王岱，韓越眉,3，桂亞，虞星彤,3，瓦云超,3，顧瑞霞,3，張臣臣,3,4*

1(揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州，225127)2(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225127) 3(揚(yáng)州大學(xué) 益生菌與乳品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州，225127) 4(揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司 江蘇省乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，江蘇 揚(yáng)州，225004)

益生菌具有維持腸道菌群穩(wěn)定、調(diào)節(jié)免疫、產(chǎn)生有益物質(zhì)、抑制病原微生物等益生作用[1]。其中乳酸菌及其發(fā)酵乳制品已成為目前最受歡迎的功能食品[2]，近年來在國內(nèi)亦受到越來越多的關(guān)注。

活性是乳酸菌在食品中進(jìn)行發(fā)酵和在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的必要基礎(chǔ)。研究人員認(rèn)為食品中益生菌的活菌數(shù)達(dá)到106～107CFU/g，日攝入量達(dá)到109CFU方能發(fā)揮較好的益生功能[3]。然而，乳酸菌在生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸和消費(fèi)過程中，會遭受來自于工藝流程、宿主、及自身代謝所產(chǎn)生的多種脅迫，產(chǎn)生嚴(yán)重的活性損失[4]。因此，如何提高乳酸菌的脅迫耐受能力是重要的研究課題。

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)hsryfm 1301分離自中國巴馬的長壽老人，具有顯著功能特性[5]。該菌株對熱脅迫和氧化脅迫存在明顯的交叉適應(yīng)[6]。將鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301分別在熱脅迫或氧化脅迫條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組-表型匹配，發(fā)現(xiàn)多達(dá)32個寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)、肽酶和氨基酸代謝等氮代謝相關(guān)基因受到下調(diào)；進(jìn)一步研究顯示，低氮源環(huán)境下培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌具有更強(qiáng)的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力[7]。降低培養(yǎng)環(huán)境中的氮源濃度有助于鼠李糖乳桿菌耐受生產(chǎn)過程(如噴霧干燥)中的熱脅迫和氧化脅迫。另一方面，氨基酸在乳酸菌的酸脅迫、膽鹽脅迫和滲透壓脅迫等的耐受中發(fā)揮積極作用[4, 8]。因此，氮源濃度的降低是否會影響菌株對其他脅迫的耐受尚未可知。

氮源作為所有培養(yǎng)基都不可或缺的成分，其含量對脅迫耐受的影響不容忽視。本文主要探究鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在低氮源環(huán)境下的脅迫耐受變化，以期提高菌株在生產(chǎn)中的脅迫耐受能力。

1 材料與方法

1.1 菌株

鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301于2013年分離自廣西省巴馬瑤族自治縣的長壽老人，具有顯著的降血脂功能[5]，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No.8545)。

1.2 材料與試劑

胃蛋白酶(1∶10 000)、牛膽鹽，北京索萊寶科技有限公司；2×TaqPCR MasterMix，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0、牛肉浸粉8.0、酵母浸粉4.0、葡萄糖20.0、磷酸氫二鉀2.0、檸檬酸氫二銨2.0、乙酸鈉5.0、硫酸鎂0.2、硫酸錳0.04、吐溫80 1.0，pH(6.5±0.2)。

不同氮源濃度的MRS培養(yǎng)基通過添加不同量的胰蛋白胨進(jìn)行調(diào)整(表1)[7]。

表1 不同氮源濃度培養(yǎng)基中胰蛋白胨的濃度Table 1 Concentrations of tryptone peptone in the modified MRS media

人工胃液：氯化鈉5.0 g/L、胃蛋白酶3.0 g/L，用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.5。

膽鹽培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取一定量的膽鹽溶于MRS液體培養(yǎng)基中，使其膽鹽質(zhì)量濃度為1 g/L，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH(6.5±0.2)，高壓滅菌后(121 ℃，15 min)，冷卻備用。

1.3 儀器與設(shè)備

Biophotometer plus核酸蛋白測定儀、5424R臺式冷凍離心機(jī)，艾本德中國有限公司；JF-SX-500全自動滅菌鍋，日本TOMY公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-150BSH生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DNA水平電泳槽，北京六一生物科技有限公司；藍(lán)光透射儀，天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌株的培養(yǎng)與鑒定

從凍存管中取鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的凍干菌粉(約1.0 g)，置于10 mL MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；將菌液在MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化；挑取單菌落，在MRS液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h；4 ℃保藏備用。

