王新天，陳洪建，李曉雯，彭登峰，陳亞淑，鄧乾春

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料加工重點實驗室，油料脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430062）

亞麻籽油是我國主要食用油脂之一，是-亞麻酸的良好來源（約60%）。-亞麻酸作為一種以植物資源為主的-3多不飽和脂肪酸，能夠作為前體在體內(nèi)合成具有更高營養(yǎng)功效的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，具有綠色安全、原料易得、受眾廣泛等突出優(yōu)勢。亞麻籽油不僅含有甘油三酯，還含有游離脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯、磷脂、植物甾醇等具有表面活性的微量成分。這種兩親性微量成分可以吸附到油水界面，當濃度高于其臨界膠束濃度時，由于疏水作用而自發(fā)聚集，在油脂中形成反膠束。這些微量成分形成的反膠束可以在油脂中產(chǎn)生油水界面，影響脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的極性物質(zhì)以及水溶性金屬離子的物理分配，進而影響油脂的物理及氧化穩(wěn)定性。因此，亞麻籽油中內(nèi)源性微量成分形成的反膠束對食用油的穩(wěn)定性及貨架期有重要影響。

生育酚作為一種天然的脂溶性維生素，是植物油中最主要的天然抗氧化劑。但在貯藏過程中生育酚氧化生成具有表面活性的氧化生育酚，它們可以降低油的界面張力，導(dǎo)致氧氣轉(zhuǎn)移到油中，從而促進脂質(zhì)氧化。反膠束可改變化學(xué)反應(yīng)的微環(huán)境，作為有效的納米反應(yīng)器，影響抗氧化劑的抗氧化效應(yīng)，改變植物油體系的穩(wěn)定性。反膠束可以將抗氧化劑、極性氧化產(chǎn)物向油水界面遷移，并影響抗氧化劑的分解以及對金屬離子的還原能力，從而增強/降低抗氧化劑有效性。亞麻籽油中微量成分形成的反膠束以及和生育酚的組合對亞麻籽油熱穩(wěn)定性及氧化穩(wěn)定性的影響還知之甚少。在存在反膠束的天然油脂體系中，對反膠束與抗氧化劑的調(diào)控將直接影響油脂穩(wěn)定性，這為富含-3多不飽和脂肪酸油脂的穩(wěn)態(tài)化控制提供了新的策略與途徑。

為探究亞麻籽油中微量成分形成的反膠束對亞麻籽油體系穩(wěn)定性的影響，通過測量油酸、二酰基甘油（diacyl glycerol，DAG）、1,2-二油?；蚜字?,2-dioleoyl--glycero-3-phosphocholine，DOPC）和-谷甾醇在stripped亞麻籽油（stripped flaxseed oil，SFO）中的臨界膠束濃度，研究其形成反膠束的能力。并進一步研究形成的反膠束對亞麻籽油熱穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性以及對生育酚抗氧化效應(yīng)的影響，為天然油脂體系中微量成分形成的反膠束對油脂穩(wěn)定性以及對抗氧化劑抗氧化效應(yīng)的影響提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DOPC（CAS 4235-95-4，99%） 美國Avanti公司；-谷甾醇（CAS∶ 83-46-5，95%） 上海萌芽生物公司；甘油三酯（medium-chain triacylglycerols，MCT，CAS：538-24-9，96%） 印尼Miglyol公司；油酸（CAS 112-80-1，99%）、DAG（CAS 24529-88-2，97%）、-生育酚（CAS 10191-41-0，97%）、7,7,8,8-四氰基對苯二醌二甲烷（7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane，TCNQ，CAS 1518-16-7，98%）、丙醛（CAS 123-38-6，97%）、正己醛（CAS 66-25-1，98%） 美國Sigma公司；正己烷等有機試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

6980氣相色譜儀 安捷倫（中國）有限公司；LC-6AD液相色譜儀 日本島津公司；DU 800紫外分光光度儀 美國貝克曼庫爾特公司；IKARV10D真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 德國艾卡公司；DSC Q2000差示掃描量熱儀美國TA公司；743氧化誘導(dǎo)儀 瑞士萬通公司。

