張戰(zhàn)輝， 張慧， 李偉亞， 付志遠， 郭戰(zhàn)勇

(河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南 鄭州 450002)

植物葉片是光合作用的主要器官。葉片衰老是植物長期進化過程中與環(huán)境相適應形成的一種生存機制，決定著植物的適應性和產(chǎn)量，受控于復雜、精確的調(diào)控網(wǎng)絡，外界環(huán)境的變化和生物脅迫的發(fā)生往往會導致葉片衰老的起始[1]。作物的光合產(chǎn)物是人們的主要食物來源[2]，作物生長發(fā)育過程中，葉片光合產(chǎn)物和吸收的營養(yǎng)物質(zhì)不斷積累，而衰老過程則是成熟葉片中積累的光合產(chǎn)物和營養(yǎng)物質(zhì)被轉移到正在發(fā)育的新葉片和籽粒中的過程，葉片功能期延長能提高作物產(chǎn)量[3]。因此，葉片衰老對于糧食生產(chǎn)具有重要的決定性作用，如C4植物玉米，葉片具有較C3植物更高的光合效率，且生育期較短，葉片早衰會嚴重影響籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)。同樣，玉米葉片衰老也是植株衰老開始的標志，伴隨著功能葉全部衰老，莖稈、雌穗和籽粒開始脫水，玉米成熟期的籽粒、雌穗含水量和抗倒性是重要的適宜機收性狀，晚熟不利于籽粒的機械化收獲。研究葉片衰老分子調(diào)控機制不僅具有極其重要的生物學意義，而且具有重要的應用價值。

解旋酶包括DNA解旋酶和RNA解旋酶，是生物中廣泛存在的依賴于ATP的核酸解旋酶類，在各種生物過程中發(fā)揮著至關重要的作用[4]。DNA解旋酶主要參與DNA復制、重組、修復和轉錄過程的調(diào)控，以及維持染色體的穩(wěn)定[5]。RNA解旋酶可以解開RNA二級結構中存在的雙鏈，主要作為RNA伴侶協(xié)助結合的RNA從細胞核轉運出細胞核，進而參與轉錄、核糖體組裝、RNA剪接和mRNA翻譯[6]。越來越多的研究表明，RNA解旋酶參與了各植物生長發(fā)育過程和非生物脅迫響應的調(diào)控[7-9]。本研究首先對模式植物擬南芥和玉米葉片衰老調(diào)控研究進行概括，然后對RNA解旋酶的分類和細胞學功能進行闡述，進而對RNA解旋酶參與葉片衰老調(diào)控的研究進展進行重點總結，并對玉米遺傳改良中的潛在應用進行探討。旨在為理解植物RNA解旋酶參與的葉片衰老調(diào)控機制提供必要的依據(jù)和參考，為成熟期玉米葉片的遺傳改良提供重要理論依據(jù)，并為未來研究指明方向。

1 解旋酶分類與生物學功能

1.1 解旋酶分類

根據(jù)氨基酸保守序列，可將解旋酶劃分為6個家族(superfamily，SF)，即SF1～SF6。SF1和SF2家族包括了所有真核生物RNA解旋酶，SF3～SF5家族主要為病毒和細菌DNA解旋酶，SF6家族主要為MCM(微染色體維持蛋白)解旋酶(圖1)。其中，SF2家族成員最為龐大，同時包含真核生物所有的DNA和RNA解旋酶，具有豐富的功能多樣性[4]。

本圖根據(jù)SERAJ等[4]的研究進行繪制。

植物中DNA解旋酶主要存在于細胞核、線粒體和葉綠體中。相關研究表明，DNA解旋酶參與了許多生物學過程，包括DNA重組、DNA復制、翻譯起始、rDNA的轉錄與前期pre-rRNA加工、雙鏈斷裂修復、端粒長度維持、核苷酸切除修復、細胞分裂、DNA甲基化、細胞周期和細胞基礎活動[4-5,10-12]。植物RNA解旋酶分布于細胞核、細胞質(zhì)、葉綠體、線粒體等細胞器中，主要包括DEAD-box、DEAH-box、DExD/H-box和Upf1-like家族，參與mRNA前體剪接加工、rRNA剪接加工、核糖體生物合成、RNA運輸、mRNA代謝、mRNA伴侶、mRNA翻譯起始、mRNA的表觀修飾、miRNA生成、siRNA生成等生物過程[4,6-7,13-15]。前人利用生物信息學方法在擬南芥、水稻、大豆、玉米中分別鑒定到161、149、213和136個RNA解旋酶編碼基因，其中多數(shù)RNA解旋酶的生物學功能尚需進一步研究[7]。其中，138個玉米RNA解旋酶基因編碼215種RNA解旋酶，包括57個DEAD-box，31個DEAH-box，50個DExD/H-boxRNA解旋酶基因，大多數(shù)RNA解旋酶在不同組織器官和發(fā)育時期呈現(xiàn)差異表達，且部分RNA解旋酶基因轉錄存在可變剪接[7]。

