張菁華,劉勝賢,李景麗,劉 寧

(天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腦病三科，天津 300400)

缺血性卒中具有高致死率和高致殘率[1]。近半數(shù)卒中患者均有吞咽困難癥狀[2]。吞咽困難可引起肺炎、營養(yǎng)不良及脫水等并發(fā)癥，增加卒中病死率，延長患者住院時間并影響康復進程[3]。因此采取積極有效措施防治吞咽困難的發(fā)生，對卒中患者康復具有重要意義。吞咽是一種復雜的神經(jīng)調節(jié)，卒中所引起的任何與吞咽運動相關的皮質、皮質纖維、腦干或相關神經(jīng)核團的損傷都可能導致吞咽困難的發(fā)生[4]。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅雙翅邊緣缺刻同源基因(drosophila double-wing margin nicked homologous gene，Notch)/核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信號通路可參與調控腦損傷后腦室下區(qū)的神經(jīng)細胞生存及組織損傷修復過程[5]。但Notch/NF-κB通路對卒中后吞咽神經(jīng)中樞的影響報道較少。中藥雞血藤歸肝、腎經(jīng)，具有補血活血、通絡強筋骨的功效，常用于調理月經(jīng)不調、麻木癱瘓、風濕痹痛等[6]，總黃酮為雞血藤中的活性成分之一[7]。有研究報道雞血藤總黃酮對缺血組織損傷有一定保護作用[8]，且對脊髓損傷有一定治療作用[9]?；诖?，筆者推測雞血藤總黃酮可能通過調控Notch/NF-κB通路對卒中后吞咽中樞神經(jīng)損傷有一定改善作用，本研究建立卒中吞咽困難大鼠模型，對此進行驗證，以期為雞血藤總黃酮的開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級同遺傳背景SD雄性大鼠60只，體重200～220 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2018-0002。所有大鼠于本院動物房中飼養(yǎng)，自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%，噪音低于80分貝，保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，實驗動物符合3R原則。

1.2 儀器與試劑

雞血藤總黃酮(貨號 B20527，規(guī)格20 mg，純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；Notch通路激活劑(Jagged1，貨號 HY-P1846)購自美國R&D Systems公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，貨號0765)購自上海研卉生物科技有限公司；Notch、多毛/增強分裂因子(Hes1)、p-NF-κBp65、NF-κBp65、促凋亡基因(Bax)等抗體(貨號ab8925、ab108937、ab76302、ab16502、ab32503)等均購自美國Abcam公司；P物質(substance P，SP)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號CSB-E08361)購自上海振譽生物科技有限公司；血清降鈣素基因相關肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP，貨號YS-E8537)購自上海研生實業(yè)有限公司；SP免疫組織化學抗體(貨號ab203329)購自美國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶(貨號P0768、P0231)均購自美國Pierce 公司。手動輪轉式切片機(型號RM2125RTS)購自德國Leica公司；光學顯微鏡(型號SMZ745)購自日本尼康公司；蛋白電泳儀、半干轉膜儀(型號1659001、Trans-Blot SD)購自美國Bio-Rad公司；化學發(fā)光儀(型號GIS-500)購自杭州米歐儀器公司。

1.3 方法

1.3.1模型建立及分組

將大鼠分為假手術組、模型組、雞血藤總黃酮組(20 g/kg)、Jagged1組(25 ng/kg)、雞血藤總黃酮+Jagged1組(20 g/kg+25 ng/kg)，每組12只。除假手術組外其余各組均參照文獻[10]用線栓法短暫性阻塞大腦中動脈90 min建立卒中后吞咽困難模型。將大鼠禁食不禁水12 h后用3%戊巴比妥鈉麻醉，固定于鼠板上，頸部備皮，于頸中線做約1.5 cm縱向切口，鈍性分離并暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，用提前消過毒的尼龍線線栓結扎頸總動脈、頸外動脈近心端，并在頸總動脈靠近頸外動脈、頸內(nèi)動脈分叉處預留活結，用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈。用2 mL注射器針頭輔助尼龍線線栓插入頸總動脈，拔出針頭，繼續(xù)插入線栓，松開頸內(nèi)動脈動脈夾，使線栓于分叉處進入頸內(nèi)動脈18～20 mm，于遠心端預留活結處結扎頸總動脈，用于固定線栓。逐層縫合切口，留置于外的線栓尾端用油性筆涂黑，并給予大鼠4萬單位青霉素腹腔注射，取側臥位放置于保溫毯上。計時90 min后將線栓拔出約1 cm，剪去拔出部分的線栓，完成手術(術中無死亡)。假手術組除不插入線栓外，其余手術過程與模型組相同。