1.3 方法

1.3.1 SFO的制備

根據(jù)Kiralan等的方法使用柱色譜法制備SFO。將100 g硅膠用總體積為3 L的蒸餾水洗滌3 次，并在125 ℃條件下活化12 h。然后依次用90 g硅膠、22.52 g活性炭和另外90 g硅膠填充色譜柱（內(nèi)徑5.0 cm，高50 cm）。將120 g油溶解在120 mL正己烷中通過該柱，用1 L正己烷洗脫。為了延緩過程中油脂氧化，收集的SFO保存在冰浴中并用鋁箔覆蓋。完成洗脫后，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在37 ℃除去正己烷，在氮氣流下除去微量殘留溶劑，得到SFO，并在－80 ℃貯藏，進行進一步分析。采用氣相色譜儀和液相色譜儀測定SFO中微量成分的含量。

1.3.2 亞麻籽油基本成分測定

酸價、過氧化值、脂肪酸含量分別參照GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》、GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》、GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》的方法測定；生育酚含量按照AOCS Official Method Ce 8-89測定；植物甾醇含量按照黃穎等的方法測定。

1.3.3 臨界膠束濃度測定

采用TCNQ增溶技術(shù)測定亞麻籽油中多種微量成分的臨界膠束濃度。將MCT和SFO（3∶1，/，MCT作為一種不可氧化脂質(zhì)）混合作為植物油體系。以下所述亞麻籽油均指MCT與SFO的混合油。將DOPC、-谷甾醇、油酸、D A G 及其混合物（物質(zhì)的量比3.78∶0.97∶0.43∶2.25）添加到亞麻籽油中，測定范圍為1～1 000 μmol/kg的臨界膠束濃度。該比例旨在模仿商業(yè)精煉油中主要表面活性化合物的比例。將含有表面活性成分的油在室溫下磁力攪拌24 h，然后按1 mg/g加入TCNQ，混合攪拌5 h。以2 000×離心20 min除去過量的TCNQ。使用紫外分光光度計在波長480 nm處測量吸光度。吸光度與表面活性成分濃度對數(shù)圖的拐點即為臨界膠束濃度。

1.3.4 貯藏樣品制備

以低于（10 μmol/kg）和高于（500 μmol/kg）的臨界膠束濃度，將微量成分（DOPC、-谷甾醇、油酸和DAG）的混合物添加到亞麻籽油中。為了研究抗氧化劑活性，在上述樣品中分別添加10 μmol/kg-生育酚。所有樣品在室溫下磁力攪拌24 h，將樣品（1 mL）等分到10 mL頂空樣品瓶中，蓋上PTFE/硅氧烷隔墊的鋁蓋，并在55 ℃避光貯藏。

1.3.5 氧化起始溫度測定

采用差示掃描量熱儀測定油的熱特性。根據(jù)Oomah等的方法，并稍作修改。氮氣流速為100 mL/min，稱取8 mg油樣品放置于鋁盒中，空鋁盒作為參考。將樣品盒與參考鋁盒置于熱量計內(nèi)部，從室溫降低到10 ℃并維持10 min，然后在氧氣存在下（100 mL/min），以2 ℃/min加熱至350 ℃。測定重復(fù)3 次。

1.3.6 氧化誘導(dǎo)時間測定

參考AOCS Method CD12b-92方法，并適當修改。采用氧化誘導(dǎo)儀測定亞麻籽油氧化誘導(dǎo)時間。取3.00 g油樣放置在玻璃反應(yīng)試管中，在110 ℃條件下，向油脂中以恒定速率（20 L/min）通入干燥空氣。測定油脂在達到恒定溫度后的氧化誘導(dǎo)時間。抗氧化系數(shù)按下式計算：

式中：PF為抗氧化系數(shù)；IP’和IP分別為添加和不添加抗氧化劑的油脂的氧化誘導(dǎo)時間/h。

1.3.7 脂質(zhì)氫過氧化物測定

采用紫外分光光度計法對亞麻籽油中氫過氧化物含量進行測定。取油樣（200 μL）與2.8 mL甲醇-丁醇溶液（2∶1，/）混合，再加入15 μL 3.94 mol/L硫氰酸銨和15 μL Fe。Fe是由0.132 mol/L BaCl（0.4 mol/L HCl配制）與0.144 mol/L FeSO等體積混合，取上清液得到。將混合物渦旋，室溫孵育20 min，在波長510 nm處用紫外分光光度計測量吸光度。以異丙苯氫過氧化物為標準物制得標準曲線，測定氫過氧化物含量，單位為mmol/kg。

