF1突變即為剪接體突變中的一種，約11%的MDS病例中發(fā)現(xiàn)有U2AF1突變，且U2AF1突變常與預(yù)后不良相關(guān)[4,5]。近年來有研究還表明，亞洲人MDS患者U2AF1的突變發(fā)生頻率為13.25%左右，約為西方MDS發(fā)病人群的2倍[6]。

U2AF1即U2小核RNA輔助因子1，是U2AF異二聚體的一個小亞單位，位于21q22.3處，它能夠編碼U2前體mRNA剪接復(fù)合物的輔助因子，該因子識別并結(jié)合內(nèi)含子3′端的AG二核苷酸并激活剪接復(fù)合物[7]。U2AF1突變導(dǎo)致RNA剪接過程的改變，并發(fā)生跳躍剪接，在U2AF1中已經(jīng)報道了11種不同的突變體，包括9種錯義突變體(導(dǎo)致A26V、S34F/Y、R35L、R156H/Q、Q157P/R或G213A替換)和兩種移碼突變體(影響密碼子Q157或E159)，其中S34和Q157是最常見的突變殘基[7,8]。

一、MDS中的U2AF1突變

U2AF1突變會對MDS患者的造血功能產(chǎn)生影響，F(xiàn)ei等[9]將U2AF1 S34F突變通過Cre重組酶的作用組裝在內(nèi)源性U2AF1位點并建立基因工程小鼠模型，研究結(jié)果表明，通過激活這些小鼠的Cre重組酶產(chǎn)生U2AF1 S34F突變后，小鼠細胞的前體mRNA發(fā)生異常剪接，且U2AF1 S34F突變小鼠出現(xiàn)造血受損及多系細胞減少和發(fā)育不良，這與人類MDS的特征一致。Shirai等[10]的研究也證實了U2AF1 S34F突變轉(zhuǎn)基因小鼠的造血細胞系會發(fā)生改變，小鼠的B淋巴細胞和單核細胞減少,且U2AF1 S34F突變表達影響RNA加工相關(guān)基因、翻譯過程或核糖體基因和MDS/AML中反復(fù)突變的基因，這些結(jié)果都表明U2AF1 S34F突變誘導(dǎo)的選擇性剪接通過改變下游基因亞型的表達改變MDS患者的造血，導(dǎo)致MDS患者造血異常。

二、U2AF1突變的作用機制

1.免疫途徑激活和炎性反應(yīng)發(fā)生：先天免疫途徑在調(diào)節(jié)造血中起重要作用，先天免疫途徑信號異常會導(dǎo)致MDS中的造血失調(diào)和發(fā)育不良，而炎癥相關(guān)途徑失調(diào)與MDS的克隆性造血及造血缺陷有關(guān)[11]。U2AF1突變會激活免疫途徑和炎性反應(yīng)的發(fā)生，最終導(dǎo)致MDS疾病進展。

(1)U2AF1突變介導(dǎo)IRAK4-L的表達：炎癥和免疫基因的選擇性剪接亞型常常與MDS中的致癌信號相關(guān)。白細胞介素-1受體相關(guān)激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4, IRAK4)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，介導(dǎo)Toll樣受體(TLR)超家族下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IRAK4是MDS/AML中占主導(dǎo)地位的選擇性剪接亞型，對白血病細胞的功能至關(guān)重要，在MDS/AML中經(jīng)歷RNA亞型轉(zhuǎn)換的炎癥和免疫途徑基因中，IRAK4的亞型表達變化最為顯著，而IRAK4的亞型能夠編碼一個較長的蛋白質(zhì)，即IRAK4-L，突變型U2AF1剪接體能夠直接介導(dǎo)IRAK4-L的表達，IRAK4-L與MyD88結(jié)合后形成myddosome復(fù)合物，促使NF-κB和MAPK的最大激活，最終導(dǎo)致免疫途徑激活和炎癥的發(fā)生[13]。

(2)U2AF1突變激活并上調(diào)FOXO3a：叉頭框蛋白O3a(forkhead box protein O3a, FOXO3a)在惡性腫瘤進展中與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)密切相關(guān)[14～16]。近年來研究表明，U2AF1 S34F突變通過抑制PI3K/Akt信號通路，并伴隨細胞周期調(diào)節(jié)因子p21Cip1和p27Kip1的反式激活，從而上調(diào)FOXO3a，促進Bim的轉(zhuǎn)錄活性以及降低c-Myc基因的表達，調(diào)控自噬通量并激活NLRP3炎癥體，最終誘導(dǎo)IL-1β的釋放和caspase-1的產(chǎn)生促使細胞焦亡，導(dǎo)致MDS疾病進展[5]。

2.轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控翻譯：調(diào)控和核糖體生物的變化是髓系疾病的標(biāo)志，而R環(huán)的增加與MDS的發(fā)生有直接關(guān)系，增強的R環(huán)與骨髓源性血祖細胞的增殖受損有關(guān)[17,18]。U2AF1突變則會導(dǎo)致mRNA翻譯水平的升高以及R環(huán)的增加。