1.2 RNA解旋酶的生物學功能

細胞內(nèi)大多數(shù) RNA 分子是單鏈線狀，但具有生物活性的RNA會在某些區(qū)域堿基互補配對，而自身折疊形成高度結構化的二級、三級結構。在體內(nèi)RNA的結構及RNA-蛋白質(zhì)復合物，即核糖核蛋白(RNP)和一切生物大分子的結構一樣是處于動態(tài)平衡的過程中，在其功能周期要經(jīng)歷廣泛的構象變化。RNA解旋酶可以在ATP的驅(qū)動下解開RNA雙鏈，維持單鏈結構，參與RNA構象變化的調(diào)控，從而實現(xiàn)對RNA生物學功能的調(diào)控。近年來，植物RNA解旋酶的功能逐漸受到關注，尤其是在作物農(nóng)藝性狀和逆境響應中的調(diào)控作用。其中，DEAD-box RNA解旋酶ZmPMH2-5140、AtSMN2、OsRH42、AtUAP56、AtPMH2、AtRID1、AtRCF1，以及Ski2-likeRNA解旋酶ISE2被證明參與mRNA前體剪接過程[16-26]；DEAD-box RNA解旋酶SlDEAD39、AtRH50、AtRH36、AtRH18、AtRH57、AtDDX47、AtRH7/PRH75、AtMTR4、OsTOGR1、OsRH17、AtRH22、AtRH3和ZmDRH1參與了rRNA剪接加工與核糖體的生物合成[27-37]；DEAD-box RNA解旋酶AtUAP56和THO/TREX組分TEX1被證明參與了mRNA的轉運[38-41]；Upf1-like家族RNA解旋酶AtUPF1、AtUPF2和AtUPF3，DEA(D/H)-Box家族RNA解旋酶AtDDX3、AtDDX5和AtDDX6被證明參與無義介導的RNA降解途徑[8,42-43]；DEAD-box RNA解旋酶OsTCD33、OsRH58、SlDEAD31、OsSUV3和AtPRH75被證明參與了RNA代謝的調(diào)控[44-48]；DEAD-box RNA解旋酶eIF4A和BrRH22被證明參與了mRNA翻譯的起始[28,49]；此外，eIF4A1(DEAD-box家族)、UPF1(Upf1-like家族)、AtSTRS1(DEAD-box家族)、AtSTRS2(DEAD-box家族)，AtRH27(DEAD-box家族)、AtSMA1(DEAD-box家族)分別被證明參與了表觀遺傳修飾和miRNA的生成途徑[50-54]。RNA解旋酶通過以上所述途徑參與植物逆境響應[4,50]、受精卵分裂[51]、生長發(fā)育[42,49,55]、病原免疫[8]、雌雄配子發(fā)育[56]、葉片衰老[9,57]等生物學過程的調(diào)控。

