李 彬，李素芬，楊 娜，熊 偉*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省高校臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

惡性胸膜間皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）為侵襲性高的罕見(jiàn)惡性腫瘤〔1〕。據(jù)報(bào)道MPM 的發(fā)病主要與石棉接觸相關(guān)，由于發(fā)達(dá)國(guó)家曾有悠久的石棉使用歷史，發(fā)展中國(guó)家目前仍在使用及生產(chǎn)石棉，因此MPM 的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)仍在逐年升高，發(fā)達(dá)國(guó)家中英國(guó)、澳大利亞等國(guó)發(fā)病率最高，發(fā)展中國(guó)家中中國(guó)發(fā)病率最高，其中，國(guó)內(nèi)發(fā)病率最高地區(qū)為云南省〔2-3〕。由于MPM 發(fā)病罕見(jiàn)，且目前診斷的通用檢查指標(biāo)是CT 或胸腔鏡活檢〔4〕，缺乏早期的診斷方法及標(biāo)志物，因此無(wú)法檢出早期的MPM 患者，導(dǎo)致了MPM 患者的預(yù)后較差〔5〕。因此，探索MPM 的發(fā)病機(jī)制，尋找輔助早期診斷的生物標(biāo)志物，對(duì)于提高患者的生存率至關(guān)重要。

血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondin，THBS）又稱(chēng)凝血酶敏感蛋白，其家族由THBS1、THBS2、THBS3、THBS4 和THBS5 5 個(gè)成員組成，是一種具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的鈣離子相關(guān)糖蛋白〔6〕。THBS2 是由內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的一種鈣結(jié)合蛋白，THBS2 參與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的構(gòu)建，可以與各種細(xì)胞表面受體、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和蛋白酶相互作用〔7-8〕，廣泛參與血管形成、細(xì)胞骨架的構(gòu)成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及凋亡等多種生物學(xué)進(jìn)程〔9〕。目前研究發(fā)現(xiàn)，THBS2 基因在結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、胃癌和肝細(xì)胞癌等多種腫瘤組織和血清中高表達(dá)，并且與腫瘤進(jìn)展和患者總體存活率密切相關(guān)。本研究基于多個(gè)腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)分析MPM組織中THBS2 基因的表達(dá)水平及其與MPM 患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為MPM 的臨床診斷、基因治療及預(yù)后分析提供理論參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 利用Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)分析基因在MPM 組織及正常組織中的表達(dá)Oncomine （ https：//www.oncomine.org）是大型腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)，可進(jìn)行不同腫瘤及正常組織中基因的表達(dá)差異分析，同時(shí)生成可視化圖譜。在Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)置搜索條件為：“Gene：THBS2”“Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis”“Cancer Type： Other Cancer：Mesothelioma -Pleural Malignant Mesothelioma”“SampleType：ClinicalSpecimen”，以獲取Gordon等〔10〕對(duì)MPM 的相關(guān)基因芯片研究數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

1.2 獲取TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中MPM 數(shù)據(jù)使用R 4.0.2 軟件，利用“cgdsr”函數(shù)包從美國(guó)公共癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcga-adtaa.nci.nih.gov/tcga/）中下載MPM 數(shù)據(jù)集“meso_tcga_pan_can_atlas_2018”，從中獲取SeqV2 代測(cè)序的mRNA 的表達(dá)結(jié)果“meso_tcga_pan_can_atlas_2018_rna_seq_v2_mrna”，將兩組數(shù)據(jù)通過(guò)對(duì)應(yīng)的TCGA 病例ID 進(jìn)行合并和預(yù)處理，刪除缺失數(shù)據(jù)。

1.3 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)MPM 數(shù)據(jù)集的處理及臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析通過(guò)R 4.0.2 軟件，使用“Epicalc”函數(shù)包分析MPM 數(shù)據(jù)集，其中包含87 例MPM 的樣本病例。根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析，MPM 組織樣本中THBS2 基因的表達(dá)量為363.125～94 156.8，中位數(shù)為11 676.7，以該基因表達(dá)量中位數(shù)為分界點(diǎn)，樣本THBS2 基因表達(dá)量低于中位數(shù)，定義為T(mén)HBS2 低表達(dá)；反之，定義為T(mén)HBS2 高表達(dá)。根據(jù)中位數(shù)分組，MPM 組織中THBS2 高表達(dá)組包含43例，低表達(dá)組包含44 例，進(jìn)行臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析。

