李少情，張青山 ，趙 婷，白婷婷，宣麗穎，王 羽△，趙 明△

(1.滄州市中心醫(yī)院，滄州 061000；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130000；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，通遼 028000；4.內(nèi)蒙古蒙藥心腦血管藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，通遼 028000)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，快節(jié)奏的生活常伴隨著不良的飲食、作息習(xí)慣，這些不良的習(xí)慣帶來了諸多健康問題，其中包括近年來發(fā)病率逐年攀升的心血管疾病，2015年發(fā)布的中國心血管病報(bào)告稱，心血管病占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，為我國居民的首位死因。缺血性心肌病的發(fā)生，也是臨床上較為常見的心血管疾病，也是慢性冠脈疾病的一種，心室擴(kuò)大及心力衰竭都是臨床上常見的表現(xiàn)[1]。其原因是由于長期冠脈缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡及纖維組織增生等病理改變引發(fā)的心肌重塑。研究表明線粒體在缺血性心肌病心肌重塑中起著獨(dú)特和關(guān)鍵的作用。異常增高的胞漿中游離Ca2+濃度(intracellular Ca2+concentration,[Ca2+]i) 出現(xiàn)異常增高現(xiàn)象時(shí)，可易于誘發(fā)線粒體發(fā)生功能障礙進(jìn)而加重心臟的病理損傷[2]。正常心肌中ATP敏感性鉀通道 (ATP-sensitive potassium channel,KATP) 由于細(xì)胞中高濃度ATP而處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)心肌出現(xiàn)缺血情況下，KATP開放，縮短動(dòng)作電位時(shí)程，K+外流，加速復(fù)極，動(dòng)作電位平臺(tái)期縮短，進(jìn)而減低Ca2+內(nèi)流及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。黃芪是常見的中草藥之一，對于乏力和氣短等癥狀都有一定的療效。本團(tuán)隊(duì)前期工作發(fā)現(xiàn)黃芪注射液(黃芪的一種劑型)，通過calumenin介導(dǎo)抑制缺血性心肌病大鼠心肌細(xì)胞自噬延緩心室重塑[3]，但其機(jī)制尚未完全明確，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿鞔_黃芪注射液是否通過影響KATP，進(jìn)而減低缺血性心肌病大鼠心肌細(xì)胞[Ca2+]i延緩心室重塑改善心臟功能。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的藥品與儀器

雄性SD大鼠(180～220 g)36只(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心)，許可證號：SCXKs(吉)20110004。黃芪注射液(成都地奧九泓制藥廠：國藥準(zhǔn)字Z51021776)，規(guī)格：每支10 ml，每ml含黃芪原藥2 g。Mfn1抗體chop抗體(abcam公司)，內(nèi)參β-action(武漢賽維爾生物科技公司)。IKATP采用全細(xì)胞膜片鉗配置MultiClamp 700A放大器、1550A數(shù)模轉(zhuǎn)換器和PCLAMP 10.6采集和分析軟件(Molecular Devices,USA)進(jìn)行分析。SpectraMax Gemini XPS 熒光酶標(biāo)儀(Molecular Devices,USA)。線粒體Ca2+濃度檢測試劑盒(GMS10153.2)購自GENMED公司。

1.2 缺血性心肌病大鼠模型的制備及分組

36只雄性鼠隨機(jī)分成：對照組(Control group)、缺血性心肌病組(Ischemic cardiomyopathy group)、黃芪注射液組(Astragalus injection group)，每組各12只。缺血性心肌病大鼠模型的制備同本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)方法[3,4]，經(jīng)20%的氨基甲酸乙酯(5 mg/kg)腹腔注射麻醉后，氣管插管，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，按肢體標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)нB接BL420生理儀記錄心電圖，心電圖檢測ST段抬高、T波高尖為模型建立成功。黃芪注射液組中每周一次注射黃芪注射液(劑量：10 g/kg體重)，每次注射容積1 ml，共注射4次；對照組和缺血性心肌病組，腹腔均注射相同劑量的生理鹽水。4周后給予3組大鼠麻醉后行心臟彩超檢查后，立即處死大鼠，取大鼠(每組3只)左心室組織放入4%戊二醛溶液中進(jìn)行固定、脫水、滲透和包埋后用超薄切片機(jī)切片，進(jìn)行切片染色后采用透射電子顯微鏡進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀測心肌組織超微變化。

1.3 Western blot

取各組大鼠左心室組織制備心臟勻漿，提取總蛋白，蛋白定量后，30 μg的心臟裂解液，采用Western blot方法檢測各組大鼠心肌組織中Mfn1、chop 表達(dá)。實(shí)驗(yàn)過程主要步驟：(1)配好所需濃度分離膠與濃縮膠；(2)加入10 μl樣品，SDS PAGE后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；(3)封閉2 h；(4)一抗(Mfn1 1∶100、chop 1∶1 000)4℃過夜孵育；(5)二抗孵育1 h；(6)顯影；(7)整理數(shù)據(jù)分析條帶。

