洪文娟，鄒久林，余卓銳，成家茂，何敏華*

（1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南大理 671000；3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2 抑制劑（sodium glucose cotransporter 2 inhibitor，SGLT2i）是一種新型口服降糖藥物，通過抑制近曲小管中葡萄糖共轉(zhuǎn)運體的活性，誘導(dǎo)糖尿、滲透性利尿，并降低葡萄糖的再吸收〔1〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，SGLT2i 不僅可以降血糖，還有降低血肌酐、減少蛋白尿以及由腎臟疾病引起死亡的作用〔2-3〕。隨著SGLT2i 在腎臟病領(lǐng)域的臨床應(yīng)用越來越廣泛，其不良反應(yīng)也日益受到重視。研究表明SGLT2i 卡格列凈可以提高骨轉(zhuǎn)移率，降低髖部的骨礦物質(zhì)密度，并增加骨折風(fēng)險〔4〕。糖皮 質(zhì) 激 素（glucocorticoid，GC） 是 腎 病 綜 合 征（nephrotic syndrome，NS）的首選用藥，但包括NS在內(nèi)的慢性腎臟病可引起鈣磷代謝紊亂，使用GC會加重鈣磷代謝異常，甚至引起骨質(zhì)疏松。目前，不同劑量SGLT2i 對鈣磷代謝的影響以及SGLT2i 聯(lián)用GC 是否加重骨質(zhì)疏松等問題尚無定論。本研究旨在考察不同劑量卡格列凈及聯(lián)用GC 對阿霉素腎?。╝driamycin nephropathy，AN）大鼠的治療效果以及對大鼠骨代謝的影響，為NS 的臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要藥物卡格列凈片（西安楊森制藥有限公司，批號：H20170375）；阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：H44024359）；潑尼松片（華中藥業(yè)股份有限公司，批號：H42021526）。

1.2 實驗動物造模及分組SPF 級雄性SD 大鼠42 只，8 周，體質(zhì)量250～300 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（川）2020-030。飼養(yǎng)在大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗室，自由攝食水。隨機選取6 只為對照（NG）組，其余36 只大鼠經(jīng)尾靜脈一次性注射阿霉素6 mg/kg，建立AN 大鼠模型〔5〕，NG 組注射等量0.9%氯化鈉溶液。7 d 后取大鼠眼內(nèi)眥靜脈血，造模大鼠出現(xiàn)低蛋白血癥（白蛋白ALB（18.34±1.65）g/L）、高脂血癥（甘油三酯（2.86±0.29）mmol/L，膽固醇（4.02±0.55）mmol/L）；檢測24 h 尿蛋白定量（24 h-UTP），大于100 mg 表示造模成功〔6〕。造模大鼠隨機分為6 組，每組6 只：模型（MG）組、潑尼松（PG）組、低劑量卡格列凈（LCG）組、高劑量卡格列凈（HCG）組、低劑量卡格列凈+潑尼松（LPCG） 組和高劑量卡格列凈+潑尼松（HPCG）組。

1.3 藥物干擾按常規(guī)用藥劑量：低劑量卡格列凈100 mg/d，高劑量卡格列凈300 mg/d，潑尼松1 mg/（kg·d），依據(jù)人與大鼠用藥量換算方法，PG 組予潑尼松6.3 mg/kg，LCG 組予卡格列凈10.5 mg/kg，HCG 組予卡格列凈31.5 mg/kg，LPCG 組予潑尼松6.3 mg/kg+卡格列凈10.5 mg/kg，HPCG 組予潑尼松6.3 mg/kg+卡格列凈31.5 mg/kg。藥片搗碎后，每天按大鼠空腹體質(zhì)量計算藥物劑量，用0.9%氯化鈉溶液配制成溶液，NG、MG 組予等量0.9%氯化鈉溶液，每天清晨8 時空腹灌胃，灌胃量1 mL/100 g，療程6 周。

1.4 一般情況觀察每天灌胃前觀察記錄大鼠的一般情況，包括精神、活動、進食、飲水、體毛、大小便、體質(zhì)量等。

1.5 尿液指標(biāo)檢測治療結(jié)束，將大鼠單獨放置于代謝籠，禁食不禁水，用清潔干燥的容器收集每只大鼠24 h 尿液并記錄總尿量。尿液標(biāo)本立即送大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，用全自動生化分析儀（7000120+ISE+ID 型）檢測24 h-UTP、尿鈣、尿磷。