1.3 RNA解旋酶參與的植物葉片衰老進程調(diào)控

越來越多的研究表明，RNA解旋酶在植物生長發(fā)育和非生物脅迫響應中發(fā)揮著重要作用，但其調(diào)控植物葉片衰老分子機制僅有少量的研究。擬南芥中，一種RNA解旋酶是GVS1調(diào)控葉片衰老途徑中的重要組分，但該RNA解旋酶的生物學功能尚需進一步研究[57]。AtUPF1的T-DNA插入突變體分別表現(xiàn)出開花期提前、種子增長、持續(xù)光照致死、葉片縮小和葉片衰老的表型[9]。水稻中，Upf1-likeRNA解旋酶OsPLS2可能通過無義介導的mRNA降解途徑調(diào)控葉片的衰老，該RNA解旋酶突變體表現(xiàn)出遠紅光、H2O2或ABA敏感。水稻DEAD-boxRNA解旋酶PDH45或SUV3的過表達可以降低細胞的凋亡，進而延緩葉片衰老，其參與的葉片衰老調(diào)控可能是通過調(diào)控端粒酶的活性實現(xiàn)的[58]。目前，尚無RNA解旋酶參與玉米葉片衰老調(diào)控的報道，筆者所在課題組通過對玉米葉片早衰突變體進行基因圖位克隆，確定突變體基因編碼一種人類Smubp-2同源的RNA解旋酶，該RNA解旋酶通過未知機制參與細胞自噬過程的調(diào)控，從而控制玉米葉片衰老的起始。

植物葉片衰老過程伴隨著葉綠體的降解，葉綠體發(fā)育的調(diào)控可能與葉片衰老相關。擬南芥中，RNA解旋酶AtISE2、AtRH22、AtRH3分別被證明參與了葉綠體ABA信號轉導、RNA剪輯和核糖體亞基的生物合成[21,34-35]。水稻OsTCD33被證明參與了低溫調(diào)減下葉綠體發(fā)育的調(diào)控[44]，ZmRH3被證明參與了玉米葉綠體核糖體的生物合成[35]。這些RNA解旋酶可能通過調(diào)控葉綠體發(fā)育和代謝活動控制葉片衰老進程。不同極端外界條件可以誘發(fā)葉片的衰老。大量的研究表明，RNA解旋酶在干旱、高鹽、高溫、低溫脅迫響應中發(fā)揮著極其重要的作用[18,27,30,44-45,59-61]。這些研究為RNA解旋酶參與植物葉片衰老調(diào)控提供了間接證據(jù)，尤其是作物中的研究可為相關性狀的遺傳改良和新品種選育提供必要的理論依據(jù)。其中，RNA解旋酶可以通過響應環(huán)境因子調(diào)控植物葉片衰老的起始，可應用與作物高產(chǎn)和宜機收性狀的遺傳改良。

2 擬南芥和玉米葉片衰老進程及調(diào)控機制研究進展

2.1 擬南芥葉片衰老進程及調(diào)控機制

衰老是植物生長發(fā)育周期的最后一個階段，在細胞、組織、器官和植株水平上均表現(xiàn)出明顯的衰退跡象，是植物在長期進化中形成的適應環(huán)境和生存的一種策略[62]。葉片衰老進程受內(nèi)因和外因的共同作用，在植物生長發(fā)育過程中受不同分子途徑的嚴格調(diào)控[63]。導致葉片衰老的外在因素包括干旱、高鹽、極端溫度、營養(yǎng)、遮陰和病原侵染等，而內(nèi)源信號主要為植物激素，包括生長素(auxin)、細胞分裂素(cytokinin)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)、赤霉素(gibberellic acid，GA)等。外部環(huán)境因素和內(nèi)源信號形成復雜的衰老調(diào)控網(wǎng)絡(圖1)[3,64-65]。除了生物和非生物脅迫，調(diào)控葉片衰老的外部因素還包括光照和晝夜節(jié)律[66-67]。植物在養(yǎng)分充裕、適宜的環(huán)境條件下，葉片衰老主要決定于葉齡和植株的發(fā)育進程[68]。細胞學水平，細胞自噬在維持細胞蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡中發(fā)揮至關重要的作用，細胞自噬的過度和缺少均可導致衰老的起始，是調(diào)控葉片衰老的主要途徑[69]。

擬南芥中，葉片衰老誘導大量基因的表達發(fā)生顯著改變，根據(jù)其表達類型可以劃分為衰老下調(diào)基因(senescence down regulated genes，SDGs)和衰老相關基因(表達量上調(diào)，senescence-associated genes，SAGs)，其中SAGs在植物葉片衰老起始、推進和非生物脅迫響應中發(fā)揮著重要的作用[70]。前人利用遺傳學、基因組學、轉錄組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學分析等方法對植物葉片衰老相關機制進行了解析，鑒定出大量的衰老相關基因[62,71]。葉片衰老過程中，不同內(nèi)源信號植物激素之間存在互作效應，如生長素和細胞分裂素可以抑制葉片衰老，茉莉酸、脫落酸、水楊酸、赤霉素則促進葉片衰老(圖2)[3,72]。而且，葉片衰老受染色質(zhì)、轉錄、轉錄后、翻譯和翻譯后水平的基因表達調(diào)控，不同水平分子調(diào)控構成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡[3,73-74]。雖然，模式植物擬南芥葉片衰老已有大量的研究，相關的分子調(diào)控機制已得到較為深入的解析，但葉片衰老起始和衰老進程推進的精確控制尚需進一步研究。