1.3.8 次級氧化產(chǎn)物丙醛、己醛測定

采用氣相色譜結(jié)合固相微萃取技術(shù)分析植物油體系中丙醛、己醛含量。取1 mL乳液于10 mL頂空瓶中，壓蓋密封。將固相微萃取纖維頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）通過壓蓋膜插入并暴露于頂空瓶上部。55 ℃磁力攪拌，纖維頭充分吸取揮發(fā)性物質(zhì)10 min，將纖維頭轉(zhuǎn)移至氣相色譜進樣口解吸5 min后進行測樣。進樣口溫度240 ℃，分流比1∶5；揮發(fā)性物質(zhì)使用DB-5色譜柱（30 mm×0.32 mm，0.25 μm）進行分離，柱溫箱、進樣口、檢測器溫度分別為40、240 ℃和300 ℃，柱溫箱升溫程序：40 ℃保持6 min，以5 ℃/min升高至60 ℃，最后以30 ℃/min升高至280 ℃并以該溫度保持2 min。分別使用丙醛、正己醛為外標對乳液中的丙醛、己醛含量進行定量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 SFO中微量組分含量

為更準確研究微量成分及其形成的反膠束對油脂穩(wěn)定性以及抗氧化劑活性的影響，首先將市售亞麻籽油經(jīng)硅膠-活性炭-硅膠色譜柱制得SFO，除去本身含有的微量成分以及抗氧化劑。由表1可以看出，亞麻籽油中主要植物甾醇為-谷甾醇（（142.35±0.49）mg/100 g），富含-亞麻酸（54.59%）及油酸（20.64%）。與市售亞麻籽油相比，使用色譜柱法制備的SFO呈無色透明狀，主要脂肪酸組成沒有變化，-谷甾醇、菜油甾醇和環(huán)阿屯醇含量顯著降低，而豆甾醇、燕麥甾醇、極性酚類化合物（磷脂和生育酚）等被完全脫除。

表1 經(jīng)硅膠-活性炭-硅膠色譜柱后亞麻籽油中成分含量變化Table 1 Changes in the composition of flaxseed oil after adsorption on silica gel-activated carbon-silica gel column

2.2 微量組分在亞麻籽油中的臨界膠束濃度

植物油體系中存在微量水時，當表面活性成分達到一定濃度時，會發(fā)生自聚集形成由單層表面活性劑分子穩(wěn)定的納米級水核，表面活性劑的極性基團延伸到水核中，脂肪鏈延伸到脂質(zhì)介質(zhì)中。表面活性分子開始聚集的濃度即為臨界膠束濃度。本研究采用TCNQ增溶技術(shù)測定了各種微量成分在亞麻籽油中的臨界膠束濃度。由圖1可以看出，DOPC的臨界膠束濃度為125 μmol/kg，其值比Kittipongpittaya等在55 ℃測定的數(shù)值（40 μmol/kg）大，可能是因為本研究在室溫下測得，磷脂的臨界膠束濃度隨著溫度的升高而降低。而油酸、-谷甾醇、DAG沒有觀察到典型的臨界膠束濃度拐點，這與相關(guān)文獻結(jié)果一致。盡管油酸，DAG和-谷甾醇能夠集中在油水界面，但它們在本研究使用的濃度下不會形成反膠束。DOPC是亞麻籽油體系形成反膠束的重要組分。將DOPC、油酸、-谷甾醇、DAG四種微量成分按物質(zhì)的量比混合（3.78∶0.97∶0.43∶2.25），測得臨界膠束濃度為129 μmol/kg，與單一DOPC的臨界膠束濃度相差不大。

圖1 室溫下DOPC、油酸、β-谷甾醇、DAG在油脂體系（MCT∶SFO=3∶1）中的臨界膠束濃度Fig.1 Critical micelle concentrations of DOPC,oleic acid,β-sitosterol,and DAG in oil system (MCT:SFO=3:1) at room temperature