1.4 利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)可視化分析MPM 臨床病理相關(guān)性UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個(gè)有效的惡性腫瘤數(shù)據(jù)在線(xiàn)挖掘和分析的網(wǎng)站，主要是基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)惡性腫瘤數(shù)據(jù)提供隊(duì)列數(shù)據(jù)的分析?？捎糜诜治瞿[瘤和正常組織之間基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，以及轉(zhuǎn)錄表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)〔11〕。使用UALCAN 的“表達(dá)分析”模塊和“MPM”數(shù)據(jù)集獲得了THBS2 基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。分析THBS2 基因在MPM 組織中的表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，并進(jìn)行可視化分析。

1.5 THBS2 基因mRNA 表達(dá)量與MPM 患者預(yù)后的相關(guān)性使用R 4.0.2 軟件“survival”和“survminer”函數(shù)包構(gòu)建Kaplan-Meier 模型并進(jìn)行Log-rank 法檢驗(yàn)，探究THBS2 基因mRNA 表達(dá)水平與MPM 患者總體生存率（overall survival，OS）及無(wú)疾病進(jìn)展生存率（disease-free survival，DFS）之間的關(guān)聯(lián)。

1.6 THBS2 基因與其他MPM 標(biāo)志物基因及THBS家族成員基因表達(dá)的相關(guān)性目前已知的MPM 腫瘤標(biāo)志物分別是表皮生長(zhǎng)因子含腓骨樣胞外基質(zhì)蛋白1 （epidermal growth factor containing fibulin like extracellular matrix protein 1，EFEMP1）、間皮素（mesothelin，MSLN）、鈣結(jié)合蛋白2（calcium binding protein 2，CALB2）、硫酸酯酶1（sulfatase 1，SULF1）、鈣粘蛋白11（cadherin 11，CDH11）和鋅指蛋白FOG 家族成員2（zinc finger protein，F(xiàn)OG family member 2，ZFPM2）等6 種〔11〕。此外，THBS基因家族還有其他4 個(gè)基因，分別為T(mén)HBS1、THBS3、THBS4 和THBS5。通 過(guò)GEPIA2 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）在線(xiàn)檢索和可視化分析THBS2 基因表達(dá)與其他基因表達(dá)的相關(guān)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析建立MPM 患者的臨床病理數(shù)據(jù)集，將患者的臨床病理數(shù)據(jù)進(jìn)行賦值，采用R 4.0.2軟件中的函數(shù)包進(jìn)行分析及繪圖。正常組織和MPM組織中THBS2 基因表達(dá)水平的組間比較采用t 檢驗(yàn)，用χ2檢驗(yàn)及Fisher 精確概率法分析收集到的臨床病理因素。生存分析使用Kaplan-Meier 模型和Log-rank 法檢驗(yàn)。單因素和多因素分析使用COX回歸模型?；虮磉_(dá)的相關(guān)性采用Pearson 法進(jìn)行分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THBS2 基因在正常肺組織、正常胸膜組織及MPM 組織中的表達(dá)差異通過(guò)Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)分析THBS2 基因在正常肺組織、正常胸膜組織及MPM 組織中的mRNA 表達(dá)。結(jié)果表明，THBS2 基因在MPM 組織中的表達(dá)均明顯高于正常肺組織及正常胸膜組織，差異倍數(shù)為2.368，組間差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.185，P=0.004）。見(jiàn)圖1。

圖1 THBS2 基因在MPM 組織與正常組織中的表達(dá)差異

2.2 MPM 組織中THBS2 基因mRNA 表達(dá)量與臨床病理參數(shù)相關(guān)性從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取并整理得到的87 例MPM 臨床資料中，患者年齡28～81歲，中位年齡64 歲；男性71 例，女性16 例，統(tǒng)計(jì)相關(guān)的臨床病理參數(shù)。THBS2 基因mRNA 表達(dá)量與MPM 患者的年齡、性別、AJCC 分期、T 分期、N 分期、M 分期和腫瘤類(lèi)型等臨床病理參數(shù)之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 THBS2 基因mRNA 表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性（n=87）