1.4 心肌細(xì)胞ATP敏感鉀電流(IKATP)的檢測

隨機(jī)選取對照組中大鼠，將其心臟進(jìn)行分離，同時(shí)將心臟進(jìn)行主動(dòng)脈逆行插管，固定后懸掛于Langendorff灌流裝置上，以普通Tyrode液灌流3～5 min，灌流速度7 ml/min，靜水壓70 cm H2O，溫度37℃。心肌細(xì)胞分離方法同團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)方法[4]。ATP敏感鉀電流(IKATP)記錄條件：先給予細(xì)胞外液加入KATP通道開放劑100 μmol panicidil，然后把細(xì)胞膜電位鉗制于-70 mV，鉗制電壓由-70 mV階躍至-110 mV維持100 ms，然后給予1000 ms Ramp刺激至10 mV，每隔10 s重復(fù)采集數(shù)據(jù)，加入200 g/L黃芪注射液，觀察黃芪注射液對心肌細(xì)胞IKATP作用，然后給予KATP通道特異性阻斷劑格列本脲觀察其是否能阻斷黃芪注射液對心肌細(xì)胞IKATP作用，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.5 大鼠心肌組織中線粒體鈣濃度檢測

線粒體提取選取組織線粒體分離試劑盒(Beyotime)，取新鮮的大鼠心臟組織，PBS清洗后置于冰上將組織剪成組織碎片，加入線粒體分離試劑A進(jìn)行冰浴勻漿，低速離心取上清后，高速離心，沉淀即為分離到的線粒體。使用線粒體Ca2+濃度檢測試劑盒及熒光酶標(biāo)儀檢測各組大鼠心肌組織中線粒體Ca2+濃度。具體操作：(1)準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔板；(2)取100 μl純化的線粒體樣品加入到96孔板中，并做最大對照組和空白對照組；(3)加入10 μl染色工作液；(4)室溫孵育30 min后，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min；(5)放入熒光酶標(biāo)儀中測讀。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠心電圖觀察

對照組大鼠室早發(fā)生率(12±4)%，未記錄到室速發(fā)生。缺血性心肌病組大鼠室早為(389±56)次，室速發(fā)生率(26±7)%。黃芪注射液組中大鼠為(173±31)次，室速發(fā)生率(6±2)%。缺血性心肌病組中大鼠比較，黃芪注射液組中大鼠心律失常情況明顯減少(圖1)。

Fig. 1 Changes of electrocardiogram in rats with different treatment

2.2 大鼠心臟彩超觀察

如圖2和表2,對照組中大鼠心臟超聲檢查心臟結(jié)構(gòu)及功能未見明顯改變，與對照組比較，缺血性心肌病組中大鼠心臟超聲檢查心室擴(kuò)大，EF值降低，與缺血性心肌病組中大鼠相比較，黃芪注射液組中大鼠心室縮小，EF值增加，有顯著性差異(P<0.01) 。

Fig. 2 Comparison of echocardiographic results of rats in each group

2.3 大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察

通過透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組中大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)完整，且肌節(jié)沒有出現(xiàn)缺失，心肌纖維排列有序且整齊，線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見；而缺血性心肌病組大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，線粒體出現(xiàn)空泡化情況較為嚴(yán)重，部分心肌纖維發(fā)生斷裂和缺失；而黃芪注射液組中，大鼠的心肌纖維排列紊亂，肌節(jié)完整性受損，線粒體空泡化減輕(圖3)。

Fig. 3 Ultrastructural changes of myocadium in rats of each group under electron microscopy (Bar=2.0 μm)

2.4 大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位及鈣濃度檢測

與空白組相比，大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程APD30，APD50，APD90延長(P<0.01)，線粒體Ca2+濃度增多(P<0.01)。與缺血性心肌病組比較，黃芪注射液組中大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程APD30(P<0.05)，APD50(P<0.01)，APD90(P<0.01)明顯縮短(表1)，線粒體Ca2+濃度降低(P<0.01，表2)。

Tab. 1 Action potential of cardiomyocytes in different n=3)

Tab. 2 LVIDd,EF and concentration of mitochondrial Ca2+of cardiomyocytes in different

2.5 大鼠心肌組織中Mfn1、chop 表達(dá)

與缺血性心肌病組中大鼠相比較，黃芪注射液可以明顯增加Mfn1表達(dá)；與缺血性心肌病組中大鼠相比較，黃芪注射液可以明顯減少chop 表達(dá)(圖4,表3)。

Fig. 4 The expressions of Mfn1and chop in different group

Tab. 3 The expressions of Mfn1 and chop and the I(nA) of IKATP in rats’ heart of each group n=3)