2.3 氧化起始溫度與氧化誘導(dǎo)時間

將上述幾種微量成分混合物以低于/高于臨界膠束濃度加入到亞麻籽油中，測定其對亞麻籽油體系穩(wěn)定性的影響及對生育酚抗氧化活性的影響。差式掃描量熱法可在系統(tǒng)控制溫度下，測量物質(zhì)與參比物之間的能量差隨溫度的變化關(guān)系。通過DSC可以確定油脂的氧化起始溫度，氧化起始溫度越高，油脂的穩(wěn)定性越好。油脂的氧化誘導(dǎo)時間是油脂到達氧化加速期之前的時期，常用誘導(dǎo)時間長短衡量植物油脂的抗氧化能力?？寡趸禂?shù)值越高說明抗氧化效應(yīng)越好。由表2可知，與對照組相比，加入少量微量成分以及生育酚對其氧化起始溫度（約132 ℃）以及氧化誘導(dǎo)時間（約0.41 h）沒有顯著影響，抗氧化系數(shù)達到0.9～1.0，說明無抗氧化性也無促氧化性。但當加入量超過臨界膠束濃度，反膠束的形成使油脂的氧化起始溫度從132.86 ℃降低到116.81 ℃，降低了12%。此時生育酚的加入并不能提高油脂的起始氧化溫度（116.81 ℃）。且反膠束使油脂氧化誘導(dǎo)時間從0.42 h降低到0.28 h，降低了33%，抗氧化系數(shù)為0.67，說明具有促氧化效應(yīng)。反膠束的形成使含有生育酚的亞麻籽油體系的抗氧化系數(shù)從0.98降低為0.73，表現(xiàn)出促氧化效應(yīng)，降低了生育酚的抗氧化活性。

表2 不同油脂的氧化起始溫度與氧化誘導(dǎo)時間Table 2 Oxidation initiation temperature and oxidation induction time of different flaxseed oil samples

由氧化起始溫度及氧化誘導(dǎo)時間發(fā)現(xiàn)微量成分的少量加入對油脂穩(wěn)定性以及生育酚的抗氧化活性無顯著影響。添加量超過臨界膠束濃度而形成反膠束后，其能明顯降低油脂熱穩(wěn)定性，并降低生育酚的抗氧化效應(yīng)。

2.4 脂質(zhì)氫過氧化物

脂質(zhì)氧化是導(dǎo)致不良風味和香氣，降低營養(yǎng)價值以及食用油中潛在安全問題的主要因素。純油體系中具有兩親性的微量成分在物理和化學(xué)上都會影響脂質(zhì)的氧化機制。由圖2可以看出，貯藏過程中，反膠束的形成促使亞麻籽油從透明狀逐漸變?yōu)榈S色，形成了共軛化合物，顯示出促氧化活性。其余樣品在整個貯藏期間呈無色透明狀。

圖2 油脂貯藏過程中外觀變化Fig.2 Visual appearance of flaxseed oil during storage

如圖3所示，與對照組相比，10 μmol/kg混合組分（低于臨界膠束濃度）的加入沒有改變脂質(zhì)氫過氧化物形成的滯后期，其含量稍微增加。生育酚的加入能抑制油脂的氧化程度，但添加10 μmol/kg微量成分使生育酚的抑制作用減弱。當微量成分達到500 μmol/kg（超過臨界膠束濃度）時，氫過氧化物濃度在初始階段急速增加，幾乎沒有滯后期。與對照組相比，初級氧化產(chǎn)物生成量增加36%，說明反膠束表現(xiàn)出促氧化的作用。這與之前的研究一致，即由表面活性成分形成的反膠束降低了油脂的氧化穩(wěn)定性。生育酚的添加能抑制油脂氧化，但反膠束的形成使其氧化產(chǎn)物濃度高于對照組，說明反膠束降低了生育酚的抗氧化活性（約33.6%）。這可能是因為反膠束的存在可以降低表面張力，增加氧氣向油中的轉(zhuǎn)移。且在游離脂肪存在的情況下，DOPC反膠束可能通過增加體系中游離脂肪酸的促氧化活性而對脂質(zhì)氧化產(chǎn)生負面影響。此外，DOPC形成的反膠束還可以吸引金屬離子和脂質(zhì)過氧化氫到油水界面處加速脂質(zhì)氧化速率，從而降低油脂的氧化穩(wěn)定性。而反膠束限制了-生育酚對界面的可及性，很難聚集在油水界面，因此其抗氧化活性降低。

圖3 油脂貯藏過程中脂質(zhì)氫過氧化物的形成Fig.3 Lipid hydroperoxide formation in flaxseed oil during storage