1.6 骨密度及相關(guān)指標(biāo)檢測藥物治療6 周后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，采用仰臥位固定，送放射科用雙能X 射線骨密度儀（SIEMENS YS10 Max）檢測在體全身及區(qū)域骨密度、全身骨鹽量、全身脂肪量、全身肌肉量。

1.7 血液指標(biāo)檢測骨密度檢測后，全部大鼠在第2 天清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，開腹后下腔靜脈取血4 mL，3 000 r/min 離心10 min，提取上清液，檢測血鈣、血磷、ALB、堿性磷酸酶（ALP）。

1.8 統(tǒng)計分析用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示。方差齊者采用方差分析并進行兩兩比較；方差不齊者，采用秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 各組大鼠尿液指標(biāo)的比較灌胃治療6 周后檢測尿液指標(biāo)并進行比較。與NG 組比較，MG 組的24 h-UTP 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與MG 組比較，各用藥組24 h-UTP 水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；各用藥組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明各種藥物治療對降低24 h-UTP 水平均有效，2 種藥聯(lián)用與單獨使用相比，24 h-UTP 水平略有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與NG 組比較，各組尿鈣水平均有所上升，其中HCG、LPCG、HPCG 組尿鈣水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與MG 組比較，LPCG、HPCG 組尿鈣水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與PG組比較，HPCG 組尿鈣水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明高劑量卡格列凈或卡格列凈與潑尼松聯(lián)用可能會導(dǎo)致尿鈣排泄增加。與NG 組比較，MG組尿磷水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；其余各組尿磷水平雖有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示NS 本身可導(dǎo)致尿磷排泄增加，而卡格列凈或潑尼松對尿磷排泄影響不明顯。見表1。

表1 6 周后各組大鼠尿液相關(guān)指標(biāo)的比較（±s，n=6）

表1 6 周后各組大鼠尿液相關(guān)指標(biāo)的比較（±s，n=6）

注：與NG 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與MG 組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與PG 組比較#P＜0.05。

組別 24 h-UTP/mg 尿鈣/（mmol/L） 尿磷/（mmol/L）NG 組 9.33±2.67 1.47±0.46 15.97±2.43 MG 組 319.46±41.26** 2.52±1.91 43.20±2.88**PG 組 69.79±36.52△△ 2.78±1.15 37.80±9.14 LCG 組 38.07±24.56△△ 3.51±1.17 36.98±2.59 HCG 組 42.14±30.18△△ 4.60±1.84* 37.08±12.94 LPCG 組 32.51±32.62△△ 5.16±3.18**△ 38.92±7.36 HPCG 組 33.17±36.97△△ 5.77±3.11**△# 33.77±8.21 F 41.127 3.697 20.862 P 0.000 0.006 0.002

2.2 各組大鼠血液生化指標(biāo)的比較灌胃治療6周后檢測血液指標(biāo)并進行比較。與NG 組比較，MG組的ALB 水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與MG 組比較，PG、LCG、HCG、LPCG、HPCG組的ALB 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明各種藥物治療后均可有效升高血清ALB 水平。與NG 組比較，除MG 組外，其余各組血鈣水平均有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)差異。與NG 組比較，PG、HCG 組的血磷水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與MG 組比較，PG 組的血磷水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與PG 組比較，LCG、HCG、LPCG、HPCG 組的血磷水平下降，其中LCG、LPCG組與PG 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明與正常組比較，潑尼松、高劑量卡格列凈可導(dǎo)致血磷水平明顯升高。各用藥組ALP 水平均升高，其中NG 組與MG、PG、HCG、HPCG 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與MG 組比較，其余各組ALP水平均下降，其中LCG 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗結(jié)果表明，疾病本身、潑尼松、高劑量卡格列凈或上述2 種藥聯(lián)用可導(dǎo)致ALP 水平明顯升高，均可能與骨質(zhì)疏松相關(guān)。見表2。