(1)U2AF1突變導(dǎo)致mRNA翻譯水平的凈增加：在MDS患者中造血干細胞的mRNA翻譯水平常升高[18]。核磷蛋白1(NPM1)是一種核酸結(jié)合蛋白，參與核糖體RNA(rRNA)的加工和核質(zhì)轉(zhuǎn)運，是U2AF1 S34F突變的最高翻譯上調(diào)靶點，并且是U2AF1 S34F突變介導(dǎo)致癌變化的下游效應(yīng)器[19]。研究表明，U2AF1 S34F突變能夠改變翻譯起始因子的水平，導(dǎo)致參與翻譯起始蛋白質(zhì)信息編碼的翻譯效率產(chǎn)生變化，其翻譯起始機制的失調(diào)會導(dǎo)致mRNA翻譯水平的凈增加，而U2AF1 S34F突變細胞需要NPM1和IPO7等核糖體合成因子才能增殖，NPM1的缺失會損害U2AF1 S34F突變細胞中的rRNA合成或加工，導(dǎo)致細胞增殖減緩并使其在S期積累，故表明U2AF1 S34F突變維持高度增殖狀態(tài)依賴核糖體的合成，證明U2AF1 S34F突變對NPM1的體外“非癌基因依賴性”[20]。

(2)U2AF1突變誘導(dǎo)R環(huán)的積累：R環(huán)是由DNA:RNA雜交和移位的單鏈DNA(ssDNA)組成的轉(zhuǎn)錄中間產(chǎn)物，已知它們通過暴露單鏈DNA和阻斷復(fù)制叉進程，導(dǎo)致復(fù)制應(yīng)激和DNA損傷，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定[21]。MDS相關(guān)的編碼剪接體(如SF3B1、U2AF1、SRSF2等)突變會誘導(dǎo)R環(huán)的形成增加，這導(dǎo)致復(fù)制應(yīng)激增加和Rad3相關(guān)蛋白(ataxia telangiectasia and rad3-related, ATR)信號通路的相關(guān)激活，剪接體突變細胞依賴ATR的功能，以保持其基因組的完整性，而ATR的藥理學(xué)抑制通過增加DNA損傷優(yōu)先殺死剪接體突變細胞，進一步表明在MDS患者的剪接體突變細胞中，剪接調(diào)節(jié)劑能夠抑制ATR，并選擇性地靶向作用于剪接體突變細胞，同時保留健康的非突變造血細胞[22,23]。另一項研究也表明，U2AF1 S34F突變體表達的RNA剪接擾亂會導(dǎo)致R環(huán)的積累，并引發(fā)ATR反應(yīng)，ATR通過抑制DNA損傷促使U2AF1 S34F突變表達細胞的存活，而使用ATR抑制劑(ATRi)會在表達U2AF1 S34F突變體的細胞中誘導(dǎo)DNA損傷，從而優(yōu)先殺死表達U2AF1 S34F突變的細胞，此外，剪接調(diào)節(jié)劑能夠增加R環(huán)水平，使它們對ATRi更加敏感，故單獨使用剪接調(diào)節(jié)劑或ATRi相比，剪接調(diào)節(jié)劑和ATRi組合能夠更有效地使U2AF1 S34F突變細胞的DNA損傷水平顯著升高，細胞凋亡增加，這為剪接體突變所導(dǎo)致的癌癥提供了一種治療策略[24]。

(3)U2AF1突變細胞降低NMD的活性：無義介導(dǎo)的RNA衰變(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是一種RNA監(jiān)督途徑，其能靶向具有提前翻譯終止密碼子(premature-stop codon, PTC)的異常mRNA并將其進行降解。NMD的抑制常伴隨著DNA復(fù)制障礙、DNA損傷和染色體不穩(wěn)定性升高等，近年來研究表明，剪接體基因SF3B1和U2AF1突變的細胞在總體上降低了NMD活性，且與野生型細胞比較，SF3B1和U2AF1突變細胞對NMD抑制更為敏感，而剪接體突變細胞對NMD的抑制可以通過核糖核酸酶H1(RNASEH1)的過度表達得以挽救，核糖核酸酶H1的作用是能夠去除基因組中的R環(huán)[25]。此研究的發(fā)現(xiàn)為治療MDS和剪接體突變的癌癥提出了一種新的合成致死策略。

3.表觀遺傳學(xué)中的剪接體突變：U2AF1突變會導(dǎo)致H2AFY1.1亞型減少，進而使患者造血功能失調(diào)和B淋巴細胞計數(shù)減少，此外近年來研究還發(fā)現(xiàn)，U2AF1突變細胞需要野生型U2AF1等位基因才能存活，這可能成為一種新的治療策略。