2.5 次級氧化產(chǎn)物丙醛、己醛含量測定

如圖4A所示，與對照組相比，10 μmol/kg混合組分（低于臨界膠束濃度）的加入抑制了丙醛的生成，這可能是因為加入的DOPC具有一定的抗氧化作用，抑制初級產(chǎn)物向次級產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，且生育酚的加入使抑制作用進一步增強。然而當添加量達到臨界膠束濃度以上形成反膠束時，其形成丙醛的速率急速增加（含量增加約13%）。在含有生育酚的亞麻籽油中，反膠束的形成使氧化產(chǎn)物濃度顯著增加，與反膠束體系接近，此時生育酚并沒有表現(xiàn)出明顯的抗氧化效果。因初級氧化產(chǎn)物氫過氧化物具有兩親性，聚集在油水界面，被過渡金屬離子催化發(fā)生裂解反應(yīng)，導(dǎo)致丙醛等次級氧化產(chǎn)物的生成。

圖4 油脂貯藏過程中次級氧化產(chǎn)物丙醛（A）、己醛（B）的形成Fig.4 Propionaldehyde (A) and hexanal (B) formation in flaxseed oil during storage

如圖4B所示，與丙醛的生成趨勢相似，與對照組相比，生育酚的加入顯著抑制己醛生成，并且低濃度混合組分（10 μmol/kg，低于臨界膠束濃度）的加入對生育酚的抑制效應(yīng)沒有影響。當濃度達到臨界膠束濃度以上形成反膠束時，己醛含量比對照組顯著增加。在含有生育酚的亞麻籽油中，反膠束的形成亦會顯著增加己醛的生成，表現(xiàn)出促氧化性。

反膠束的促氧化性可能與脂質(zhì)氧化鏈傳播過程存在傳質(zhì)現(xiàn)象有關(guān)，即一個顆粒的氧化產(chǎn)物傳遞到另一個顆粒中導(dǎo)致氧化的傳播。一般水溶性物質(zhì)通過水擴散傳播，脂溶性物質(zhì)只能通過顆粒碰撞-交換-分離來進行氧化傳播，而在膠束存在的情況下，脂溶性物質(zhì)可以通過膠束輔助轉(zhuǎn)移從一個粒子擴散到另一個粒子，這個途徑會比顆粒碰撞-交換-分離途徑轉(zhuǎn)移速率快很多，大大增加了脂溶性物質(zhì)的傳播速率。因此，除了氧化速率增加外，反膠束的存在可能改變了氧化產(chǎn)物的傳遞途徑導(dǎo)致氧化速率大大增加。此外一些氧化產(chǎn)物的累積，例如脂質(zhì)氫過氧化物，具有兩親性，其有可能與添加的微量成分競爭吸附到界面形成混合反膠束，但是其機理與反應(yīng)機制還需進一步深入研究。

3 結(jié)論

測定了油脂中微量成分DOPC、油酸、-谷甾醇、DAG在SFO中的臨界膠束濃度，并研究其形成的反膠束對亞麻籽油體系的穩(wěn)定性以及對生育酚抗氧化活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOPC是形成反膠束的重要組分，其臨界膠束濃度為125 μmol/kg，而油酸、-谷甾醇、DAG在本研究使用的濃度下不會形成反膠束。與對照組相比，低濃度微量成分或生育酚對亞麻籽油體系的熱穩(wěn)定性沒有顯著影響，而微量成分會增加氧化產(chǎn)物濃度，并導(dǎo)致生育酚的抗氧化活性降低。反膠束的形成不僅降低油脂熱穩(wěn)定性及氧化穩(wěn)定性，還降低了生育酚的抗氧化活性。一方面反膠束增加了游離脂肪酸的促氧化活性、將脂質(zhì)氫過氧化物吸引到油水界面處加速脂質(zhì)氧化速率，并限制了-生育酚對界面的可及性，很難聚集在油水界面，因此降低其抗氧化活性。另一方面反膠束還可能改變了脂質(zhì)氧化鏈傳播過程中物質(zhì)的質(zhì)量轉(zhuǎn)移途徑，進而加速脂質(zhì)氧化，其機理與反應(yīng)機制還需進一步深入研究。因此，控制反膠束的形成以及調(diào)控反膠束與抗氧化劑的組合對油脂穩(wěn)定性具有重要意義，此研究為存在反膠束的天然油脂的穩(wěn)定性調(diào)控提供了新思路。