肖 婷，錢榮明，張富榮，周 斌，吳惠秋，季 森，宋俊賢，莊義慶，楊敬輝

（1江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇句容 212400；2南京市溧水區(qū)植保植檢站，南京 211000；3徐州市銅山區(qū)植保植檢站，江蘇徐州 221000；4昆山市耕地質(zhì)量與植物保護(hù)站，江蘇昆山 215300；5泰州市姜堰區(qū)植保植檢站，江蘇泰州 225500；6無錫市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，江蘇無錫 214000；7常州市新北區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合管理服務(wù)中心，江蘇常州 213000）

0 引言

草莓味美多汁，酸甜可口，是深受消費(fèi)者喜愛的水果。改革開放以來，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人民生活水平提高，草莓消費(fèi)需求不斷擴(kuò)大。江蘇省草莓產(chǎn)業(yè)幾乎是從零起步，有了很大發(fā)展，目前全省栽培面積超達(dá)1.7萬hm2，分布遍及全省，并形成了東海、贛榆、如皋、句容等較大的集中產(chǎn)區(qū)，成為全國的草莓大省。種草莓成為很多地方農(nóng)民調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，發(fā)展高效農(nóng)業(yè)，實(shí)現(xiàn)增收致富的好項(xiàng)目。草莓的栽培方式也已經(jīng)從露地栽培轉(zhuǎn)換到大棚栽培為主，上市時間為每年11月下旬至第二年5月初，上市期間為了保溫，大棚均需要加蓋雙層塑料棚膜，在這種封閉的生長條件下，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的草莓灰霉病很容易大范圍發(fā)生并流行，這是一種世界性病害，在很多蔬菜水果上均有發(fā)生[1]。

目前，生產(chǎn)上防治灰霉病的主打藥劑種類有苯并咪唑類、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（以下簡稱QoI）類、琥珀酸脫氫酶抑制劑（簡稱SDHI）類，苯胺基嘧啶類等藥劑[2-3]。本研究調(diào)查了江蘇省草莓主產(chǎn)區(qū)用來防控草莓灰霉病的主要藥劑，有腐霉利、撲海因、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺等，同時結(jié)合市場上銷售的防控灰霉藥劑，篩選出13種藥劑用來檢測省域范圍內(nèi)草莓灰霉的抗藥性水平。這些殺菌劑如嘧菌酯[4]、吡唑醚菌酯[5-6]、多菌靈[7]、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺都是單一作用位點(diǎn)殺菌劑，如果長期、多頻次使用，抗藥性會快速發(fā)展，另外很多地區(qū)對異菌脲[7-8]、啶酰菌胺[9-10]等藥劑產(chǎn)生了多重抗藥性。關(guān)于灰霉病菌抗藥性方面的報(bào)道，國內(nèi)外很多期刊屢見不鮮。本研究連續(xù)2年系統(tǒng)檢測江蘇省主要草莓種植地區(qū)灰霉病菌種群對13種常用殺菌劑的抗藥性水平，并闡明不同草莓種植地區(qū)灰霉病菌種群的多藥劑優(yōu)勢亞種群，因地制宜提出抗藥性治理策略，以期為江蘇省草莓灰霉病菌防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株的采集、分離和鑒定

2019、2020年4月分別收集到江蘇省南京溧水市、常州新北市、蘇州昆山市、泰州市、無錫市、徐州市以及鎮(zhèn)江市十幾個草莓園區(qū)隨機(jī)采取的草莓灰霉病菌，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室分離，挑單胞培養(yǎng)和鑒定，確定其為灰葡萄孢(Botrytis cinereaPers.)。共分離得到236株草莓灰霉病菌菌株（菌株信息見表1），所有菌株采用濾紙片法保存，置于-20℃冰箱中，備用。

表1 菌株信息

1.2 供試藥劑

供試藥劑信息見表2。

表2 藥劑信息

1.3 抗藥性檢測方法

1.3.1 多菌靈、咪鮮胺、腐霉利和戊唑醇的抗藥性檢測方法 采用區(qū)分劑量法測定供試菌株對多菌靈、咪鮮胺、腐霉利和戊唑醇的抗藥性，多菌靈、咪鮮胺、腐霉利和戊唑醇的區(qū)分劑量分別設(shè)置為10、5、10、5 mg/L[11]，培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA北京奧博星生物技術(shù)有限公司），以不含藥劑者為對照(CK)，接種后23℃培養(yǎng)3天觀察，平板上正常生長的為抗性菌株，不能正常生長的為敏感菌株。所有抗性菌株均進(jìn)行2次重復(fù)測定確認(rèn)。

