張丹丹，王 松，李玉杰，張冬梅，于明艷，楊蕙如，陳德俊

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省仿制藥一致性評價(jià)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101）

鹽酸吡格列酮（pioglitazone hydrochloride）是一種噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，最早由日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社（Takeda）成功合成，臨床主要用于治療2型糖尿病[1]。1999年7月，鹽酸吡格列酮片獲FDA批準(zhǔn)上市，商品名為ACTOS（艾可拓）。日本藥品審評中心（PMDA）公開的《IF文件》中顯示：20 ℃下，鹽酸吡格列酮在pH 1.1，pH 2.0，pH 5.0，pH 7.0溶液中的溶解度分別為6.7，0.42 ，0.00026，0.000093 mg/ml，因此，鹽酸吡格列酮屬于pH依賴性藥物。在生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system, BCS）中，鹽酸吡格列酮屬于II類，即低溶解性、高滲透性藥物[2]。

口服固體制劑在人體內(nèi)胃腸道的吸收取決于其溶出行為、生理?xiàng)l件下藥物的溶解度和藥物的滲透性。普通的溶出度實(shí)驗(yàn)可用于體外模擬胃腸道的崩解和溶出，但其反映的藥物溶出行為變化不具臨床意義[3]，而人體生物等效性實(shí)驗(yàn)成本高，耗時(shí)長，失敗風(fēng)險(xiǎn)大。測定藥物滲透性最直接的方法是人體小腸灌流法，但是人體試驗(yàn)成本高且操作復(fù)雜。Caco-2細(xì)胞模型是國內(nèi)外普遍采用的藥物滲透性研究工具，Caco-2細(xì)胞來源于人的直腸癌，結(jié)構(gòu)和功能與人小腸上皮細(xì)胞類似，廣泛應(yīng)用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、藥物吸收等方面的研究，缺點(diǎn)是細(xì)胞培養(yǎng)周期長且易受污染[4]。動(dòng)物模型也是研究藥物滲透性的常用方法之一，主要包括體內(nèi)小腸灌流試驗(yàn)和原位小腸灌流試驗(yàn)。體內(nèi)小腸灌流試驗(yàn)更接近體內(nèi)真實(shí)滲透情況。原位小腸灌流試驗(yàn)則模型相對簡單，影響因素較少，參數(shù)易于分析。但是相關(guān)藥物滲透性試驗(yàn)主要需用動(dòng)物，試驗(yàn)成本高，時(shí)間長，需要考慮倫理學(xué)方面的問題，還可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[4]。平行人工膜滲透性分析法（parallel artificial membrane permeability assay，PAMPA）是采用涂卵磷脂溶液的聚偏氟乙烯或聚碳酸酯膜模擬小腸上皮細(xì)胞以測定被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制吸收的藥物滲透性，其測定結(jié)果與人體小腸灌流法呈正相關(guān)[5-6]。采用PAMPA研究藥物滲透性具有操作簡便、效率高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，且絕大多數(shù)口服固體制劑是通過被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制滲透進(jìn)入血液[7]，因此，其在藥物處方篩選及仿制藥一致性評價(jià)等方面應(yīng)用較廣泛。

本實(shí)驗(yàn)將溶出度儀與人工仿生膜滲透性預(yù)測系統(tǒng)結(jié)合，建立了基于體外溶出-滲透速率測試結(jié)果的模型，具有一定的體外溶出與體內(nèi)吸收相關(guān)性，用于預(yù)測鹽酸吡格列酮片（膠囊）的生物等效性，并初步考察了輔料對鹽酸吡格列酮原料滲透性的影響。受試制劑和參比制劑說明書中均表示空腹與餐后原形藥物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)無明顯差異，本次實(shí)驗(yàn)以空腹為代表。

1 材料與儀器

1.1 儀器

MacroFLUXTM型光纖藥物溶出度與滲透速率測試系統(tǒng)（美國Pion Inc公司）；MS105DU型電子天平與S400-K pH計(jì)（Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸吡格列酮對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100634-202104，純度：100 %）；參比制劑（鹽酸吡格列酮片，Teva Takeda，商品名：艾可拓，規(guī)格：15 mg，批號：11887977）；受試制劑A（鹽酸吡格列酮片，規(guī)格：30 mg，已通過一致性評價(jià)），受試制劑B（鹽酸吡格列酮片，規(guī)格：15 mg），受試制劑C（鹽酸吡格列酮膠囊，規(guī)格：15 mg），3批受試制劑均來自山東省2021年風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測抽驗(yàn)；滲透速率接收池（帶膜）（美國Pion Inc公司，批號：520926）；磷脂溶液（美國Pion Inc公司，批號：520852）；ASB（pH 7.4）溶液（美國Pion Inc公司，批號：520945）；藥物溶出模擬液固體粉末（英國Biorelevant公司，批號：FFF-0421-B）；氫氧化鈉、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、鹽酸、冰醋酸、二甲基亞砜（DMSO）均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 MacroFLUXTM藥物溶出度與滲透速率測試系統(tǒng)