根據(jù)LI等[71]和WOO等[72]進行本圖片繪制。

2.2 玉米葉片衰老研究進展

葉片衰老的起始和推進受嚴密調(diào)控網(wǎng)絡的精確控制。隨著生長發(fā)育，玉米植株下部老葉不斷地變黃、干枯，而新葉不斷從莖尖伸展出來，營養(yǎng)生長期衰老葉片中的營養(yǎng)物質(zhì)被再利用供給新葉生長，生殖生長期衰老葉片中的營養(yǎng)物質(zhì)被轉運到發(fā)育的籽粒中儲存。延緩葉片衰老可以提高玉米的生物產(chǎn)量、籽粒產(chǎn)量和氮利用率。因此，玉米葉片衰老機制的研究可為葉片功能期的遺傳改良奠定基礎。與擬南芥相比，玉米葉片衰老調(diào)控機制的研究報道還較少。相關研究表明，糖分轉運、源-庫互作和活性氧等是生理水平上影響玉米葉片衰老的重要因素[75-76]，阻止玉米授粉會導致源-庫互作和糖分轉運方式發(fā)生轉變，進而誘導葉片早衰的起始，其中糖分轉運相關基因的表達模式與擬南芥中衰老過程中基因表達模式相似[77-78]。

隨著高通量測序的發(fā)展，研究者利用不同的組學分析，鑒定到一定數(shù)量葉片衰老調(diào)控相關的蛋白質(zhì)、基因和miRNAs，但其功能和相關的分子機制尚不清楚。利用GWAS和轉錄組整合分析，SEKHON等[79]鑒定到8個與玉米葉片衰老顯著性相關的基因，其中包括海藻糖-6-磷酸合成酶、木聚糖合成酶和NAC轉錄因子編碼基因，這些基因均被證明參與了模式植物葉片衰老的調(diào)控。利用早衰突變體的Small RNA-seq和轉錄組分析，CHAI等[80]和WU等[81]鑒定到9個衰老相關的miRNAs和數(shù)個關鍵衰老相關基因，miRNAs包括zma-miR156,zma-miR159，zma-miR167，zma-miR171，zma-miR172，zma-miR395，zma-miR399，zma-miR408和zma-miR529；關鍵衰老基因包括Zm00001d016441(tyrosine aminotransferase)、Zm00001d036370(chitinase)、Zm00001d024767(aspartic proteinase A1)、Zm00001d014993(luminal-binding protein 2)、Zm00001d049217(SAG12)、Zm00001d043025(WRKY33)、Zm00001d003412(P-type R2R3 Myb protein)、Zm00001d012427(ZAT11)等[80-81]。ZHANG等[82]通過轉錄組分析，鑒定到了4 552個葉片自然衰老相關的差異表達基因。迄今，在玉米上僅有ZmVQ52(VQ motif containing protein Gene 52)、ZmSnRK1s、NAC7、knotted1和les1等葉片衰老相關的基因或突變體研究報道，其中葉片衰老正調(diào)控基因ZmVQ52和ZmSnRK1s的功能在擬南芥上進行了轉化驗證[38,83]，而NAC7正向調(diào)控葉片衰老的功能在玉米中經(jīng)過了轉基因驗證[84]。此外，葉片衰老負調(diào)控基因knotted1的功能在煙草轉基因材料中得到了驗證[85]，司偉娜等[86]僅對les1進行了初步定位。綜上所述，盡管前人對玉米葉片衰老的機制開展了一些研究，但對其代謝調(diào)控的分子機制仍知之甚少，極大地限制了玉米相關農(nóng)藝性狀的遺傳改良。

