歐 玲，李彩琳，李銀蕊，周 杰，單婉歆，吳定宇，彭 芳*

（1. 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000；3.大理大學(xué)資產(chǎn)與實驗室管理處，云南大理 671000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第五大惡性腫瘤，每年約有70 萬人死于HCC〔1-2〕。在我國，HCC 占肝癌85%～90%〔3〕。目前，臨床除化療外，常采用手術(shù)治療、放療、生物治療等多種方法聯(lián)合治療肝癌，其中化療是臨床治療肝癌的重要手段，但腫瘤細胞在接受常規(guī)的化療藥物治療后通常會產(chǎn)生耐藥，甚至具有多藥耐藥性（multi-drug resistance，MDR）〔4〕。因此，尋找治療性生物靶標成為近年來腫瘤治療的熱點。腺苷-磷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）是真核細胞中重要的能量感受器之一，對細胞內(nèi)的AMP/ATP 比值非常敏感，任何導(dǎo)致該比值升高的因素均可激活A(yù)MPK，活化的AMPK 可參與調(diào)節(jié)自噬過程〔5〕。細胞自噬是一種溶酶體依賴的自我消化過程，多項研究表明，自噬可雙向調(diào)節(jié)MDR，抑制自噬可能增強耐藥腫瘤細胞對化療藥物的敏感性〔6-7〕。

中藥具有多靶點、多層面的特點，在逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR 方面具有獨特的優(yōu)勢〔8〕。美洲大蠊Periplaneta americana L.為昆蟲綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用〔9-10〕。課題組前期以美洲大蠊為原料提取分離得到脫脂膏和CⅡ-3，進一步對CⅡ-3 進行分離得到多肽PAE2，研究表明，PAE2具有抗肝癌和逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥作用，其相關(guān)機制與影響耐藥相關(guān)蛋白及酶表達從而減少藥物排出、促進細胞凋亡以及抑制血管生成有關(guān)〔11-13〕。然而，PAE2調(diào)節(jié)自噬的機制尚不清楚。因此，本研究采用人肝癌細胞株BEL-7402 及其耐藥株BEL-7402/5-FU為試驗對象，以索拉非尼為陽性對照藥，以AMPK為靶點探討美洲大蠊多肽PAE2對自噬的影響。

1 材料

1.1 儀器TCS SP8 型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica 公司）；TD3 型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；CKX41SF 倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；SN255939 型全自動酶標儀、3111 型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；785BR15145 型PCR 儀（美國Bio-Rad）。

1.2 藥品與試劑美洲大蠊多肽PAE2（白色凍干粉末，批號：P18267，純度≥98%）由大理大學(xué)藥學(xué)院張成桂博士提供；索拉非尼（批號：819C021，純度≥99%）、噻唑藍（MTT，批號：C0009-2）、青鏈霉素混合液（100X，批號：20190905）、DAB 濃縮液（批號：20181120）均購自北京索萊寶科技有限公司；甘油（批號：20200414）購自昆明遠方生物制品有限公司；五氟尿嘧啶（5-FU，批號：#WXBC0190V）、二甲基亞砜（DMSO，批號：RNBD6084）均購自Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基（批號：8521447）、胎牛血清（FBS，批號：18050302）、牛血清白蛋白（BSA，批號：15260-037）均購自美國Gibco 公司；DAPI（批號：MAO128-Jul-14F）購自美侖生物；0.25% 胰蛋白酶-EDTA（批號：MSTE1905X）購自邁基生物技術(shù)有限公司；AMPK 試劑盒（批號：201890901）購自江蘇晶美生物科技有限公司；AICAR（批號：A818441337769）購自愛普拜生物技術(shù)有限公司；BeyoIIcDNA 第一鏈合成試劑盒（批號：081220200922/0761819083）、BeyoFastTMSYBR GREEN qPCR Mix（批號：121919200527）均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 細胞人肝癌細胞株BEL-7402 （批號：MXC050）、人肝癌耐藥細胞株BEL-7402/5-FU（批號：MXC049）均購于上海美軒生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)BEL-7402、BEL-7402/5-FU 細胞用含10% FBS 和1%青鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，另在BEL-7402/5-FU 細胞的培養(yǎng)基中加入20 μg/mL 的5-FU 以維持其耐藥性。2 種細胞均要1～2 d 更換培養(yǎng)基，長滿培養(yǎng)皿80%以上進行傳代，選擇對數(shù)生長期細胞進行試驗。