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。然后4 ℃，6 000×g離心10 min收集菌體。利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取菌株的DNA，使用鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的菌株鑒定引物進(jìn)行擴(kuò)增，并與母株擴(kuò)增圖譜進(jìn)行比較[9]。

1.4.2 生長能力比較

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到含不同氮源濃度的MRS液體培養(yǎng)基中，放置37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔1 h測1次OD600值，記錄不同培養(yǎng)基菌體OD600值到達(dá)0.5、1.0、2.0、3.0和4.0時的時間，每次測定平行3次。

1.4.3 活菌數(shù)測定

將處理樣品10倍梯度稀釋于MRS液體培養(yǎng)基，滴注5 μL稀釋液于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h；選擇菌落數(shù)在30～200(稀釋梯度為Tdilution)的菌斑計(jì)數(shù)為Ncolony。CFU計(jì)算方法：CFU/mL=10Tdilution×200×Ncolony[10]。

1.4.4 熱脅迫存活率測定

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到9支0P MRS和MRS培養(yǎng)基中，37 ℃ 靜置培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.5。然后3支直接進(jìn)行熱脅迫(54 ℃，1 h)處理；3支先經(jīng)溫和熱脅迫(46 ℃，1 h)預(yù)處理，再進(jìn)行熱脅迫(54 ℃，1 h)處理；3支先經(jīng)溫和氧化脅迫(0.5 mmol/L H2O2，1 h)預(yù)處理，再進(jìn)行熱脅迫(54 ℃，1 h)處理；分別測定處理前后的活菌數(shù)[6]。

1.4.5 氧化脅迫存活率測定

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到9支0P MRS和MRS培養(yǎng)基中，37 ℃ 靜置培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.5。然后3支直接進(jìn)行氧化脅迫(2.0 mmol/L H2O2，1 h)處理；3支先經(jīng)溫和熱脅迫(46 ℃，1 h)預(yù)處理，再進(jìn)行氧化脅迫(2.0 mmol/L H2O2，1 h)；3支先經(jīng)溫和氧化脅迫(0.5 mmol/L H2O2，1 h)預(yù)處理，再進(jìn)行氧化脅迫(2.0 mmol/L H2O2，1 h)；分別測定處理前后的活菌數(shù)[6]。

1.4.6 不同生長階段耐熱和耐氧化脅迫能力的測定

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到0P MRS和 MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.5、1.0、2.0、3.0、4.0，然后每個階段分別進(jìn)行熱脅迫(54 ℃，1 h)和氧化脅迫(1.6 mmol/L H2O2，1 h)處理，并測定每個階段經(jīng)熱脅迫和氧化脅迫后的活菌數(shù)。

1.4.7 菌株對模擬胃腸道環(huán)境耐受能力的測定

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值達(dá)到2.0左右，離心收集菌體，用滅菌的PBS緩沖液將菌體洗滌2次后懸浮，取1.0 mL的菌懸液接種至9.0 mL的pH 2.5人工胃液，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別在0和3 h利用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，計(jì)算其存活率(%)。每組重復(fù)3次。

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值達(dá)到2.0左右，離心收集菌體，用滅菌的PBS緩沖液將菌體洗滌2次后懸浮，取1.0 mL的菌懸液接種至9.0 mL的0.1%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別在0和3 h用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，計(jì)算其存活率(%)。每組重復(fù)3次。

1.4.8 菌株對高滲透壓和低溫脅迫的耐受能力的測定

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值達(dá)到2.0左右，離心收集菌體，用添加80 g/L NaCl的MRS培養(yǎng)基重懸，37 ℃培養(yǎng)4 h，分別在0和4 h用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，計(jì)算其存活率(%)。每組重復(fù)3次。

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值達(dá)到2.0左右，取1 mL菌液凍存于-20 ℃，分別在0和24 h用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，計(jì)算其存活率(%)。每組重復(fù)3次。

1.4.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在低氮源條件下的生長能力

使用鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的菌株鑒定引物對活化菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的擴(kuò)增圖譜與母株擴(kuò)增圖譜一致(圖1-A、圖1-B)[10]，表明純化獲得的菌株即為鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可與前期數(shù)據(jù)進(jìn)行對比。

低氮源環(huán)境下培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌具有更強(qiáng)的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力[7]，但是氮源濃度同時會影響鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的生長能力。菌株在4種培養(yǎng)基中，OD600值均能在4 h達(dá)到1.0；在OD600值達(dá)到2.0之前，氮源濃度對鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的生長速度影響不大。隨著菌體的繼續(xù)生長，氮源開始成為限制因素，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的OD600值在0P MRS中達(dá)到3.0和4.0的時間均顯著晚于MRS培養(yǎng)基(超過1 h)(圖1-C)。值得注意的是，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的OD600值在0P MRS中最先到達(dá)0.5，在2P MRS中最遲到達(dá) 2.0，表明高濃度氮源能夠抑制菌株生長。在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)隨生長時期調(diào)整氮源濃度，以促進(jìn)菌株的生長。

