汪尊冬 綜述,劉維琴 審校

(貴州中醫(yī)藥大學，貴陽 550025)

微小RNA是由18～25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，它首次由LEE等在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)[1]。研究[2-3]表明，微小RNA在不同類型的組織和細胞中都有表達，其非調(diào)控表達對健康和疾病有重要影響。微小RNA通過與其靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)堿基配對結(jié)合抑制mRNA翻譯或沉默目的基因，從而達到抑制靶基因表達的目的。AKERMAN等[4]發(fā)現(xiàn)，1個微小RNA可以調(diào)控多個mRNA，而同1個mRNA可以是多個微小RNA的靶目標，所以微小RNA調(diào)控蛋白的途徑是非常復(fù)雜的。微小RNA與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病發(fā)病息息相關(guān)，通過介導(dǎo)細胞增殖、凋亡來抑制或促進疾病進展[5]。本文對微小RNA在心房顫動(簡稱房顫)發(fā)生和維持中的作用機制進行闡述。

1 微小RNA與電重構(gòu)

電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)是房顫的基礎(chǔ)，而微小RNA通過介導(dǎo)離子通道重構(gòu)、纖維化在電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用。

房顫發(fā)生后數(shù)小時內(nèi)離子通道發(fā)生重構(gòu)，其特征是L型鈣電流和瞬時外向電流顯著下調(diào)，內(nèi)向整流鉀電流和乙酰膽堿依賴性鉀電流上調(diào)。這些改變縮短了動作電位時程(APD)和有效不應(yīng)期(ERP)，隨著波長的縮短則有利于房顫的誘發(fā)和維持[6]。

1.1 Ca2+通道

房顫初期，心肌細胞反復(fù)除極導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+超載，從而引起離子通道的改變，故心房肌內(nèi)鈣超載被認為是房顫患者心房電重構(gòu)的始動因素。在人心臟上表達的Ca2+通道蛋白的種類主要為L型鈣通道蛋白(LTCC)和T型鈣通道蛋白，而在維持“鈣穩(wěn)態(tài)”中發(fā)揮主要作用的是LTCC。房顫時細胞內(nèi)鈣超載，機體在自身保護機制作用下，L型電壓依賴性鈣通道亞基α1C和L型電壓依賴性鈣通道亞單位β1和β2(Cavβ1/2)的表達降低以減少細胞對Ca2+的攝入，而這一改變可能導(dǎo)致動作電位持續(xù)時間的縮短，有利于房顫的誘發(fā)和維持[6]。而在Ca2+通道改變的過程中，有許多微小RNA參與其中。

1.1.1miR-328

LU等[7]的研究結(jié)果顯示，房顫犬模型的miR-328水平升高了3.9倍，房顫患者的miR-328水平升高了3.5倍。計算機預(yù)測，LTCC上的α1C和β1亞基的基因CACNA1C和CACNB1分別是miR-328的潛在靶點。他們又通過腺病毒轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)基因方法使得miR-328在犬模型上過表達，這一結(jié)果提示房顫易感性增強，而L型鈣電流減弱，心房動作電位時間縮短。當使用miR-328抑制劑時上述結(jié)果得到了反轉(zhuǎn)。MCMANUS等[8]的研究也得到了類似的結(jié)果，房顫患者循環(huán)miR-328表達上調(diào)，調(diào)節(jié)LTCC密度，縮短心房有效不應(yīng)期，增強房顫易感性。又有研究指出，房顫期間心房中CACNA1C和CACNA2B的表達降低，而miR-328升高，且伴隨年齡的增加，miR-328表達升高[9]。LI等[10]分別將miR-328模擬物和miR-328抑制劑注射入新西蘭大白兔右心房并快速起搏右心房，房顫模型建立7 d后檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，miR-328模擬物組心房有效不應(yīng)期顯著降低，而miR-328抑制劑組的心房有效不應(yīng)期顯著增加；在原代心肌細胞中通過調(diào)整miR-328的表達水平，發(fā)現(xiàn)CACNA1C蛋白表達趨勢與miR-328表達趨勢相反。