2.2 藥液制備美洲大蠊多肽PAE2用磷酸鹽緩沖液（PBS）制成50 mg/mL 的儲備液，索拉非尼用DMSO 配制成10 mg/mL 的儲備液，用0.22 μm 醫(yī)用微孔濾膜過濾除菌后分裝，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，試驗時用0.9%氯化鈉溶液稀釋至相應(yīng)濃度后進行給藥。

2.3 分組與給藥試驗分為敏感組、耐藥組、索拉非尼組、PAE2低劑量組、PAE2中劑量組、PAE2高劑量組、PAE2低劑量聯(lián)合AICAR 組、PAE2中劑量聯(lián)合AICAR 組、PAE2高劑量聯(lián)合AICAR 組。索拉非尼及美洲大蠊多肽PAE2劑量參照文獻〔14〕，AICAR 作用濃度由MTT 試驗確定。敏感組加入BEL-7402 細胞，其余各組加入BEL-7402/5-FU 細胞。給藥時，敏感組和耐藥組加入常規(guī)培養(yǎng)基，給藥組則加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基。

2.4 MTT 比色法檢測AICAR 的作用時間及濃度取對數(shù)生長期的BEL-7402/5-FU 細胞接種于96 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜后，加入含不同濃度的AICAR 培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)10 個復(fù)孔，每孔100 μL，同時設(shè)置試劑對照組和細胞空白對照組。培養(yǎng)48 h 后每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。每孔加入100 μL DMSO，振蕩30 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，酶標儀測570 nm 處OD 值（OD570）。計算AICAR 對BEL-7402/5-FU 細胞的生長抑制率，處理數(shù)據(jù)得20%抑制濃度（IC20），以IC20作為試驗劑量與美洲大蠊多肽PAE2不同劑量聯(lián)合用于進行后續(xù)試驗。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測AMPK 的含量檢測敏感組，耐藥組，索拉非尼組，PAE2低、中、高劑量組AMPK 含量。敏感組取對數(shù)生長期的BEL-7402 細胞，其余各組取對數(shù)生長期的BEL-7402/5-FU 細胞，接種于96 孔板中，待細胞生長融合至70%左右，除敏感組和耐藥組外，其余各組分別加入相應(yīng)藥物。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后取細胞培養(yǎng)液2 500 r/min 離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書進行檢測。

2.6 實時聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測AMPK mRNA 的表達Trizol 試劑提取總RNA，測定其濃度與純度，按照cDNA 第一鏈合成試劑盒說明合成cDNA，以cDNA 為模板采用兩步法進行擴增。反應(yīng)程序：預(yù)變性（95 ℃2 min）；PCR 反應(yīng)（40 個循環(huán)；95 ℃15 s；60 ℃30 s；72 ℃30 s）。增加溶解曲線步驟：95 ℃15 s，60 ℃30 s。選擇GAPDH 為內(nèi)參，2-△△Ct法計算AMPK mRNA 表達水平。

2.7 real-time PCR 檢測細胞自噬相關(guān)因子mRNA的表達以GAPDH 為內(nèi)參，兩步法進行擴增，2-△△Ct法計算細胞中自噬相關(guān)蛋白5（autophagy related protein 5, ATG5）、自噬相關(guān)蛋白7（autophagy related protein 7, ATG7）、磷酸肌醇-3-激酶3（phosphoinositide-3-kinase class 3, PIK3C3）、Beclin 1、微管相關(guān)蛋白1 親鏈3-Ⅱ（microtubuler-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ, LC3-Ⅱ）、P62、Zeste 同源物增強子2（enhancer of Zeste homolog 2, EZH2）的mRNA 相對表達水平。引物序列見表1。

表1 real-time PCR 引物序列

2.8 激光共聚焦顯微鏡觀察LC3-Ⅱ蛋白的表達取對數(shù)生長期的BEL-7402 和BEL-7402/5-FU 細胞，接種至預(yù)先放有細胞爬片的24 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后加入含相應(yīng)受試藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入冰丙酮300 μL，室溫固定15 min；5% BSA 封閉60 min。一抗孵育過夜，二抗孵育2 h。DAPI 避光染色10～15 min?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄毩⒅貜?fù)試驗3 次，避光保存。第2 天于激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察，每組6 個平行。