A-特異性引物對實(shí)驗(yàn)菌株的擴(kuò)增圖譜(H1～H4為鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301的特異性擴(kuò)增引物對)；B-特異性引物對鼠 李糖乳桿菌hsryfm 1301母株的擴(kuò)增圖譜；C-鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301在不同濃度氮源培養(yǎng)基中生長至特定濃度的時間圖1 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在不同濃度氮源培養(yǎng)基中的 生長情況Fig.1 Growth of L.rhamnosus hsryfm 1301 in media containing different concentrations of tryptone peptone 注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在低氮源培養(yǎng)下的熱脅迫-氧化脅迫交叉適應(yīng)

鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在MRS中對熱脅迫和氧化脅迫存在顯著的交叉適應(yīng)[6]。同種脅迫預(yù)處理能夠?qū)⒕甑拿{迫耐受能力提高至將近90%以上；氧化預(yù)處理能夠?qū)⒕甑臒崦{迫存活率從1%提高至46%(圖2-A)，而熱預(yù)處理能夠?qū)⒕甑难趸{迫存活率從2%提高至20%(圖2-B)。這一特性有助于菌株耐受噴霧干燥等生產(chǎn)過程中的脅迫環(huán)境。

在0P MRS中，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301對熱脅迫和氧化脅迫的適應(yīng)能力大幅提升，分別達(dá)到39%和35%；同種脅迫預(yù)處理能夠?qū)⒕甑拿{迫耐受能力進(jìn)一步提升至80%以上(圖2-C～圖2-D)。而且氧化預(yù)處理使熱脅迫的耐受能力提高至96%(圖2-C)，熱預(yù)處理使氧化脅迫的耐受能力提高至69%(圖2-D)。因此，熱-氧化脅迫交叉適應(yīng)仍然存在，雖然由于基礎(chǔ)耐受能力的上升導(dǎo)致了脅迫耐受提升倍數(shù)的下降，但是交叉適應(yīng)獲得的脅迫耐受絕對值進(jìn)一步提升。表明，氮源降低是實(shí)現(xiàn)熱-氧化脅迫交叉適應(yīng)的重要原因，但不是唯一原因；在實(shí)際生產(chǎn)中可以通過脅迫預(yù)處理和氮源調(diào)整進(jìn)一步提高鼠李糖乳桿菌的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力。

A-MRS中熱預(yù)處理(46 ℃，1 h)和氧化預(yù)處理(0.5 mmol/L H2O2，1 h)對菌株熱脅迫(54 ℃，1 h)耐受能力的影響；B-MRS中熱預(yù)處理 (46 ℃，1 h)和氧化預(yù)處理(0.5 mmol/L H2O2，1 h)對菌株氧化脅迫(2.0 mmol/L H2O2，1 h)耐受能力的影響；C-0P MRS中 熱預(yù)處理(46 ℃，1 h)和氧化預(yù)處理(0.5 mmol/L H2O2，1 h)對菌株熱脅迫(54 ℃，1 h)耐受能力的影響；D-0P MRS中熱預(yù)處理 (46 ℃，1 h)和氧化預(yù)處理(0.5 mmol/L H2O2，1 h)對菌株氧化脅迫(2.0 mmol/L H2O2，1 h)耐受能力的影響圖2 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在MRS和0P MRS中的熱-氧化脅迫交叉適應(yīng)Fig.2 The heat-oxidative stress cross adaptation of L.rhamnosus hsryfm 1301 in MRS and 0P MRS

2.3 低氮源環(huán)境下生長時期對菌株熱脅迫和氧化脅迫耐受能力的影響

前期研究在OD600=0.5的條件下發(fā)現(xiàn)了鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的熱-氧化脅迫交叉適應(yīng)現(xiàn)象，并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了降低氮源對熱脅迫和氧化脅迫耐受能力的提升作用[6-7]，但是低氮源在其他生長時期的影響作用尚不清晰。將鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301分別在MRS和0P MRS中培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.5、1.0、2.0、3.0和4.0，并檢測菌體的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力。