3 RNA解旋酶基因在玉米熟期遺傳改良中的應用

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式的轉變，黃淮海夏玉米生產(chǎn)迫切需要實現(xiàn)籽粒機械化收獲，而玉米生產(chǎn)中適于籽粒機械化收獲的品種較少，急需玉米種質(zhì)資源和育種技術的革新。高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、宜機收是當前玉米育種的主要目標，優(yōu)良玉米新品種應該具有抗逆、抗病、葉片功能期長、籽粒灌漿速率快、籽粒脫水速率快、站稈性好等特點，葉片的適時衰老是制約育種目標實現(xiàn)的關鍵因素之一。玉米葉片衰老起始調(diào)控相關的RNA解旋酶基因通過葉片功能期適中有利單倍型的篩選，應用于成熟期植株衰老和籽粒脫水快的種質(zhì)材料，進而選育適宜籽粒機收的玉米新品種。

隨著人們對肉制品需求的不斷增長，對作為飼料的玉米需求量和營養(yǎng)品質(zhì)提出了更高的要求。青貯玉米不僅具有較高的生物產(chǎn)量，而且提供牲畜所需要的蛋白質(zhì)，因而越來越受到重視。優(yōu)良的青貯玉米品種應具有抗病、生物產(chǎn)量高、整株粗蛋白含量高、中性洗滌纖維含量低、植株淀粉含量高、持綠性好的特點。葉片持綠期長可為獲得高生物產(chǎn)量和淀粉含量提供保障。RNA解旋酶主要參與植物環(huán)境響應調(diào)控，其功能喪失往往導致植株的早衰，非生物抗性和抗病性的衰退，而RNA解旋酶功能的增強和維持能夠促進玉米持綠性提高，可應用于青貯玉米持綠性的改良。

4 展望

植物葉片衰老受控于復雜的調(diào)控機制，僅有的少數(shù)研究表明，RNA解旋酶在調(diào)控葉片衰老過程起始中發(fā)揮著極其重要的作用。雖然玉米等作物中RNA解旋酶的研究較少，但隨著研究的深入，相關突變體和基因?qū)⒈徊粩喟l(fā)掘，將為相關農(nóng)藝性狀的遺傳改良提供必要的基因資源和理論依據(jù)。玉米宜機收新品種選育時既要注重葉片功能期的適當延長，又要在成熟期葉片快速衰老，促進籽粒脫水以達到籽粒機收的要求，精確控制葉片衰老的起始和進程是解決該問題的關鍵。因此，模式植物中RNA解旋酶功能研究不僅拓寬了人們對于植物葉片衰老調(diào)控機制的理解，而且為玉米機收品種的選育提供了一條嶄新的途徑。RNA解旋酶可能通過無義介導的 mRNA降解、端粒酶活性、Per-mRNA剪接、mRNA代謝等途徑參與非生物逆境響應的調(diào)控，相關研究對于玉米抗逆性遺傳改良具有重要的意義。玉米生長過程中，面臨著大風、高溫、干旱、澇漬等自然災害，這些不利因素會引起植株的早衰和死亡，往往造成巨大的產(chǎn)量損失。對玉米RNA解旋酶參與非生物逆境響應機制進行研究，有助于通過遺傳改良達到抗逆性與葉片功能期的優(yōu)化，進而達到增產(chǎn)的目的。

雖然，模式植物RNA解旋酶的研究進展可為玉米的遺傳改良奠定一定的理論基礎，但仍存在若干瓶頸問題亟待解決。首先，植物葉片衰老是一個復雜的生物學過程，衰老起始和發(fā)展精確調(diào)控的分子機制還不清楚，亟待關鍵基因的分離和功能驗證；其次，RNA解旋酶通常具有多種生物學功能，控制不同生物途徑和農(nóng)藝性狀，作物遺傳改良中難以達到平衡和優(yōu)化；再次，玉米RNA解旋酶的研究較少，尚不能滿足遺傳改良的需求，需要開展相關研究，鑒定關鍵RNA解旋酶的功能和解析相關的分子機制；最后，夏玉米生產(chǎn)中不同氣象災害頻發(fā)，通常造成嚴重的產(chǎn)量損失，農(nóng)藝性狀遺傳改良需要多基因聚合，多種性狀協(xié)調(diào)和平衡。隨著玉米相關研究的開展，應用策略的革新，這些問題將會逐步得到解決。