2.6 黃芪注射液對大鼠心肌細(xì)胞IKATP的作用

先給予細(xì)胞外液加入KATP通道開放劑100 μmol panicidil記錄心肌細(xì)胞IKATP，然后給予黃芪注射液后記錄電流，發(fā)現(xiàn)IKATP明顯增大，再給予IKATP特異性阻斷劑格列本脲后記錄電流，觀察到IKATP明顯減小(圖5,表3)。

Fig. 5 Electrocurrent of myocardial cells in each group

3 討論

隨著人們生活方式的改變，心血管疾病患病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上漲的趨勢，它不但是醫(yī)學(xué)問題，同樣也是社會(huì)、經(jīng)濟(jì)問題。究其原因，缺血性心臟病是其最主要病因。本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可有效改善大鼠心肌缺血現(xiàn)象[3]，但原因不明。

為了探明黃芪注射液治療心肌缺血作用，本研究應(yīng)用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支建立大鼠缺血性心肌病模型，以心電圖ST段抬高、T波高尖作為模型是否成功的標(biāo)志。采用預(yù)先給予大鼠黃芪注射液四周后，通過心電圖和超聲心動(dòng)圖的結(jié)果可知，黃芪注射液可明顯延緩缺血性心肌病大鼠心室重塑及減少心律失常，為明確其作用機(jī)制，通過電鏡觀察各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變，可見缺血性心肌病組中大鼠心肌組織線粒體發(fā)生空泡化情況嚴(yán)重，心肌纖維斷裂缺失，而黃芪注射液組中大鼠的心肌纖維雖然排列紊亂，肌節(jié)完整性受到一定的損傷，但線粒體具有完整性。推測黃芪注射液治療心肌缺血作用與線粒體相關(guān)。線粒體功能紊亂導(dǎo)致的能量供應(yīng)不足已成為缺血性心肌病的發(fā)病機(jī)制之一。由于線粒體具有高度動(dòng)態(tài)性的特征，可以持續(xù)不斷地融合-分裂循環(huán)，這一循環(huán)過程稱為線粒體動(dòng)力學(xué)，線粒體通過這一過程維持其大小，形狀和網(wǎng)絡(luò)受細(xì)胞生理學(xué)控制，包括對心臟的發(fā)育、Ca2+的信號傳導(dǎo)及細(xì)胞死亡起著重要作用[5]。線粒體融合蛋白Mfn1在線粒體動(dòng)力學(xué)中發(fā)揮重要的作用。特異性敲除成年小鼠心臟Mfn1/2基因?qū)е滦∈缶€粒體功能異常，并伴有嚴(yán)重的心肌細(xì)胞呼吸缺陷，最終發(fā)展為心力衰竭[6]。本研究觀察到黃芪注射液可以明顯增加MFN1表達(dá)，說明黃芪注射液可調(diào)控線粒體融合。線粒體動(dòng)力學(xué)在線粒體鈣處理、凋亡中發(fā)揮重要的作用[7]。線粒體Ca2+攝取和釋放對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生重要影響，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)下，線粒體Ca2+濃度的升高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]。研究發(fā)現(xiàn)黃芪注射液減低缺血性心肌病大鼠心臟線粒體中的鈣離子濃度。缺血心肌病由于長期冠脈缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡及纖維組織增生等病理改變引發(fā)的心肌重塑。心肌細(xì)胞死亡有多種形式，心肌細(xì)胞凋亡也是主要形式之一，而凋亡產(chǎn)生機(jī)制是錯(cuò)綜復(fù)雜的，相關(guān)研究表明線粒體在細(xì)胞內(nèi)源性凋亡中處于中心地位，而且線粒體的斷裂以及線粒體嵴重構(gòu)均出現(xiàn)在細(xì)胞凋亡早期[9]。Chop蛋白是凋亡相關(guān)因子。大量研究表明敲除chop可以減輕心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，改善小鼠心臟再灌注損傷[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)黃芪注射液可以降低心肌缺血大鼠心肌中chop蛋白的表達(dá)。這個(gè)結(jié)果部分解釋了黃芪注射液延緩缺血性心肌病大鼠心室重塑作用機(jī)制可能是通過抑制缺血性心肌病大鼠心肌細(xì)胞線粒體Ca2+超載，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞凋亡所致。與此同時(shí)，黃芪注射液可以加大心肌細(xì)胞IKATP，該作用能被KATP特異性阻斷劑----格列本脲所阻斷，因?yàn)樵谌毖?再灌注過程中IKATP對心肌起到保護(hù)作用，并且有抗心律失常作用[11,12]，同時(shí)，線粒體膜上KATP開放可減輕線粒體Ca2+超載減少缺血/再灌注損傷所致心肌細(xì)胞凋亡[13]，該結(jié)果部分說明黃芪注射液延緩缺血性心肌病大鼠心室重塑及減少心律失常是通過加大IKATP所介導(dǎo)的。