表2 6 周后各組大鼠血液相關(guān)指標(biāo)的比較（±s，n=6）

表2 6 周后各組大鼠血液相關(guān)指標(biāo)的比較（±s，n=6）

注：與NG 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與MG 組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與PG 組比較#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 血磷/（mmol/L） ALP/（mmol/L）NG 組 1.67±0.47 120.38±51.85 MG 組 1.78±0.09 251.70±65.67**PG 組 2.27±0.37**△△ 209.41±88.20*LCG 組 1.84±0.19# 165.63±37.59△HCG 組 2.05±0.20* 213.79±65.08*LPCG 組 1.77±0.10## 190.81±29.99 HPCG 組 1.96±0.23 214.89±49.22*F 2.855 2.608 P 0.027 0.039 ALB/（g/L）26.52±3.62 16.75±1.46**21.60±2.87△△21.55±1.38△20.74±1.58△△23.20±1.19△△22.85±2.01△5.027 0.001血鈣/（mmol/L）2.05±0.22 2.01±0.07 2.35±0.09 2.19±0.10 2.27±0.23 2.24±0.01 2.28±0.11 2.243 0.068

2.3 大鼠骨密度及相關(guān)指標(biāo)的比較

2.3.1 在體全身骨密度及相關(guān)指標(biāo)各組大鼠在體全身骨密度、肌肉及脂肪量經(jīng)統(tǒng)計分析，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與NG 組相比，PG、HPCG組全身骨鹽量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與MG 組比較，PG 組全身骨鹽量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明與正常組比較，潑尼松或潑尼松與高劑量卡格列凈聯(lián)用，可導(dǎo)致全身骨鹽量下降，是骨質(zhì)疏松的相關(guān)因素之一。見表3。

表3 6 周后各組大鼠全身骨密度及相關(guān)指標(biāo)的比較（±s，n=6）

表3 6 周后各組大鼠全身骨密度及相關(guān)指標(biāo)的比較（±s，n=6）

注：與NG 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與MG 組比較△P＜0.05。

組別 全身肌肉量/g 全身脂肪量/g NG 組 694.00±36.15 260.00±76.68 MG 組 644.00±115.02 220.50±72.85 PG 組 580.50±153.91 224.50±62.99 LCG 組 620.00±148.98 241.00±67.92 HCG 組 645.17±171.43 234.00±58.16 LPCG 組 604.00±109.54 234.00±71.20 HPCG 組 590.00±131.55 255.67±70.25 F 4.001 0.279 P 0.677 0.943全身骨密度/（g/cm2）0.20±0.06 0.16±0.03 0.13±0.02 0.18±0.06 0.17±0.06 0.15±0.03 0.16±0.05 10.119 0.120全身骨鹽量/g 19.35±1.37 16.90±0.11 11.85±0.27**△16.55±2.25 17.05±4.16 15.03±1.53 13.40±0.22*27.763 0.000

2.3.2 在體區(qū)域骨密度大鼠頭、上肢、大腿、脊柱的在體區(qū)域骨密度經(jīng)統(tǒng)計分析，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與NG 組比較，PG、HPCG 組的軀干、肋骨骨密度數(shù)值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PG、LCG、HCG、LPCG、HPCG 組的骨盆骨密度數(shù)值均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與MG 組比較，PG、HPCG 組肋骨骨密度數(shù)值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果顯示，造模未引起在體區(qū)域骨密度明顯變化，與正常組比較。潑尼松和卡格列凈會引起區(qū)域骨密度下降，其中以骨盆骨密度下降最為明顯；而潑尼松或潑尼松與高劑量卡格列凈聯(lián)用，可導(dǎo)致軀干、肋骨骨密度下降，增加了骨質(zhì)疏松及骨折的風(fēng)險。見表4。