本系統(tǒng)（見圖1）中溶出杯作為供體室代表胃腸道，以不同pH值的溶出介質(zhì)（空腹：胃液pH 1.6，腸液pH 6.5；飽腹：胃液腸液pH 5.0）進(jìn)行空飽腹實(shí)驗(yàn)（本實(shí)驗(yàn)以空腹為代表），用涂以磷脂溶液的人工仿生膜模擬胃腸道細(xì)胞膜，受體室中加入ASB緩沖液（pH 7.4）用于模擬血液。制劑置于溶出杯中模擬藥物的溶出行為，溶解后的藥物通過仿生膜進(jìn)入受體室模擬藥物的吸收過程。藥物濃度變化通過原位光纖DAD檢測器實(shí)時(shí)檢測，實(shí)現(xiàn)藥物溶出和滲透吸收同時(shí)監(jiān)測。通過關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)考察藥物的釋放與吸收過程，預(yù)測制劑間是否生物等效。

圖1 MacroFLUXTM藥物溶出度與滲透速率測試系統(tǒng)示意圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.2.1 對照品儲(chǔ)備液的配制 取鹽酸吡格列酮對照品適量，精密稱定，用DMSO制成每1 ml含吡格列酮8.1，1.0 mg兩種濃度的溶液，分別作為供體室對照品儲(chǔ)備液和受體室對照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供體室標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 胃模擬液（pH 1.6）：將光纖探頭置入200 ml胃模擬液（pH 1.6），每次加入90 μl的供體室對照品儲(chǔ)備液后測定，得每1 ml含吡格列酮3.7，7.3，11.0，14.7，18.3 μg的一系列溶液的紫外光譜，選取286～296 nm波長范圍，以吸光度二階導(dǎo)數(shù)為橫坐標(biāo)，以濃度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立鹽酸吡格列酮制劑（規(guī)格：15 mg）胃模擬液（pH 1.6）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同法操作，每次加入180 μl的供體室對照品儲(chǔ)備液后測定，建立鹽酸吡格列酮制劑（規(guī)格：30 mg）胃模擬液（pH 1.6）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

空腹腸模擬液（pH 6.5）：將光纖探頭置入200 ml空腹腸模擬液（pH 6.5），每次加入50 μl的供體室對照品儲(chǔ)備液后測定，得每1 ml含吡格列酮2.0，4.1，6.1，8.2，10.2 μg的一系列溶液的紫外光譜，照胃模擬液（pH 1.6）下方法處理，建立鹽酸吡格列酮制劑（規(guī)格：15，30 mg）空腹腸模擬液（pH 6.5）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以上標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，線性關(guān)系良好。

2.2.3 受體室標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將光纖探頭置入50 ml ASB（pH 7.4）溶液中，每次加入50 μl的受體室對照品儲(chǔ)備液后測定，得每1 ml含吡格列酮1.0，2.1，3.1，4.1，5.2 μg的一系列溶液的紫外光譜，按照胃模擬液（pH 1.6）中的方法處理后建立受體室標(biāo)準(zhǔn)曲線。此標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)大于0.9999，線性關(guān)系良好。

2.3 測定方法

采用圖1裝置，按溶出度與釋放度測定法（《中國藥典》2020年版四部通則0931第二法），溶出介質(zhì)：開始以胃模擬液（pH 1.6）800 ml為溶出介質(zhì)，30 min時(shí)加入混合溶液[空腹腸模擬液（10×）與磷酸鹽緩沖液等比混合]200 ml使成空腹腸模擬液（pH 6.5）；溫度：37.0 ℃；轉(zhuǎn)速：50 r/min；受體室（即滲透速率接收池）接收液：ASB緩沖液（pH 7.4）12 ml；微攪拌槳轉(zhuǎn)速：450 r/min；以50 μl胃腸道模擬脂質(zhì)體溶液浸潤滲透速率接收池上的仿生膜（膜面積3.88 cm2），采集時(shí)間300 min，采樣間隔1 min。在240～400 nm內(nèi)，用光纖探頭分別測定溶出杯和受體室中的吸光度，按公式（1）、（2）分別計(jì)算制劑的滲透速率J（FLUX）和總滲透量T（permeation amount）。采用雙側(cè)t檢驗(yàn)的方法，按照下式（3）計(jì)算滲透速率和總滲透量幾何均值比的90%置信區(qū)間。