2.3 MPM 組織中THBS2 表達(dá)量與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)可視化分析THBS2 基因表達(dá)量與MPM 組織中的TP53 突變、腫瘤類(lèi)型、AJCC 分期、N 分期之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，MPM 患者中THBS2 基因表達(dá)量在腫瘤N0 與N3 分期、N2 與N3 分期、N1 與N3 分期之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 THBS2 基因mRNA 在不同臨床病理參數(shù)的MPM 組織中表達(dá)量

2.4 THBS2 基因mRNA 表達(dá)量對(duì)MPM 患者預(yù)后的影響通過(guò)R 4.0.2 軟件構(gòu)建Kaplan-Meier 生存模型并進(jìn)行Log-rank 檢驗(yàn)。結(jié)果表明，MPM 患者THBS2 基因mRNA 表達(dá)量對(duì)于患者的OS 有顯著影響（P=0.015），THBS2 基因高表達(dá)組的中位生存時(shí)間相對(duì)于低表達(dá)組明顯縮短（15.4 月vs. 24.1月）。見(jiàn)圖3A。同時(shí)，THBS2 基因mRNA 的高表達(dá)預(yù)示著MPM 患者的DFS 較差（P=0.029），THBS2 基因mRNA 高表達(dá)組的中位生存時(shí)間相對(duì)于低表達(dá)組明顯縮短（12.7 月vs.18.0 月）。見(jiàn)圖3B。THBS2基因mRNA 的高表達(dá)預(yù)示著MPM 患者的預(yù)后不良。

圖3 THBS2 基因mRNA 表達(dá)量對(duì)MPM 患者預(yù)后的影響

2.5 影響MPM 患者預(yù)后因素的單因素及多因素分析對(duì)87 例MPM 患者的臨床病理信息構(gòu)建COX回歸模型。單因素分析結(jié)果顯示，THBS2 基因表達(dá)量、腫瘤類(lèi)型與MPM 患者預(yù)后之間具有顯著相關(guān)性（P＜0.05），將上述有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素回歸分析。多因素回歸分析結(jié)果提示，THBS2 基因高表達(dá)與腫瘤類(lèi)型均是影響MPM 患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05），其中腫瘤類(lèi)型為上皮樣型的MPM患者預(yù)后優(yōu)于非上皮樣型MPM 患者（HR＜1.0）。見(jiàn)表2。

表2 影響MPM 患者預(yù)后的臨床病理參數(shù)單因素和多因素分析

2.6 THBS2 基因與MPM 腫瘤標(biāo)志物和其他THBS基因家族成員表達(dá)的相關(guān)性通過(guò)GEPIA2 數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)可視化分析MPM 腫瘤標(biāo)志物基因EFEPM1、MSLN、CALB2、SULF1、CDH11、ZFPM2 與THBS2 基因表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，THBS2 基因與CDH11基因的表達(dá)呈正相關(guān)（R＞0），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與CALB2 和MSLN 基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（R＜0），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與EFEMP1、SULF1 和ZFPM2 基因的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。此外，THBS 基因家族還有其他4 個(gè)成員THBS1、THBS3、THBS4 和THBS5，對(duì)THBS2 基因與它們的基因表達(dá)也進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，THBS2 基因的表達(dá)與THBS1、THBS3、THBS4 基因表達(dá)呈正相關(guān)（R＞0），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與THBS5 基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5。