(1)U2AF1突變導(dǎo)致H2AFY1.1亞型減少：H2A組蛋白家族成員Y(recombinant H2A histone family,member Y, H2AFY)是一種組蛋白H2A變異基因。H2AFY和絲氨酸/蘇氨酸激酶受體相關(guān)蛋白(STRAP)在人類造血過程中起著重要作用。H2AFY可編碼兩種剪接亞型，為H2AFY1.1和H2AFY1.2(分別稱為macroH2A1.1和macroH2A1.2)。H2AFY和STRAP都是人髓系細胞中U2AF1 S34F突變的關(guān)鍵下游靶基因，而異常剪接的H2AFY和STRAP都是紅細胞生成受損的關(guān)鍵效應(yīng)器，異常剪接的H2AFY也是異常粒單核細胞分化的關(guān)鍵效應(yīng)器。U2AF1 S34F突變誘導(dǎo)STRAP的異常剪接，導(dǎo)致該基因僅在紅系細胞中下調(diào)，并使紅細胞生成受損；而異常剪接的H2AFY，導(dǎo)致紅系和粒單核細胞來源集落中的H2AFY1.1亞型表達減少，當(dāng)細胞在紅系和粒單核細胞條件下培養(yǎng)時，shRNA介導(dǎo)的骨髓祖細胞中H2AFY1.1的表達減少導(dǎo)致細胞凋亡增加和分化減少[26]。此外，MDS患者中常被發(fā)現(xiàn)有B淋巴細胞和前體B淋巴細胞減少[27]。這可能也與H2AFY基因的表達有關(guān)，U2AF1 S34F突變表達誘導(dǎo)的選擇性剪接會導(dǎo)致H2AFY1.1亞型的減少[28]。而H2AFY1.1亞型的減少會降低早期B細胞因子1(EBF1)的表達，EBF1是B淋巴細胞發(fā)育所必需的主要轉(zhuǎn)錄因子，研究表明H2AFY存在于EBF1啟動子以調(diào)節(jié)其表達及其下游靶點，其對正常B淋巴細胞發(fā)育至關(guān)重要，故H2AFY1.1的表達減少導(dǎo)致EBF1的表達降低是致使U2AF1 S34F突變型MDS患者B淋巴細胞減少的主要原因，且H2AFY的選擇性剪接會促進U2AF1 S34F突變表達并誘導(dǎo)體內(nèi)異常造血[29]。

(2)U2AF1突變細胞的存活需要野生型U2AF1等位基因：U2AF1突變總是雜合的，而U2AF1已被認(rèn)定為單倍體必需的癌基因，即具有U2AF1雜合子突變的癌細胞需要保持至少一個野生型 U2AF1等位基因拷貝才能存活[30]。有研究通過U2AF1小鼠模型的建立，證明U2AF1突變的造血細胞需要野生型U2AF1才能存活，且通過改變野生型與突變型U2AF1表達的比率，可以改變小鼠體內(nèi)的造血，這些結(jié)果皆表明在雜合子突變細胞中選擇性地靶向(即減少或增加)野生型U2AF1等位基因可以誘導(dǎo)癌細胞死亡，這為攜帶U2AF1突變的患者提供了一種新的治療思路[31]。

三、U2AF1突變對MDS預(yù)后的影響

多項臨床研究均表明，U2AF1與MDS不良預(yù)后相關(guān)，尤其是在總生存期方面。Wang等[32]回顧性分析234例MDS患者的下一代序列基因突變檢測及臨床資料，進行多變量分析后證實變異等位基因頻率(variant allel frequency, VAF)>40%的U2AF1是具有較短總體生存期(overall surviva, OS)的MDS患者的獨立影響因素。吳凌云等[33]回顧性分析349例MDS患者，研究結(jié)果顯示，U2AF1突變患者具有較高的轉(zhuǎn)白率和較短的總生存時間，且+8核型的MDS患者中U2AF1突變組中位總生存時間明顯短于非突變組。這些研究與另一項Meta分析的結(jié)果相似，即U2AF1突變是新發(fā)MDS患者OS和AML轉(zhuǎn)化的一個獨立且不利的危險因素[34]。Zhu等[5]研究也表明，與未攜帶U2AF1突變的患者比較，攜帶U2AF1突變的患者血紅蛋白含量較低，且與較短的OS顯著相關(guān)。

四、展 望

MDS是一種血液系統(tǒng)髓系惡性腫瘤且可能向AML進展，故對此疾病越來越重視。在MDS患者中，剪接體突變發(fā)生率為50%～60%，而作為剪接體基因之一的U2AF1基因突變，常與不良預(yù)后相關(guān)且突變發(fā)生率高，現(xiàn)已有諸多研究聚焦于此。既往研究表明，其機制主要是U2AF1基因突變導(dǎo)致異常剪接進而影響炎癥、免疫基因和R環(huán)積累，導(dǎo)致MDS疾病進展，而其具體調(diào)節(jié)機制仍不明確。目前已有研究表明，在雜合子突變細胞中選擇性地靶向野生型等位基因可誘導(dǎo)癌細胞死亡，以及剪接調(diào)節(jié)劑在治療存在U2AF1突變的血液腫瘤中也具有可行性，這是攜帶U2AF1突變的MDS患者可能的治療策略，但其具體實施及其他治療手段仍有待于深入研究。