1.1.2miR-208a/b

1.1.3miR-21

miR-21在房顫患者中表達明顯升高，與Ca2+亞單位α1C、β2(CACNA1C、CACNB2)表達呈負相關(guān)。miR-21轉(zhuǎn)染HL-1細胞后，L型鈣通道電流性質(zhì)改變與房顫患者心房肌細胞L型鈣通道電流相似，均明顯降低[12]。

1.1.4miR-499

LING等[13-14]前期研究發(fā)現(xiàn)，在房顫患者右心耳組織中發(fā)現(xiàn)miR-499表達顯著上升； 該研究之后的研究發(fā)現(xiàn)，與無房顫病史的竇性心律患者相比，永久性房顫患者心房肌CACNB2蛋白表達顯著下調(diào)67%，且CACNB2蛋白的表達水平明顯低于無房顫病史的竇性心律患者。結(jié)合微小RNA預(yù)測工具，猜測CACNB2是miR-499的靶基因，通過調(diào)控蛋白參與L型鈣電流電重構(gòu)。LING將miR-499模擬物與miR-499抑制劑分別轉(zhuǎn)染入HL-1細胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-499的細胞中，CACNB2蛋白表達顯著下調(diào)75%，而轉(zhuǎn)染抑制劑的細胞中CACNB2蛋白表達上調(diào)2倍以上。然而在轉(zhuǎn)染過程中檢測發(fā)現(xiàn)，CACNB2 mRNA表達無明顯變化，提示miR-499下調(diào)心肌細胞CACNB2的表達可能是由于抑制了蛋白質(zhì)合成，下調(diào)LTCC亞單位參與電重構(gòu)。

1.2 鉀通道

人體心房、心室細胞上的鉀離子通道可分為電壓依賴性和受體啟動性兩大類型。其中，電壓依賴性鉀離子通道包括內(nèi)向整流鉀離子通道、瞬時外向整流鉀離子通道和延遲整流鉀離子通道3種。Kir2.1蛋白和內(nèi)向整流鉀電流上調(diào)是房顫相關(guān)離子重塑的一個標志；乙酰膽堿依賴性鉀電流介導(dǎo)迷走神經(jīng)對心率和心房復(fù)極的影響，其激活可縮短動作電位(AP)時程，引起超極化，對于房顫的誘發(fā)和維持有很大影響[15]。

1.2.1miR-1

miR-1是一種肌肉特異性表達的miRNA，在人心肌和骨骼肌中含量豐富[16]。GIRMATASION等[17]經(jīng)過對62例左房組織樣本(31例房顫)的檢測，在房顫患者的組織樣本中，miR-1的表達減少了約86%，而Kir2.1 mRNA(基因KCNJ2)顯著增加。體外快速刺激人心房組織也得到上述類似結(jié)果。BILLCZKI等[9]的實驗結(jié)果與上述研究一致，內(nèi)向整流鉀電流和Kir2.1蛋白表達隨房顫的發(fā)生而升高，miR-1的表達卻相反。JIA等[18]對家兔行起搏器起搏1周后檢測得到的結(jié)果卻與上述結(jié)果有所不同。起搏器起搏1周后，家兔心房組織中的miR-1表達增加，心房有效不應(yīng)期縮短，延遲整流鉀電流通道(Iks)顯著增加。體內(nèi)感染慢病毒后過表達miR-1使得心房有效不應(yīng)期縮短，Iks增加；使用抗miR-1抑制劑寡核苷酸(AMO-1)后可逆轉(zhuǎn)上述作用。熒光素酶活性測定證實KCNE1和KCNB2為miR-1的靶基因，KCNE1和KCNQ1編碼緩慢激活的Iks。緩慢激活的Iks在動作電位平臺的后期起作用，當Iks 增加時復(fù)極加快，動作電位時程(APD)縮短。miR-1表達增加可抑制KCNE1和KCNB2的表達，縮短右心房的有效不應(yīng)期，增加房顫的易感性。