2.9 免疫細胞化學(xué)法（immunocytochemistry，ICC）檢測P62 蛋白的表達取對數(shù)生長期的BEL-7402 和BEL-7402/5-FU 細胞，接種至預(yù)先放有細胞爬片的12 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后加入含相應(yīng)受試藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。3% H2O2與甲醇按1∶4 的體積比均勻混合后滴入各爬片上，室溫孵育30 min；5% BSA 室溫封閉10 min；一抗、二抗孵育；DAB 顯色試劑盒顯色至所需棕色后加入蒸餾水終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染30 s，將標本放入飽和Na2HPO4溶液中浸泡2 min，取出后立即用蒸餾水清洗；乙醇梯度脫水，甘油封片，倒置顯微鏡下觀察拍照。使用Image J 6.0 軟件計算平均光密度值。

2.10 統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，所得數(shù)據(jù)均采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 AICAR 的作用時間及濃度采用MTT 法對AMPK 激活劑AICAR 的作用時間及濃度進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AICAR 對細胞的殺傷呈時間和濃度依賴，后續(xù)細胞試驗中與美洲大蠊多肽PAE2不同劑量組聯(lián)合使用的濃度為IC20，作用時間為48 h。經(jīng)計算，激活劑AICAR 作用濃度為0.006 mmol/L，即1.55 mg/mL（分子量為258.23）。見封三圖1。

3.2 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK 含量的影響與敏感組相比，耐藥組細胞中AMPK 含量明顯增多（P＜0.05），PAE2高劑量組細胞中AMPK 含量明顯降低（P＜0.05）；與耐藥組相比，索拉非尼組、PAE2各劑量組細胞中AMPK 含量均顯著降低（P＜0.05）；與索拉非尼組相比，PAE2各劑量組中AMPK含量均降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK 含量的影響（±s，n=8，pg/mL）

表2 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK 含量的影響（±s，n=8，pg/mL）

注：與敏感組比較*P ＜0.05；與耐藥組比較#P＜0.05。

組別 AMPK 含量敏感組 135.82±9.27耐藥組 147.40±5.67*索拉非尼組 132.29±7.55#PAE2 低劑量組 128.41±8.08#PAE2 中劑量組 128.72±11.50#PAE2 高劑量組 126.10±8.12*#

3.3 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK mRNA表達水平的影響與敏感組相比，耐藥組細胞中AMPK mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05），索拉非尼組細胞中AMPK mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與耐藥組相比，索拉非尼組細胞中AMPK mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），PAE2各劑量組細胞中AMPK mRNA 表達水平也有不同程度降低，以PAE2高劑量組效果最佳（P＜0.05），但效果不及索拉非尼。見表3。

表3 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK mRNA表達水平的影響（±s，n=4）

表3 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK mRNA表達水平的影響（±s，n=4）

注：與敏感組比較*P＜0.05；與耐藥組比較#P＜0.05；與索拉非尼組比較▲P＜0.05。

組別 AMPK mRNA敏感組 0.72±0.11耐藥組 1.00±0.00*索拉非尼組 0.10±0.02*#PAE2 低劑量組 0.91±0.12▲PAE2 中劑量組 0.87±0.25▲PAE2 高劑量組 0.63±0.13#▲

3.4 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬相關(guān)因子mRNA 表達水平的影響與敏感組相比，耐藥組ATG5 mRNA、ATG7 mRNA 和PIK3C3 mRNA 表達水平均升高，且PIK3C3 mRNA 的表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。與耐藥組相比，PAE2各劑量組ATG5 mRNA 和PIK3C3 mRNA 表達水平均明顯降低（P＜0.05），ATG7 mRNA 表達水平也降低，但僅PAE2中劑量組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PAE2聯(lián)合AICAR 給藥后，ATG5 mRNA、ATG7 mRNA、PIK3C3 mRNA 表達水平見表4。

表4 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬相關(guān)因子ATG5 mRNA、ATG7 mRNA、PIK3C3 mRNA表達水平的影響（±s，n=8）

表4 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬相關(guān)因子ATG5 mRNA、ATG7 mRNA、PIK3C3 mRNA表達水平的影響（±s，n=8）