式中J為滲透速率，即藥物單位時(shí)間通過單位膜面積的量[μg/(min·cm2)]；為單位時(shí)間內(nèi)受體室中藥物濃度變化速率[μg/(ml·min)]；V為受體室中接受液的體積（ml）；A為仿生膜膜面積（cm2，本次實(shí)驗(yàn)為3.88 cm2）。

式中T為總滲透量（permeation amount），即藥物在測定時(shí)間通過仿生膜的總量（μg）；C為最終時(shí)間點(diǎn)接受液中的藥物濃度（μg/ml）；V為受體室中接受液的體積（ml）。

式中JT為受試制劑滲透速率的平均值，當(dāng)計(jì)算總滲透量的90 %置信區(qū)間時(shí)，為受試制劑總滲透量的平均值；JR為參比制劑滲透速率的平均值，當(dāng)計(jì)算總滲透量的90 %置信區(qū)間時(shí)，為參比制劑總滲透量的平均值；S為受試制劑滲透速率（或總滲透量）的標(biāo)準(zhǔn)偏差；n為樣本重復(fù)次數(shù)（本次實(shí)驗(yàn)n=3）；C為換算系數(shù)，與重復(fù)次數(shù)具有相關(guān)性，n=3時(shí)，C=2.92。

受試制劑A規(guī)格為30 mg，選取的參比制劑規(guī)格為15 mg，在進(jìn)行受試制劑A的生物等效性試驗(yàn)時(shí)，參比制劑每溶出杯中投藥2片。進(jìn)行受試制劑B、C等效性實(shí)驗(yàn)時(shí)，受試制劑與參比制劑每溶出杯投藥1片。

2.4 生物等效性預(yù)測結(jié)果

受試制劑A在30 min時(shí)溶出杯中濃度可達(dá)30 μg/ml（見圖2 供體室），表明此時(shí)鹽酸吡格列酮溶出完全。在加入混合溶液后溶出介質(zhì)由胃模擬液（pH 1.6）轉(zhuǎn)換為空腹腸模擬液（pH 6.5），溶出杯中鹽酸吡格列酮逐漸析出，濃度降低并維持約2.5 μg/ml（見圖2 供體室、圖3供體室）。受體室中前30 min鹽酸吡格列酮一直維持在極低濃度水平，表明藥物滲透較少，溶媒轉(zhuǎn)換至空腹腸模擬液（pH 6.5）后，受體室中吡格列酮濃度逐漸增加（見圖2受體室、圖3受體室）。30 min之前，鹽酸吡格列酮在胃模擬液（pH 1.6）中快速溶解，藥物濃度較高，但大部分呈解離狀態(tài)以離子形式存在，難以跨膜滲透；在空腹腸模擬液（pH 6.5）中雖溶解度降低，但多以分子形式存在易于跨膜。本實(shí)驗(yàn)截取受體室120～170 min數(shù)據(jù)，根據(jù)受體室中測得的濃度，以時(shí)間對濃度進(jìn)行線性回歸，各受試制劑與參比制劑的線性方程見表1，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995。以該時(shí)間段藥物濃度變化速率（即線性方程斜率）代入式（1）計(jì)算滲透速率，以300 min時(shí)測得的受體室接收液濃度（見表1）代入式（2）計(jì)算總滲透量，受試制劑A與參比制劑（投藥2片）計(jì)算結(jié)果（n=3）見表2，受試制劑A滲透速率和總滲透量幾何均值比的90 %置信區(qū)間在80.00 %～125.00 %之間，可初步預(yù)測其與參比制劑生物等效。鑒于受試制劑A已通過一致性評價(jià)，可證明此系統(tǒng)用于鹽酸吡格列酮制劑生物等效性初步預(yù)測的可行性及準(zhǔn)確性。