1.2.2miR-499

LING等[13]研究發(fā)現(xiàn)，永久性房顫患者右心耳中SK3蛋白的表達下降約46%，miR-499表達上升約2.33倍。使用預(yù)測工具提示與其他微小RNA相比，miR-499在靶向KCNN3方面的預(yù)測得分更高，熒光素酶報告顯示KCNN3在其3′UTR中包含1個保守序列，與miR-499的種子位點互補。將miR-499模擬物與抑制劑分別轉(zhuǎn)染HL-1細胞發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-499的細胞中SK3蛋白表達下降，而轉(zhuǎn)染miR-499抑制劑的細胞中SK3蛋白表達上升，這些結(jié)果都提示SK3受miR-499的調(diào)控。miR-499的種子序列在小鼠KCNN3和人KCNN3的3個轉(zhuǎn)錄本之間高度保守。因此，根據(jù)miR-499種子序列，人KCNN3的3個轉(zhuǎn)錄本可能都是miR-499的靶標。這一系列結(jié)果提示miR-499靶基因KCNN3調(diào)控的SK3可能參與房顫電重構(gòu)的過程。

1.2.3miR-26a/b

miR-26a/b的表達在犬房顫模型及房顫患者中均明顯減少(>50%)，與此同時發(fā)現(xiàn)Kir2.1蛋白和KCNJ2 mRNA的表達水平在房顫犬模型和患者中都增加。研究者將miR-26轉(zhuǎn)染入H9C2中，與對照細胞相比，Kir2.1蛋白的表達明顯下調(diào)；當使用AMO-26后可逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。用全細胞膜片鉗檢測細胞電位時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-26后的內(nèi)向整流鉀電流減少；使用AMO-26a后抑制了內(nèi)向整流鉀電流的減少[19]。研究者通過上述實驗表明，miR-26的靶基因為KCNJ2，通過調(diào)整Kir2.1蛋白的表達，促進或抑制內(nèi)向整流鉀電流來影響房顫電重構(gòu)。DU等[20]為研究長非編碼RNA(lncRNA)TCONS-00106987在房顫發(fā)病中的作用發(fā)現(xiàn)，心房注射過表達TCONS-00106987病毒的新西蘭大白兔的心房有效不應(yīng)期(AERP)縮短，房顫誘發(fā)性增加；而TCONS-00106987抑制劑組的結(jié)果則相反。根據(jù)生物信息學研究結(jié)果，TCONS-00106987包含miR-26的結(jié)合位點。將TCONS-00106987與miR-26共轉(zhuǎn)染原代心肌細胞后發(fā)現(xiàn)，miR-26可以部分逆轉(zhuǎn)TCONS-00106987過表達引起的KCNJ2表達上調(diào)；而TCONS-00106987轉(zhuǎn)染組中的KCNJ2表達明顯增加。

1.2.4miR-30d

MORISHIMA等[21]檢測了33例(房顫14例)右心耳組織樣本，同時分離的新生大鼠心肌細胞。實驗者使用miRNA微陣列平臺，發(fā)現(xiàn)miR-30d和miR-499-5p在心肌細胞中高表達，進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-30d是負責離子通道重構(gòu)的候選miRNA。miR-30d可能的靶基因是KCNJ3，且與miR-30d呈負相關(guān)。在房顫患者心肌細胞中，miR-30d表達增加，而miR-30d靶基因KCNJ3表達減少。體外分離新生大鼠心肌細胞后過表達miR-30d，結(jié)果顯示抑制心肌細胞KCNJ3mRNA和Kir3.1蛋白的表達，進而抑制乙酰膽堿依賴性鉀電流的表達。相反，miR-30d基因敲除可上調(diào)KCNJ3 mRNA和Kir3.1蛋白水平。