術后第2天開始干預給藥，雞血藤總黃酮及Jagged1參照文獻[9，11]設置劑量，并用生理鹽水及磷酸鹽緩沖溶液稀釋成濃度為2 g/mL、2.5 ng/mL的溶液，按10 mL/kg的劑量給藥，雞血藤總黃酮+Jagged1組注射雞血藤總黃酮溶液的同時給予Jagged1溶液，假手術組、模型組均經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水及磷酸鹽緩沖溶液。連續(xù)給藥14 d，每天1次，末次給藥30 min后取材，進行后續(xù)試驗。

1.3.2大鼠吞咽次數(shù)及吞咽反應時間檢測

各組大鼠末次給藥30 min后，用戊巴比妥鈉麻醉，于頸部中線切長約1 cm的切口，暴露二腹肌前腹，將張力轉換器一端連接二腹肌前腹，另一端與生物信號轉換器相連。經(jīng)大鼠口腔插入直徑約0.5 mm軟管直達舌根部，用微量注射泵以3 μL/s的速度注入蒸餾水30 s，停止1 min后再次注射，重復此操作3次，用生物信號采集系統(tǒng)記錄吞咽次數(shù)及從蒸餾水刺激開始至第1次吞咽發(fā)生的時間即吞咽反應時間。

1.3.3大鼠腦梗死體積檢測

各組大鼠測完吞咽次數(shù)及吞咽反應時間后，立即取腹主動脈血3 mL，離心分離后取血清，置于-20 ℃冰箱保存，備用。用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注取腦，各組均隨機取6只大鼠腦組織標本，去除小腦和間腦組織，剝離孤束核所在部位的延髓組織，剪取部分置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，其余孤束核延髓組織置于4%多聚甲醛中固定備用。剩余6只大鼠取完整腦組織，置于-20 ℃中冰凍待組織凍硬后，在冰上將大腦由前向后做冠狀切片。放入質量分數(shù)為2%的TTC染液中，37 ℃避光染色20 min，隔10 min翻動1次。紅色為正常組織，白色為梗死灶。染色完成后，于質量分數(shù)為4%的多聚甲醛中固定，4 ℃過夜后拍照。用Image J 1.41軟件統(tǒng)計每個腦片梗死面積及正常組織面積，并計算梗死體積百分比：V%=(A1+A2+…+An)/(B1+B2+…+Bn)，A為每個腦片梗死區(qū)域面積，B為每個腦片梗死側大腦半球面積，n為腦片序號。

1.3.4大鼠血清神經(jīng)肽SP、CGRP水平檢測

取1.3.3中-20 ℃保存的血清組織于4 ℃條件下解凍后，按ELISA試劑盒說明書檢測SP、CGRP水平。

1.3.5大鼠孤束核延髓組織神經(jīng)細胞凋亡檢測及SP陽性表達檢測

取1.3.3中4%多聚甲醛溶液中固定24 h的孤束核延髓組織，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋后切成5 μm切片，取部分切片并經(jīng)脫蠟、脫水、3% H2O2滅活，按TUNEL試劑盒說明書進行染色、孵育、封閉、蘇木素復染、封片后，于顯微鏡下觀察切片中神經(jīng)細胞凋亡情況(細胞核染成棕褐色顆粒者為凋亡細胞)，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。取剩余部分切片，進行脫蠟、水化、抗原修復后，加入一抗抗體(SP，1∶500)室溫孵育過夜，TBST漂洗后，加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h、TBST漂洗后，加DAB顯色劑，蘇木精溶液復染、透明、封片后于400倍光鏡下拍照，每個切片隨機取5個視野，采用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)分析孤束核區(qū)域積分光密度值及圖像面積，計算陽性反應物質平均光密度，結果以5個視野陽性表達的平均光密度值表示。