1.3.2 撲海因、吡唑醚菌酯和環(huán)酰菌胺的抗藥性檢測方法 采用區(qū)分劑量法測定供試菌株對撲海因、吡唑醚菌酯和環(huán)酰菌胺的抗藥性，撲海因和吡唑醚菌酯的區(qū)分劑量均設(shè)置為10 mg/L[12]，環(huán)酰菌胺的區(qū)分劑量設(shè)置為5 mg/L，培養(yǎng)基采用1%MEA(Malt extract agar)培養(yǎng)基，包含氯霉素麥芽提取物瓊脂（青島海博生物科技有限公司）和瓊脂粉，以不含藥劑者為對照(CK2)，為防止旁路氧化[13]，嘧菌酯和吡唑醚菌酯及其對照培養(yǎng)基(CKS)中均含有SHAM 100 mg/L（SHAM：99%水楊肟酸(salicylhydroxamic acid)，由 Sigma-Aldrich 公 司 生產(chǎn)，溶于甲醇，配制成20000 mg/L的母液。均放于4℃保存?zhèn)溆谩?3℃培養(yǎng)3天后觀察，平板上正常生長的為抗性菌株，不能正常生長的為敏感菌株。所有抗性菌株均進(jìn)行2次重復(fù)測定確認(rèn)。

1.3.3 啶酰菌胺、氟吡菌酰胺和氟唑菌酰胺的抗藥性檢測方法 采用區(qū)分劑量法測定供試菌株對啶酰菌胺、氟吡菌酰胺和氟唑菌酰胺抗藥性，其區(qū)分計(jì)量為10 mg/L和5 mg/L[14]，培養(yǎng)用培養(yǎng)基為YBA培養(yǎng)基，制作藥皿，設(shè)不加藥劑空白對照(CK1)，23℃培養(yǎng)2天后觀察。平板上病菌孢子正常萌發(fā)、菌絲正常生長的確定為抗性菌株，不能正常生長的確定為敏感菌株。所有抗性菌株均進(jìn)行2次重復(fù)測定確認(rèn)。

1.3.4 嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺和咯菌腈的抗藥性檢測方法采用區(qū)分劑量法測定供試菌株對嘧霉胺和嘧菌環(huán)胺抗藥性，其區(qū)分計(jì)量為5 mg/L，咯菌腈為0.5 mg/L，培養(yǎng)用培養(yǎng)基為CZA培養(yǎng)基，制作藥皿，設(shè)不加藥劑空白對照(CK3)，23℃培養(yǎng)2天后觀察。平板上病菌孢子正常萌發(fā)、菌絲正常生長的確定為抗性菌株，不能正常生長的確定為敏感菌株。所有抗性菌株均進(jìn)行2次重復(fù)測定確認(rèn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)不同地區(qū)不同藥劑抗性菌株數(shù)量，分析其抗性水平。所有抗性菌株均進(jìn)行2次重復(fù)測定確認(rèn)。不同采樣點(diǎn)菌株抗性頻率計(jì)算見公式(1)。

統(tǒng)計(jì)分析抗性菌株的多藥劑抗性類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓灰霉病菌種群對藥劑的敏感性檢測結(jié)果

為準(zhǔn)確快速區(qū)分出供測菌株對13種藥劑的敏感性，以藥皿上灰霉孢子正常萌發(fā)生長的判定為抗性菌株，反之判定為敏感菌株。結(jié)果表明，2019年（119株）和2020年（117株）采集的236株灰霉病菌菌株中未檢測到對咯菌腈產(chǎn)生抗藥性的菌株，所有供試菌株對咯菌腈表現(xiàn)敏感，而對多菌靈、腐霉利、撲海因、吡唑醚菌酯產(chǎn)生抗性的菌株比例較高。2019年供試菌株中對多菌靈產(chǎn)生抗性的菌株比例高達(dá)51.92%，其次為撲海因46%，嘧霉胺43.35%，吡唑醚菌酯42.63%，腐霉利42.48%。2020年所采集的菌株對多菌靈、腐霉利、撲海因和吡唑醚菌酯抗性頻率均有所上升（圖1），抗性頻率分別為64.17%、49.11%、56.87%和67.39%。其中對戊唑醇的抗性頻率從2019年的6.06%上升到2020年的48.02%，嘧菌環(huán)胺和嘧霉胺的抗性頻率均有所下降。