1.3 鈉通道

心臟鈉通道傳導(dǎo)的電流負責心肌細胞的快速去極化，對維持心臟的脈沖傳導(dǎo)至關(guān)重要。心肌鈉通道由成孔α亞基和輔助調(diào)節(jié)β亞基組成。α亞基由SCN5A基因編碼；大多數(shù)影響心臟鈉通道的突變都位于該基因上[22]。SCN5A基因編碼心臟鈉通道NaV1.5，當此基因突變或轉(zhuǎn)錄異常時，可以引發(fā)許多疾病例如：長QT綜合征、Brugada綜合征、房顫等[22-24]。

miR-192-5p：ZHAO等[24]在檢測了風濕性瓣膜病房顫患者和對照組風濕性瓣膜病患者左心耳組織后發(fā)現(xiàn)，miR-192-5p與人SCN5A的3′-UTR結(jié)合，負向調(diào)節(jié)NaV1.5的表達，降低INa濃度。為了進一步確認miR-192-5p、SCN5A/ NaV1.5的關(guān)系，研究者分別將miR-192-5p模擬物和陰性對照miRNA模擬物轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細胞、人結(jié)腸腺癌細胞和人胚胎腎細胞。實時熒光定量PCR分析顯示，與陰性對照模擬物相比，miR-192-5p模擬物顯著降低了SCN5A mRNA的表達水平，降幅為17%；Western blot分析表明，miR-192-5p模擬物與陰性對照模擬物相比顯著降低了NaV1.5蛋白的表達水平66%。研究者用miR-192-5p反義寡核苷酸探針對房顫患者的左心耳進行原位雜交，房顫患者miR-192-5p的表達較非房顫患者顯著上調(diào)1.6倍。miR-192-5p與SCN5A的3′-UTR結(jié)合，抑制NaV1.5的表達，降低INa濃度，在房顫誘發(fā)和維持中發(fā)揮作用。

2 微小RNA與結(jié)構(gòu)重構(gòu)

電重構(gòu)是房顫發(fā)生初始階段的病理改變，而結(jié)構(gòu)重構(gòu)是房顫得以長期維持的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是心房最明顯的改變[25]。心房擴張、心房纖維化是房顫結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要特征。心房纖維化可能導(dǎo)致傳導(dǎo)速度減慢、傳導(dǎo)阻滯以促進折返，增加房顫的易感性[26]。房顫組織電鏡顯示心房纖維方向混亂，線粒體數(shù)量增多和體積增加，細胞核增大，肌漿網(wǎng)和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均有異常[27]。心房纖維化是多種心臟損傷纖維增殖信號通路共同作用的結(jié)果，血管緊張素Ⅱ、醛固酮和轉(zhuǎn)生化長因子-β1(TGF-β1)對于纖維化有很大的促進作用[25]。

2.1 miR-21

心肌成纖維細胞的增殖在房顫患者的心肌纖維化和心房重構(gòu)中起到了重要作用。與竇性心律組相比，房顫患者miR-21表達增加，而WW結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(WWP-1)表達降低；轉(zhuǎn)染miR-21模擬物的心臟成纖維細胞可增加miR-21的表達，降低WWP-1的表達，而轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后所起作用則相反[28]。另一研究[29]表明，快速心房起搏家兔可通過miR-21下調(diào)Smad7誘導(dǎo)心肌纖維化。轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，Smad7的表達明顯增加，而Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達明顯降低。成年大鼠心肌成纖維細胞用TGF-β1處理后發(fā)現(xiàn)miR-21表達增加，Smad7表達下降；使用TGF-β1抑制劑后可降低miR-21表達[29]。miR-21通過TGF-β1/Smad7信號通路介導(dǎo)房顫心房纖維化。ADAM等[30]、CARDIN等[31]、CAO等[32]的實驗也得到類似結(jié)果。

2.2 miR-132

與對照組相比，miR-132在犬和人房顫標本中表達下調(diào)，結(jié)締組織生長因子(CTGF)mRNA及蛋白的表達均上調(diào)[33]。為進一步確認miR-132與CTGF蛋白之間的關(guān)系，QIAO等[33]分別將miR-132、miR-132抑制劑及陰性對照轉(zhuǎn)染入SD大鼠的心臟成纖維細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照相比，轉(zhuǎn)染miR-132組CTGF mRNA表達下調(diào)；而轉(zhuǎn)染miR-132抑制劑組中miR-132表達下調(diào)，CTGF mRNA表達上升。此外，該研究團隊采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測到miR-132通過與CTGF的3-UTR結(jié)合而抑制CTGF的表達，可抑制心房纖維化進展。