表4 6 周后各組大鼠在體區(qū)域骨密度的比較（±s，n=6）

表4 6 周后各組大鼠在體區(qū)域骨密度的比較（±s，n=6）

注：與NG 組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與MG 組比較△△P＜0.01。

骨密度/（g/cm2）組別 脊柱NG 組 0.15±0.01 MG 組 0.17±0.06 PG 組 0.12±0.02 LCG 組 0.15±0.03 HCG 組 0.14±0.02 LPCG 組 0.12±0.03頭0.38±0.21 0.34±0.00 0.20±0.06 0.57±0.43 0.39±0.24 0.28±0.13上肢0.51±0.47 0.49±0.12 0.11±0.05 0.26±0.20 0.34±0.22 0.11±0.03大腿0.14±0.01 0.13±0.02 0.12±0.02 0.12±0.02 0.13±0.03 0.13±0.01軀干0.13±0.00 0.12±0.01 0.10±0.01*0.11±0.00 0.11±0.01 0.12±0.01肋骨 骨盆0.11±0.00 0.13±0.00 0.12±0.01 0.12±0.01 0.08±0.00*△△ 0.10±0.01*0.09±0.01 0.10±0.00**0.10±0.03 0.11±0.00*0.11±0.01 0.10±0.02*HPCG 組 0.17±0.04 0.60±0.43 0.12±0.01 F 0.44±0.19 0.10±0.02* 0.08±0.00*△△ 0.11±0.00*8.192 11.904 11.353 22.690 22.944 20.350 11.600 P 0.224 0.064 0.078 0.001 0.001 0.002 0.072

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，SGLT2i 除降血糖之外有獨立的腎臟保護作用。在SGLT2i 治療包括NS 在內(nèi)的慢性腎病過程中，主要作用體現(xiàn)在降低尿蛋白，其機制是通過對鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2 的抑制，阻斷了近端小管對Na+的攝取，導(dǎo)致輸送至致密斑的Na+增加，刺激轉(zhuǎn)化生長因子介導(dǎo)的管球反饋，引起入球小動脈收縮，從而降低腎小球內(nèi)高血壓〔1，7-8〕。GC 作為NS 的治療基石，同時是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨折的一個危險因素，臨床指南建議在開始GC 治療時應(yīng)考慮使用抗骨質(zhì)疏松藥物進行預(yù)防性治療〔9〕。同時SGLT2i 的副作用也不容小覷，如酮癥酸中毒、泌尿生殖系統(tǒng)感染、骨折、下肢截肢風(fēng)險和腫瘤等〔10〕。研究認(rèn)為，SGLT2i 可影響腎小管對鈣、磷酸鹽的吸收和排泄，對骨代謝產(chǎn)生一定影響。在臨床試驗中，與使用安慰劑相比，SGLT2i 引起的下肢截肢風(fēng)險增加了大約2 倍〔11〕，可能機制或影響因素包括血清磷酸鹽升高、維生素D 水平降低、體質(zhì)量減少、相對高劑量、低血壓、糖尿病并發(fā)癥等。但Perkovic 等研究表明，卡格列凈與安慰劑組在下肢截肢風(fēng)險方面沒有顯著性差異〔12〕。因此，SGLT2i 的不良事件仍需大樣本、多中心的臨床實驗和相關(guān)基礎(chǔ)實驗進一步予以驗證。

本實驗通過對阿霉素誘導(dǎo)的AN 大鼠模型給予潑尼松、不同劑量卡格列凈或兩者聯(lián)合用藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 種藥物均可有效降低尿蛋白、升高ALB，可用于NS 的治療，但治療過程中均會引起骨盆骨密度的下降。其中潑尼松、高劑量卡格列凈或二者聯(lián)用還會引起鈣磷代謝異常、ALP 升高、全身骨鹽量降低及骨密度下降范圍擴大，增加了骨質(zhì)疏松的風(fēng)險。目前GC 對骨損傷的作用機制已被充分認(rèn)識，但SGLT2i 作為一種新型降糖藥，其副作用易被忽視。結(jié)合本實驗結(jié)果分析，卡格列凈影響腎小管對鈣、磷酸鹽的吸收和排泄，可能打破了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡，使血清ALP 水平增高，骨代謝增加，并表現(xiàn)為骨鹽量減少和骨密度降低。因此，本研究認(rèn)為SGLT2i 是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的一個危險因素，且與用藥劑量呈正相關(guān)，但其用藥時間以及聯(lián)合用藥對骨代謝的影響仍需要更多的實驗予以證實。盡管SGLT2i 致骨折的風(fēng)險仍有待明確，但在骨質(zhì)疏松、骨折高風(fēng)險人群中仍應(yīng)謹(jǐn)慎使用。NS 患者在使用卡格列凈、潑尼松或二者聯(lián)合治療時，建議早期即積極使用抗骨質(zhì)疏松藥物進行預(yù)防性治療，并定期復(fù)查血鈣、血磷、ALP、骨密度、甲狀旁腺激素等骨代謝相關(guān)指標(biāo)，積極防治骨質(zhì)疏松。