表1 滲透速率線性方程及最終點(diǎn)受體室接受液濃度

圖2 受試制劑A溶出（供體室）與滲透（受體室）濃度變化圖

圖3 參比制劑（投藥2片）溶出（供體室）與滲透（受體室）濃度變化圖

表2 受試制劑A與參比制劑（投藥2片）滲透速率與總滲透量計(jì)算結(jié)果

對受試制劑B及受試制劑C進(jìn)行生物等效性預(yù)測，計(jì)算結(jié)果（n=3）見表3。兩制劑的滲透速率和總滲透量幾何均值比的90 %置信區(qū)間均未落在80.00 %～125.00 %，可初步預(yù)測受試制劑B、C與參比制劑生物不等效。

圖4 受試制劑B溶出（供體室）與滲透（受體室）濃度變化圖

圖5 受試制劑C溶出（供體室）與滲透（受體室）濃度變化圖

圖6 參比制劑（投藥1片）溶出（供體室）與滲透（受體室）濃度變化圖

表3 受試制劑B、C與參比制劑（投藥1片）滲透速率與滲透總量計(jì)算結(jié)果

2.5 輔料對吡格列酮滲透性影響

將3批受試制劑的原料（稱取相當(dāng)于其規(guī)格的重量）投入供體室中，通過與制劑滲透結(jié)果對比，以考察輔料對吡格列酮滲透性的影響。3批受試制劑的原料300 min時(shí)滲透濃度約20 μg/ml，受試制劑B和C 于300 min時(shí)滲透濃度約為11 μg/ml，而受試制劑A僅為6 μg/ml（見圖7），由此可見，3批受試制劑原料的滲透總量和滲透速率均遠(yuǎn)高于其制劑。鑒于3批受試制劑在30 min內(nèi)均能溶出完全，藥物的滲透性不再受其溶出的限制，故而輔料（種類、用量等）成為影響主成分滲透性的關(guān)鍵因素。

圖7 受試制劑A、B、C與其原料滲透性測定結(jié)果對比圖

3 討論

鹽酸吡格列酮是pH依賴型藥物，在胃模擬液（pH 1.6）中溶解度良好，溶媒轉(zhuǎn)換為空腹腸模擬液（pH 6.5）后因溶解度降低逐漸有沉淀析出（見圖8），輔料的用量、種類都可能成為影響沉淀粒子大小的因素。有文獻(xiàn)報(bào)道胃腸道中鹽酸吡格列酮析出后的粒徑影響藥物吸收，進(jìn)而導(dǎo)致生物利用度差異[8]。提示在類似pH依賴型藥物的制劑處方篩選時(shí)因溶解度導(dǎo)致藥物析出沉淀的粒徑也值得關(guān)注。

圖8 受試制劑A、B在胃模擬液（pH 1.6）及空腹腸模擬液（pH 6.5）中溶解情況

對比不同規(guī)格鹽酸吡格列酮制劑的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，15 mg規(guī)格的滲透速率和總滲透量均高于30 mg規(guī)格。參比制劑投藥2片與投藥1片供體室、受體室中吡格列酮濃度變化對比情況見圖9。前30 min供體室介質(zhì)為胃模擬液（pH 1.6），因吡格列酮能完全溶解，30 mg規(guī)格的供體室濃度遠(yuǎn)高于15 mg規(guī)格。半小時(shí)后溶媒轉(zhuǎn)換為空腹腸模擬液（pH 6.5），因溶解度降低吡格列酮析出。由于30 mg規(guī)格過飽和濃度高，析出較15 mg規(guī)格快，自40 min開始供體室中濃度一直低于15 mg規(guī)格。通過對比原料（圖10）與制劑（圖9 供體室）在供體室的濃度變化發(fā)現(xiàn)，原料的過飽和析出較制劑緩慢。這說明吡格列酮在過飽和析出的過程中包裹輔料或者輔料的某些性質(zhì)（用量、溶解性等）加速了這種析出。本預(yù)測系統(tǒng)是模擬基于濃度驅(qū)動(dòng)的滲透行為，也就導(dǎo)致了30 mg規(guī)格的滲透低于15 mg規(guī)格。鑒于生物等效性研究以同等劑量的制劑相比較，所以此現(xiàn)象對本預(yù)測系統(tǒng)在生物等效性研究方面的應(yīng)用影響較小。本實(shí)驗(yàn)采用的溶出-人工仿生膜滲透性預(yù)測系統(tǒng)直觀地模擬了鹽酸吡格列酮體內(nèi)溶出滲透過程，為鹽酸吡格列酮制劑的處方篩選和生物等效性初步預(yù)測提供了新思路和方法。

圖9 參比制劑投藥2片與投藥1片溶出（供體室）、滲透（受體室）濃度對比圖

圖10 原料30 mg與原料15 mg供體室濃度對比圖