2.3 miR-27b

WANG等[34]研究發(fā)現(xiàn)miR-27b是TGF-β1/ALK5/Smad-2/3信號通路的調(diào)節(jié)因子。研究者分別在動物及細胞層次進行實驗，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的房顫中miR-27b表達下調(diào)，過表達miR-27b通過調(diào)控靶基因ALK5/Smad-2/3信號通路表達抑制心房纖維化，這使得miR-27b成為一個治療心房纖維化的潛在靶點。

2.4 miR-133a-3p

YAO等[35]的研究表明，miR-133a-3p是MIAT(心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本)的靶基因。與假手術(shù)大鼠組相比，房顫誘導(dǎo)后MIAT的相對表達顯著增加；而miR-133a-3p的表達相對降低。使用慢病毒小發(fā)夾沉默MIAT組的房顫大鼠的AERP較房顫模型組的AERP明顯延長；而當使用含MIAT沉默基因與抑制miR-133a-3p表達的病毒共感染組大鼠的AERP明顯短于MIAT基因沉默組。與假手術(shù)組相比，右心房Mason膠原染色顯示房顫大鼠右心房膠原含量明顯增加，而MIAT基因敲除后房顫纖維化明顯減輕；而予以抑制miR-133a-3p表達的病毒轉(zhuǎn)染后顯著逆轉(zhuǎn)了通過敲除MIAT基因的緩解作用。MIAT/miR-133a-3p軸通過影響房顫大鼠纖維化相關(guān)基因Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、CTGF和TGF-β1的表達調(diào)節(jié)纖維化進展。

此外，miR-30c可抑制TGF-β1的表達，減少成纖維細胞的增殖、分化及膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白)的生成從而延緩心房纖維化的進程[36]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1受體3(TGFBR3)是miR-23b-3p和miR-27b-3p的靶基因，miR-23b-3p和miR-27b-3p通過靶向TGFBR3促進人心房成纖維細胞中Smad3的激活，從而促進心房纖維化，miR-23b-3p和miR-27b-3p可能是治療房顫的潛在靶點[37]。使用miR-96抑制劑后可通過上調(diào)靶向Klf13 mRNA減弱Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心臟成纖維細胞的增殖、遷移和膠原生成，這又為治療房顫提供了一個新可能[38]。

3 微小RNA與房顫治療

目前尚未有文獻報道將微小RNA運用于治療臨床上的房顫患者，而微小RNA更多的是進行房顫動物模型的治療。LI等[10]分別將miR-328類似物與抑制劑注射入家兔心肌組織后快速右心房快速起搏，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，抑制劑組心房有效不應(yīng)期顯著延長。WANG等[34]將含miR-27b的病毒注射入小鼠心包腔內(nèi)，然后使用血管緊張素構(gòu)建心肌纖維化模型，14 d后檢測發(fā)現(xiàn)，miR-27b病毒組心肌纖維化較空白病毒組明顯減輕。

4 結(jié) 語

心房顫動是一種發(fā)病機制十分復(fù)雜的心律失常，具體發(fā)病機制目前尚未完全明確，但是微小RNA在房顫的誘發(fā)和維持中的作用越來越得到重視。微小RNA在外周血中穩(wěn)定表達，操作簡便，易于獲得，對于房顫的診斷具有深遠意義。目前雖尚無運用微小RNA治療臨床房顫患者的文獻報道，但已有臨床試驗對微小RNA治療作用進行評估：使用miR-34類似物治療多發(fā)性實體瘤，miR-122抑制劑治療丙型肝炎，miR-103/107抑制劑治療糖尿病[39]等。隨著研究的不斷深入，對miRNA表達水平進行調(diào)控可以對房顫的進程進行干預(yù)，這為房顫新療法提供了新的可能。