如圖3所示，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在不同生長階段表現(xiàn)出不同的耐熱能力。當(dāng)菌株生長至OD600值為0.5、1.0、2.0和3.0時，0P MRS菌體的熱脅迫存活率均高于正常MRS組。尤其當(dāng)OD600值達(dá)到2.0時，0P MRS組的存活率為73.7%，而MRS為0.57%，低氮源培養(yǎng)(0P MRS)后的存活率提高了129倍(圖3-A)。這表明在菌株的生長前期低氮源濃度培養(yǎng)有利于提高其耐熱能力。當(dāng)OD600值達(dá)到4.0時，對照組的存活率與0P MRS組無顯著性差異。

A-熱脅迫(54 ℃，1 h)；B-氧化脅迫(1.6 mmol/L H2O2，1 h)圖3 氮源對不同生長時期鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301 熱脅迫和氧化脅迫耐受能力的影響Fig.3 Thermotolerance and aerotolerance of L.rhamnosus hsryfm 1301 during different growth stages in MRS and 0P MRS

同樣鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在不同的氮源濃度下各生長階段的氧化脅迫存活率所呈現(xiàn)出的規(guī)律和熱脅迫相似。在OD600值為0.5、1.0、2.0和3.0時，正常MRS培養(yǎng)后菌株的存活率顯著低于0P MRS。其中當(dāng)OD600值為2.0時這種現(xiàn)象最為明顯，在這個生長時期低氮源培養(yǎng)(0P MRS)的存活率比正常MRS組提高了40倍(圖3-B)；而在OD600值為4.0時，低氮源組和正常組無顯著差異。這說明高濃度胰蛋白胨培養(yǎng)不利于菌株抗氧化。

因此，在工業(yè)生產(chǎn)中較為重要的指數(shù)期和穩(wěn)定前期，低氮源濃度環(huán)境下的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301有更強(qiáng)的耐熱和耐氧化能力；而且菌株在低氮源環(huán)境中生長至OD600值為2.0時，其耐熱能力和耐氧化能力最佳。

2.4 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在低氮源培養(yǎng)下的常見脅迫耐受能力

在指數(shù)期，低氮源濃度環(huán)境對鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的耐熱和耐氧化強(qiáng)化效果最佳。但是已有文獻(xiàn)表明，氮源對乳酸菌的脅迫耐受往往發(fā)揮積極作用。在高滲環(huán)境下，嗜酸乳桿菌會在胞內(nèi)累積脯氨酸[11]；半胱氨酸作為氧化還原酶的核心位點(diǎn)，有助于發(fā)酵乳桿菌和嗜酸乳桿菌抵御氧化脅迫[12-13]。此外，唾液乳桿菌會利用蛋白水解系統(tǒng)產(chǎn)生更多的氨基酸來耐受膽鹽脅迫[14]。

因此，低氮源培養(yǎng)對鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301其他脅迫耐受能力的影響不可忽視。酸脅迫和膽鹽脅迫是益生菌研究中最為重要的脅迫種類，低氮源培養(yǎng)和正常培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的酸脅迫存活率分別為8.9%和9.7%，差異不顯著，膽鹽脅迫存活率也未受到明顯影響，表明低氮源培養(yǎng)獲得的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301菌體不會在胃腸道環(huán)境耐受中處于劣勢。此外，冷凍脅迫和滲透壓脅迫也是乳酸菌產(chǎn)品加工及貯藏過程中常見的脅迫，低氮源培養(yǎng)及正常MRS培養(yǎng)獲得的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301菌體對-20 ℃的冷凍脅迫和8% NaCl的滲透壓脅迫的耐受能力也沒有差異(表2)。表明低氮源培養(yǎng)菌體在氧化脅迫和熱脅迫耐受能力獲得強(qiáng)化的同時，常見脅迫的耐受能力未受影響。

表2 氮源對鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301常見脅迫耐受能力的影響Table 2 Tolerance of L.rhamnosus hsryfm 1301 to common stresses in MRS and 0P MRS

3 結(jié)論

減少培養(yǎng)基中蛋白胨的含量，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在穩(wěn)定前期以前的生長速度未受到顯著影響，交叉適應(yīng)和低氮源配合進(jìn)一步提高了菌株的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力。指數(shù)期菌體在熱脅迫和氧化脅迫下的存活率大幅上升，而且酸脅迫、膽鹽脅迫、冷凍脅迫和滲透壓脅迫的耐受能力未受影響。低氮源培養(yǎng)和交叉適應(yīng)配合將有利于提高菌株在噴霧干燥等造成熱脅迫和氧化脅迫的生產(chǎn)過程中的存活率。