注：與敏感組比較*P＜0.05；與耐藥組比較#P＜0.05；與索拉非尼組比較▲P＜0.05。

組別 ATG5 mRNA ATG7 mRNA PIK3C3 mRNA敏感組 0.85±0.11 0.80±0.07 0.49±0.09耐藥組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00*索拉非尼組 0.25±0.05*# 1.12±0.21* 0.29±0.05*#PAE2 低劑量組 0.78±0.22#▲ 0.91±0.26 0.53±0.07#▲PAE2 中劑量組 0.47±0.08*#▲ 0.53±0.06#▲ 0.20±0.07*#PAE2 高劑量組 0.48±0.05*#▲ 0.82±0.07▲ 0.67±0.14*#▲PAE2 低劑量聯(lián)合AICAR 組 1.04±0.10*▲ 0.70±0.14#▲ 0.14±0.03*#▲PAE2 中劑量聯(lián)合AICAR 組 1.11±0.19*▲ 1.14±0.08* 0.28±0.05*#PAE2 高劑量聯(lián)合AICAR 組 0.36±0.09*# 1.26±0.17*# 0.21±0.04*#

與敏感組相比，耐藥組Beclin 1 mRNA 和LC3-ⅡmRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05），P62 mRNA和EZH2 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05）。與耐藥組相比，PAE2各劑量組Beclin 1 mRNA 和LC3-ⅡmRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），P62 mRNA和EZH2 mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）。與PAE2單用相比，PAE2低、高劑量聯(lián)合AICAR 組P62 mRNA的表達水平顯著降低（P＜0.05），PAE2低、中、高劑量聯(lián)合AICAR 組EZH2 mRNA 的表達水平均顯著降低（P＜0.05），PAE2低、中劑量聯(lián)合AICAR 組LC3-II mRNA 的表達水平顯著升高（P＜0.05）。見表5。

表5 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬相關(guān)因子Beclin 1 mRNA、LC3-ⅡmRNA、P62 mRNA、EZH2 mRNA表達水平的影響（±s，n=8）

表5 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬相關(guān)因子Beclin 1 mRNA、LC3-ⅡmRNA、P62 mRNA、EZH2 mRNA表達水平的影響（±s，n=8）

注：與敏感組比較*P＜0.05；與耐藥組比較#P＜0.05；與索拉非尼組比較▲P＜0.05；與PAE2 單用比較△P＜0.05。

組別 Beclin 1 mRNA EZH2 mRNA敏感組 0.25±0.05 4.53±0.39耐藥組 1.00±0.00* 1.00±0.00*索拉非尼組 0.13±0.01*# 0.72±0.38*PAE2 低劑量組 0.03±0.00*#▲ 9.04±0.22*#▲PAE2 中劑量組 0.06±0.01*#▲ 3.55±0.62*#▲LC3-ⅡmRNA 0.59±0.06 1.00±0.00*0.30±0.03*#0.15±0.07*#▲0.29±0.07*#P62 mRNA 1.86±0.25 1.00±0.00*0.14±0.02*#8.09±1.15*#▲1.35±0.15#0.38±0.08*# 8.67±0.70*#▲PAE2 低劑量聯(lián)合AICAR 組 0.05±0.01*#▲ 0.99±0.05*▲△ 0.52±0.05*△ 0.72±0.10*△PAE2 中劑量聯(lián)合AICAR 組 0.05±0.01*#▲ 0.55±0.03#▲△ 0.86±0.13*▲ 1.47±0.29*#▲△PAE2 高劑量組 0.16±0.04*# 9.29±0.32*#▲PAE2 高劑量聯(lián)合AICAR 組 0.07±0.01*#▲ 0.69±0.15*△0.29±0.03*#0.41±0.08*#△

3.5 美洲大蠊多肽PAE2 對LC3-Ⅱ蛋白的影響為了探究美洲大蠊多肽PAE2對自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的影響，運用激光共聚焦顯微鏡觀察LC3-Ⅱ蛋白在各組細胞中的表達。兩種熒光融合后，與敏感組相比，耐藥組細胞自噬作用降低，PAE2各劑量組給藥后自噬作用明顯降低；PAE2聯(lián)合AICAR給藥后，細胞中綠色熒光明顯增多，自噬作用增強。