圖4 THBS2 基因與MPM 腫瘤標(biāo)志物基因的表達(dá)相關(guān)性分析

圖5 THBS2 基因與THBS 基因家族其他成員的表達(dá)相關(guān)性分析

3 討論

MPM 是一種罕見(jiàn)的惡性侵襲性腫瘤，起源于胸膜腔的間皮細(xì)胞。MPM 潛伏期長(zhǎng)、病死率高，早期無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，因此大多數(shù)患者被確診時(shí)已是晚期〔12〕，后續(xù)治療無(wú)顯著療效。MPM 早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療等環(huán)節(jié)的技術(shù)比較欠缺，缺乏特異性高的腫瘤生物標(biāo)志物。THBS2 作為一種ECM 蛋白，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，其與惡性腫瘤的關(guān)系一直是研究的熱點(diǎn)。THBS2 屬于由內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌的基質(zhì)細(xì)胞鈣結(jié)合糖蛋白家族的一員，其與各種細(xì)胞表面受體、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和蛋白酶相互作用，參與運(yùn)動(dòng)、趨化性、血管抑制、傷口愈合和細(xì)胞基質(zhì)黏附等過(guò)程〔12〕。目前，有關(guān)THBS2 基因在多種不同類(lèi)型腫瘤中的表達(dá)及作用的研究結(jié)果尚存在爭(zhēng)議。一方面，有研究報(bào)道THBS2 基因在非小細(xì)胞肺癌〔13〕、胰腺癌〔14-15〕、結(jié)直腸癌〔16〕等腫瘤中顯著高表達(dá)。另一方面，還有研究報(bào)道THBS2 基因在胃癌〔17-18〕、宮頸癌〔19〕、乳腺癌〔20〕等腫瘤中呈現(xiàn)顯著低表達(dá)。THBS2 基因表達(dá)與MPM 發(fā)生發(fā)展的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究主要基于多個(gè)腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，通過(guò)R 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探討THBS2 基因表達(dá)量與MPM 患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性及其預(yù)后意義，并與已發(fā)現(xiàn)的MPM 腫瘤標(biāo)志物基因進(jìn)行基因表達(dá)相關(guān)性分析。研究結(jié)果顯示，相較于正常肺組織和胸膜組織，在MPM 組織中THBS2 基因的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著增高，結(jié)果提示THBS2 可能是與MPM 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的一個(gè)癌基因。通過(guò)構(gòu)建Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示，THBS2 基因的表達(dá)量與MPM 患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)，THBS2 基因高表達(dá)的MPM 患者OS 和DFS均顯著降低。通過(guò)構(gòu)建COX 回歸模型，結(jié)果提示THBS2 基因高表達(dá)及非上皮樣型MPM 是獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，導(dǎo)致MPM 患者的預(yù)后不良。綜上所述，THBS2 基因有望作為MPM 的診斷基因，通過(guò)檢測(cè)患者體內(nèi)THBS2 基因的表達(dá)水平，協(xié)助臨床的早期診斷和預(yù)后判斷。有研究指出，根據(jù)MPM 患者的不同臨床病理分型，上皮樣型的MPM 患者約占所有MPM 患者的80%，且上皮樣型患者的預(yù)后明顯優(yōu)于雙相混合型及肉瘤型患者〔21-22〕，這與本研究結(jié)果完全一致。結(jié)合其他文獻(xiàn)的報(bào)道〔11〕，本研究發(fā)現(xiàn)MPM 腫瘤標(biāo)志物CDH11 基因與THBS2 基因的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，CALB2 和MSLN 基因與THBS2基因的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，THBS 基因家族3個(gè)成員THBS1、THBS3、THBS4 的表達(dá)與THBS2 基因的表達(dá)均呈顯著正相關(guān)。以上結(jié)果提示，MPM 的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程較為復(fù)雜，是一個(gè)多基因共同作用的結(jié)果。因此，探索MPM 的發(fā)病機(jī)制，研究基因表達(dá)量與MPM 患者臨床病理特征的相關(guān)性，改善MPM患者的預(yù)后仍是今后臨床研究需要探索的方向。

本研究基于腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，樣本量相對(duì)較大，可信度較高，有一定的參考價(jià)值，但是本研究?jī)H局限于mRNA 水平上的研究，缺乏蛋白質(zhì)水平檢測(cè)。在后續(xù)研究中，可通過(guò)在臨床中采集MPM 樣本，利用免疫組化和蛋白質(zhì)印跡法等實(shí)驗(yàn)探明THBS2 在MPM 組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。同時(shí)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建敲低或過(guò)表達(dá)THBS2 基因的細(xì)胞模型，進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)MPM 細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡的影響，或者通過(guò)藥物實(shí)驗(yàn)，探索和制備THBS2 的小分子抑制劑和單克隆抗體，以期對(duì)MPM的臨床診療及預(yù)后評(píng)估提供潛在的新基因靶標(biāo)。