1.3.6Western blot法檢測孤束核延髓組織Notch、Hes1、p-NF-κBp65/NF-κBp65、Bax蛋白表達

取1.3.3中-80 ℃保存的孤束核延髓組織于4 ℃冰箱中解凍后，用組織勻漿器勻漿，離心分離后取上清液，用蛋白提取試劑盒及蛋白定量BCA試劑盒提取并檢測蛋白總濃度。取50 μg蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗[Notch、Hes1、p-NF-κBp65、NF-κBp65、Bax、β-actin(內(nèi)參)]，除內(nèi)參抗體稀釋倍數(shù)為1∶2 000外，其余抗體均為1∶1 000。4 ℃搖床室溫孵育過夜，TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1∶2 000)，37 ℃搖床室溫孵育1 h，TBST清洗3次后，采用增強化學發(fā)光法顯色，以化學發(fā)光儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 大鼠吞咽次數(shù)及吞咽反應時間比較

與假手術組相比，模型組大鼠吞咽次數(shù)減少(P<0.05)，吞咽反應時間增加(P<0.05)。與模型組相比，Jagged1組大鼠吞咽次數(shù)減少(P<0.05)，吞咽反應時間增加(P<0.05)；雞血藤總黃酮組大鼠吞咽次數(shù)增加(P<0.05)，吞咽反應時間減少(P<0.05)。雞血藤總黃酮+Jagged1組大鼠吞咽次數(shù)、吞咽反應時間與雞血藤總黃酮組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠吞咽次數(shù)及吞咽反應時間比較

2.2 大鼠血清SP、CGRP水平比較

與假手術組相比，模型組大鼠血清SP、CGRP水平降低(P<0.05)。與模型組相比，Jagged1組大鼠血清SP、CGRP水平降低(P<0.05)，雞血藤總黃酮組大鼠血清SP、CGRP水平升高(P<0.05)。雞血藤總黃酮+Jagged1組大鼠血清SP、CGRP水平與雞血藤總黃酮組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清SP、CGRP水平比較

2.3 大鼠腦梗死體積比較

與假手術組相比，模型組大鼠腦梗死體積增大(P<0.05)。與模型組相比，Jagged1組大鼠腦梗死體積增大(P<0.05)，雞血藤總黃酮組腦梗死體積縮小(P<0.05)。雞血藤總黃酮+Jagged1組腦梗死體積與雞血藤總黃酮組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與假手術組比較； b：P<0.05，與模型組比較； c：P<0.05，與雞血藤總黃酮組比較。

2.4 大鼠孤束核延髓組織神經(jīng)細胞凋亡情況

假手術組大鼠孤束核延髓組織幾乎無神經(jīng)細胞凋亡。模型組大鼠可見孤束核延髓組織中神經(jīng)細胞凋亡率升高(P<0.05)。與模型組比較，Jagged1組神經(jīng)細胞凋亡率升高(P<0.05)，雞血藤總黃酮組神經(jīng)細胞凋亡率降低(P<0.05)。雞血藤總黃酮+Jagged1組神經(jīng)細胞凋亡率與雞血藤總黃酮組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 各組大鼠孤束核延髓組織TUNEL染色(×400)

a：P<0.05，與假手術組比較； b：P<0.05，與模型組比較； c：P<0.05，與雞血藤總黃酮組比較。

2.5 各組大鼠孤束核延髓組織SP陽性表達情況

假手術組大鼠孤束核延髓組織SP呈強陽性表達。模型組大鼠孤束核延髓SP陽性表達水平降低(P<0.05)。與模型組相比，Jagged1組孤束核延髓SP陽性表達水平降低(P<0.05)，雞血藤總黃酮組孤束核延髓SP陽性表達水平升高(P<0.05)。雞血藤總黃酮+Jagged1組SP陽性表達水平與雞血藤總黃酮組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠孤束核延髓組織SP免疫染色(×200)

a：P<0.05，與假手術組比較； b：P<0.05，與模型組比較； c：P<0.05，與雞血藤總黃酮組比較。

2.6 各組大鼠延髓孤束核組織Notch、Hes1、p-NF-κBp65/NF-κBp65、Bax蛋白表達比較

與假手術組相比，模型組大鼠孤束核延髓組織Notch、Hes1、p-NF-κBp65/NF-κBp65、Bax蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組相比，Jagged1組大鼠孤束核延髓組織Notch、Hes1、p-NF-κBp65/NF-κBp65、Bax蛋白表達升高(P<0.05)，雞血藤總黃酮組大鼠孤束核延髓組織Notch、Hes1、p-NF-κBp65/NF-κBp65、Bax蛋白表達降低(P<0.05)。雞血藤總黃酮+Jagged1組大鼠上述指標與雞血藤總黃酮組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6、7。