3.6 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬蛋白P62 的影響ICC 結(jié)果顯示，敏感組細胞大量表達P62，其余各組細胞P62 表達減少，索拉非尼和PAE2均對P62有促進作用，且PAE2作用優(yōu)于索拉非尼。PAE2聯(lián)合AICAR 給藥后，P62 表達減少。見封三圖2。與敏感組相比，耐藥組細胞中P62 表達明顯降低（P＜0.05），提示耐藥細胞自噬作用增強；與耐藥組相比，索拉非尼組和PAE2各劑量組P62 表達均顯著增加（P＜0.05），表明藥物對細胞自噬起到了抑制作用。PAE2聯(lián)合AICAR 給藥后，P62 表達明顯降低（P＜0.05），即AICAR 激活A(yù)MPK 使細胞自噬作用增強。見表6。

表6 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬蛋白P62 的影響（±s，n=8）

表6 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬蛋白P62 的影響（±s，n=8）

注：與敏感組比較*P＜0.05；與耐藥組比較#P＜0.05；與索拉非尼組比較▲P＜0.05；與PAE2 單用比較△P＜0.05。

組別 P62敏感組 0.16±0.01耐藥組 0.09±0.01*索拉非尼組 0.11±0.01*#PAE2 低劑量組 0.12±0.00*#PAE2 中劑量組 0.13±0.01*#▲PAE2 高劑量組 0.13±0.01*#▲PAE2 低劑量聯(lián)合AICAR 組 0.09±0.01*▲△PAE2 中劑量聯(lián)合AICAR 組 0.10±0.01*▲△PAE2 高劑量聯(lián)合AICAR 組 0.10±0.01*▲△

4 討論

肝癌患者病死率較高，且因臨床診斷發(fā)現(xiàn)晚，手術(shù)治療效果并不理想。目前臨床上的治療手段以化療為主。索拉非尼是一種口服多靶點激酶抑制劑，具有較好的抑制腫瘤細胞生長、增殖作用，是首個被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的用于治療晚期HCC 的分子抑制劑，因此本研究選擇索拉非尼作為陽性對照藥〔15〕。由于在化療過程中易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，療效不佳，因此，愈來愈多的研究者對腫瘤耐藥機制及如何逆轉(zhuǎn)耐藥進行深入探索。目前臨床上使用的逆轉(zhuǎn)劑種類較多，但由于其逆轉(zhuǎn)效率不高且機制單一，應(yīng)用受到限制。而中藥具有多靶點、多階段性作用的優(yōu)勢，可以針對腫瘤MDR 的多種機制進行有效的逆轉(zhuǎn)。課題組前期研究〔11-13〕表明美洲大蠊多肽PAE2具有逆轉(zhuǎn)肝癌MDR 作用，但對自噬的影響未知。AMPK 是將多種細胞功能和生理過程及能量利用聯(lián)系起來的主要傳感器之一，而自噬的主要誘導(dǎo)因素為營養(yǎng)缺乏和（或）能量缺乏，在生物進化過程中，這種內(nèi)在特性從未改變，所以，AMPK 是自噬的重要上游調(diào)節(jié)因子〔4〕，且可從多層面促進自噬。因此，本研究基于AMPK 影響自噬來探討PAE2逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用機制。

腫瘤細胞在營養(yǎng)缺乏、缺氧、饑餓等壓力環(huán)境下，AMPK 被激活，從而保護細胞免于死亡。ELISA結(jié)果顯示，BEL-7402/5-FU 細胞株中AMPK 含量明顯高于BEL-7402 細胞株，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，推測這是耐藥細胞的一種保護機制，腫瘤耐藥細胞能量代謝異常，需要更多的能量。為了驗證這一結(jié)果，采用real-time PCR 檢測細胞中AMPK mRNA 的表達水平，結(jié)果顯示出與ELISA 同樣的趨勢?；谏鲜鼋Y(jié)果可知，耐藥細胞中AMPK 高表達，美洲大蠊多肽PAE2可抑制AMPK 的表達，且以PAE2高劑量組效果較優(yōu)。