圖1 2019年和2020年草莓灰霉病菌對13種藥劑的抗性頻率分布

2.2 不同地區(qū)草莓灰霉病菌種群對藥劑的抗藥性頻率

由圖2可知，不同地區(qū)由于施藥水平不同，用藥品種不同，管理模式不同，從而同一地區(qū)對不同藥劑的抗藥性水平具有顯著差異，不同地區(qū)對于同一藥劑的抗性水平也存在顯著性差異。

圖2 不同地區(qū)草莓灰霉病菌菌株對13種藥劑的抗藥性頻率

2019年南京溧水地區(qū)供測菌株對咪鮮胺、氟吡菌酰胺、環(huán)酰菌胺、咯菌腈敏感，對多菌靈、撲海因、吡唑醚菌酯、嘧菌環(huán)胺和嘧霉胺的抗性頻率高達(dá)91.67%，其次是腐霉利和啶酰菌胺，抗性頻率為75%和66.67%。2020年采自南京溧水的30株菌株，對咪鮮胺、氟唑菌酰胺、環(huán)酰菌胺和咯菌腈敏感，對多菌靈、撲海因和吡唑醚菌酯的抗性頻率超過70%，相較于2019年有所下降，對氟吡菌酰胺和嘧菌環(huán)胺的抗性頻率僅有6.66%。

2019年蘇州昆山地區(qū)供測菌株對咪鮮胺、環(huán)酰菌胺、咯菌腈敏感，對多菌靈、腐霉利、撲海因、吡唑醚菌酯的抗性頻率高達(dá)90%以上，抗性較高的還有嘧霉胺為85%、嘧菌環(huán)胺為70%、啶酰菌胺為40%。2020年采自蘇州昆山的26株菌株全部對氟唑菌酰胺、環(huán)酰菌胺和咯菌腈敏感，其中有2株對咪鮮胺敏感性下降；與2019年相比供測菌株對多菌靈、腐霉利、啶酰菌胺、撲海因、吡唑醚菌酯抗性頻率略有下降，對戊唑醇的抗性頻率有大幅度的提高。

2019年常州新北地區(qū)整體抗性水平較低，供測菌株對啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、環(huán)酰菌胺、嘧菌環(huán)胺和咯菌腈敏感，對多菌靈的抗性頻率最高，僅有27.78%。2020年常州新北采集的14株菌株對氟唑菌酰胺、環(huán)酰菌胺、咯菌腈敏感，對其他藥劑的抗藥性均有不同程度的升高，其中對戊唑醇的抗性頻率由2019年的5.55%上升至56.25%，對多菌靈、腐霉利、撲海因、吡唑醚菌酯的抗性頻率均上升到40%以上。

2019年泰州地區(qū)供測菌株對咪鮮胺、戊唑醇、氟吡菌酰胺、環(huán)酰菌胺和咯菌腈敏感，對多菌靈、腐霉利、撲海因、吡唑醚菌酯、嘧霉胺和嘧菌環(huán)胺的抗性頻率高達(dá)40%～65%。2020年供測菌株對多菌靈、戊唑醇、啶酰菌胺、撲海因和吡唑醚菌酯的抗性頻率均有上升，其中戊唑醇的抗性頻率上升了38.46%，上升最多，而對腐霉利、氟唑菌酰胺、嘧霉胺和嘧菌環(huán)胺的抗性頻率均有所下降。

2019和2020年無錫地區(qū)的檢測結(jié)果顯示，供試菌株對檢測藥劑的抗性頻率較低，均低于20%。2019年未檢測到對咪鮮胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、環(huán)酰菌胺、咯菌腈產(chǎn)生抗性的菌株，2020年未檢測到對多菌靈、腐霉利、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺和咯菌腈產(chǎn)生抗性的菌株。該地區(qū)以敏感菌株為優(yōu)勢種群。