A：假手術組；B：模型組；C：Jagged1組；D：雞血藤總黃酮組；E：雞血藤總黃酮+Jagged1組。

a：P<0.05，與假手術組比較； b：P<0.05，與模型組比較； c：P<0.05，與雞血藤總黃酮組比較。

3 討 論

大腦中動脈及其分支的血栓栓塞是導致卒中發(fā)生的主要原因之一，中動脈線栓阻塞法是動物卒中模型的常見造模方法[12]。吞咽屬于神經(jīng)調節(jié)行為，大腦左側及右側半球損傷均可引起孤束核組織神經(jīng)的損傷，在神經(jīng)受到刺激或損傷后，中樞端和外周端神經(jīng)末梢釋放SP、CGRP等神經(jīng)肽，產(chǎn)生和傳遞感覺[13-14]。研究顯示，SP水平是維持吞咽反射的重要因子，SP水平降低與吞咽反射減弱關系密切，CGRP可減少大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡，對缺血神經(jīng)元具有保護作用[15-16]。本研究用線栓阻斷大腦中動脈血供90 min，14 d后檢測到大鼠吞咽次數(shù)顯著少于假手術組，吞咽反應時間及腦梗死體積明顯多于假手術組，與文獻[10]結果一致，提示卒中吞咽困難造模成功。另外，本研究觀察到模型大鼠伴隨吞咽中樞孤束核組織神經(jīng)細胞凋亡、血清SP、CGRP水平降低及孤束核組織中SP陽性表達降低，提示抑制孤束核組織神經(jīng)細胞凋亡可能有利于改善吞咽困難。

中醫(yī)將卒中后吞咽困難歸屬于“中風”“喑俳”“喉痹”等范疇，認為卒中后吞咽困難病位在腦，病變常涉及肝、脾、腎等，風、痰、火、瘀及肝臟陰陽失調等是卒中后吞咽困難發(fā)生、發(fā)展的主要病理因素[17-18]。研究證實，中藥雞血藤歸肝、腎經(jīng)，是一種傳統(tǒng)的活血化瘀藥，可廣泛應用于冠心病、腦梗死、肢體動脈硬化閉塞癥等，且其造血和活血作用對麻木癱瘓、風濕痹痛等有一定緩解作用[7]。本研究結果顯示，雞血藤總黃酮組大鼠腦梗死體積、吞咽反應時間、吞咽中樞神經(jīng)細胞凋亡率明顯少于模型組，與吞咽傳遞相關的神經(jīng)遞質SP、CGRP水平及SP陽性表達、吞咽次數(shù)均顯著高于模型組，提示雞血藤總黃酮對卒中后吞咽中樞神經(jīng)損傷有一定改善作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠吞咽中樞組織Notch及其靶基因Hes1、p-NF-κBp65、Bax表達異常升高，給予Jagged1激活Notch信號后，大鼠腦梗死體積增加、吞咽中樞神經(jīng)細胞凋亡、吞咽次數(shù)減少、吞咽反應時間延長及吞咽傳遞神經(jīng)遞質釋放及表達減少進一步加重。WANG等[19]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞損傷后Notch信號通路處于激活狀態(tài)，阻斷Notch信號可促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元。Notch信號通路激活可提高靶基因Hes1表達和NF-κB蛋白磷酸化水平，上調Bax等促凋亡基因表達，加重神經(jīng)元損傷[20-21]。另外，研究顯示，抑制Notch信號通路激活對缺血性卒中起腦保護作用[19]。本研究結果顯示，雞血藤總黃酮可抑制大鼠吞咽中樞組織Notch、Hes1、Bax蛋白表達及NF-κBp65磷酸化水平，明顯緩解腦梗死及吞咽困難障礙，然而上述作用可被Jagged1逆轉，推測雞血藤總黃酮可能通過抑制Notch/NF-κB通路，減輕中樞神經(jīng)凋亡，進而抑制卒中后吞咽困難障礙的發(fā)展。

綜上所述，雞血藤總黃酮可能通過抑制Notch/NF-κB通路，抑制吞咽中樞神經(jīng)凋亡及損傷，緩解卒中后吞咽困難障礙的發(fā)展。但卒中吞咽中樞神經(jīng)的調節(jié)作用復雜，可能涉及其他通路，雞血藤總黃酮緩解卒中后吞咽困難障礙發(fā)展的其他分子生物學機制有待后續(xù)深入研究。