LC3-Ⅱ定位于自噬體內(nèi)外膜之間，自噬體與溶酶體結(jié)合后，LC3-Ⅱ被溶酶體的水解酶降解，因此可作為自噬標記物。激光共聚焦顯微鏡觀察LC3-Ⅱ的表達，結(jié)果顯示美洲大蠊多肽PAE2可降低耐藥細胞株中LC3-Ⅱ蛋白的表達，即抑制耐藥細胞自噬。P62 是一種重要的選擇性自噬的調(diào)節(jié)劑，也是自噬底物。P62 可以和LC3-Ⅱ及自噬體內(nèi)膜上的泛素化底物結(jié)合，形成自噬溶酶體被降解，自噬抑制可導(dǎo)致P62 積累，在HCC 的發(fā)生過程中扮演重要角色〔16〕。ICC 結(jié)果表明美洲大蠊多肽PAE2可提高耐藥細胞株中P62 蛋白的表達。哺乳動物自噬體形成涉及2 個泛素化樣修飾，即ATG12 修飾和LC3修飾〔17-18〕。ATG12 被泛素活化酶E1 樣酶ATG7 激活后轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶E2 樣酶ATG10，并與ATG5結(jié)合形成自噬體前體。Beclin 1 是哺乳動物中最先被確定的特異性自噬調(diào)控基因之一，AMPK 可直接在Thr388 處磷酸化Beclin 1，Beclin 1 中Thr388 處的磷酸化對于誘導(dǎo)自噬是必不可少的，同時AMPK 促進Beclin 1 與PIK3C3 的直接結(jié)合以激活自噬〔19〕。AMPK 還可以特異性磷酸化EZH2，破壞EZH2 與Zeste 12 同源物1 抑制因子2（suppressor of zeste 12 homolog，SUZ12）的相互作用，導(dǎo)致多梳抑制復(fù)合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）靶基因被上調(diào)，從而抑制腫瘤細胞的生長〔20〕。real-time PCR 結(jié)果顯示，美洲大蠊多肽PAE2能夠使自噬相關(guān)因子ATG5 mRNA、ATG7 mRNA、PIK3C3 mRNA、Beclin 1 mRNA、LC3-ⅡmRNA 的表達水平降低及P62 mRNA 和EZH2 mRNA 的表達水平升高。AICAR 是AMPK 的激活劑，PAE2聯(lián)合AICAR 用藥后，AMPK被激活，細胞自噬有一定程度的增強。上述結(jié)果進一步證實了美洲大蠊多肽PAE2通過下調(diào)AMPK 的表達而抑制腫瘤細胞自噬。

雖然美洲大蠊多肽PAE2抑制了耐藥細胞的自噬，但PAE2各劑量組對細胞自噬的影響并未呈現(xiàn)出劑量依賴性，這可能與PAE2多靶點、多層面、多途徑的作用特點、自噬過程及腫瘤多藥耐藥的復(fù)雜性有關(guān)，也可能與PAE2未達到有效治療劑量或者超出有效濃度而出現(xiàn)拮抗作用有關(guān)，中藥的量效關(guān)系仍處于探索階段。此外，PAE2對P62 及其mRNA的表達均體現(xiàn)出上調(diào)的作用，但各劑量組之間的增強作用并不一致，在real-time PCR 結(jié)果中甚至出現(xiàn)PAE2低、高劑量組效果較優(yōu)而中劑量組效果不明顯的情況，這可能與藥物在體外細胞中的代謝過程及腫瘤微環(huán)境的不穩(wěn)定性，以及P62 在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平對細胞自噬的調(diào)節(jié)作用不同有關(guān)，后續(xù)可以通過克隆、突變P62，然后進行質(zhì)粒構(gòu)建與重組以及細胞轉(zhuǎn)染等操作，以此來探究P62 在蛋白水平和基因水平表達不一致的原因。

綜上所述，美洲大蠊多肽PAE2可能通過抑制AMPK 而抑制自噬以達到逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的作用。在后續(xù)研究中，需要進一步探索AMPK 對自噬是起到一般調(diào)節(jié)作用還是主導(dǎo)作用，PAE2作用為何未呈現(xiàn)劑量依賴性的原因，體外和體內(nèi)試驗是否呈現(xiàn)相同的效果等。后續(xù)課題組也將對PAE2對自噬作用的影響進行體內(nèi)研究，以進一步完善PAE2逆轉(zhuǎn)肝癌MDR 的機制，為PAE2的臨床研究奠定基礎(chǔ)。