2019年徐州地區(qū)供測菌株監(jiān)測結(jié)果顯示，供測菌株對咪鮮胺、戊唑醇、嘧菌環(huán)胺和咯菌腈敏感，對多菌靈的抗性頻率最高，高達(dá)66.67%，對其他藥劑的抗性頻率分布在22%～33%之間，2020年，供測菌株對多菌靈、腐霉利、戊唑醇、吡唑醚菌酯、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺的抗性頻率均有大幅度提高，對其他藥劑的抗性頻率均有不同程度下降，兩極分化比較明顯。

2019年鎮(zhèn)江供測菌株對供試藥劑的抗性頻率普遍偏低，2020年供測菌株對多菌靈(77.78%)、腐霉利(77.78%)、戊唑醇(55.56%)、撲海因(88.89%)和吡唑醚菌酯(77.78%)的抗性頻率較高，對其他藥劑均表現(xiàn)敏感。

2.3 草莓灰霉病菌種群抗藥性分析

由圖3可知，在區(qū)分計(jì)量濃度下，測定了各藥劑對供試菌株的抑菌率，結(jié)果顯示：供試菌株對咪鮮胺、咯菌腈、環(huán)酰菌胺、氟唑菌酰胺、氟吡菌酰胺敏感，未發(fā)現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)極少量抗性菌株，而且，藥劑對抗性菌株的抑菌率高達(dá)90%以上；供試菌株對戊唑醇、啶酰菌胺、嘧菌環(huán)胺抗性頻率在20%～25.4%，對腐霉利、撲海因的抗性頻率在58%～63%，雖然供試菌株對此5種藥劑的抗性頻率存在顯著性差異，但是藥劑對抗性菌株的抑菌率主要分布在70%以上，相比之下，供試菌株對多菌靈、吡唑醚菌酯和嘧霉胺的抗性頻率是64.40%、55.93%和35.04%，但多菌靈和嘧霉胺對抗性菌株的抑菌率均在10%以下，吡唑醚菌酯對抗性菌株的抑菌率主要分布在20%～30%。

圖3 各藥劑對供試菌株抑菌率分布

2.4 草莓灰霉病菌種群的多藥劑抗性表型分析

由圖4可知，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，重點(diǎn)選取了多菌靈(Car)、啶酰菌胺(Bos)、吡唑醚菌酯(Pyra)和嘧霉胺(Pyr)分析多藥劑抗性類型。結(jié)果表明，選取的123株抗性菌株，其抗藥性類型共有9種，單抗菌株有3種類型，分別為Pyra（R9株）、Car（R8株）和Pyr（R1株），占總抗性菌株中的比率為14.63%；雙抗菌株有3種類型，分別為CarRPyr（R4株）、CarRPyra（R20株）和CarRBos（R1株），占總抗性菌株中的比率為20.32%；三抗菌株有2種類型為CarRPyraRPyr（R29株）和CarRBosRPyra（R9株），占總抗性菌株中的比率為30.89%，四抗菌株CarRBosRPyraRPyr（R42株），占總抗性菌株中的比率為34.15%。

圖4 2019年和2020年江蘇省草莓灰霉病菌對4種藥劑的多藥劑抗性類型

2019年多藥劑抗性類型以三抗CarRPyraRPyrR)和四抗(CarRBosRPyraRPyrR)為主要類型，分別占2019年抗性菌株總數(shù)的36.21%和41.37%，其他類型比較少。2020年多藥劑抗性類型以雙抗(CarRPyraR)和四抗(CarRBosRPyraRPyrR)數(shù)量最多，均占2020年抗性菌株總數(shù)的27.69%，其次是單抗類型(PyraR)和三抗類型(CarRPyraRPyrR和 CarRBosRPyraR)，占 2020年測定菌株總數(shù)的13.85%、12.31%和12.31%?？傮w來看，供測菌株以四抗類型為主，其次是三抗類型CarRPyraRPyrR。

3 討論

本項(xiàng)目組測定的2019年和2020年的236株草莓灰霉病菌菌株，均由當(dāng)?shù)刂脖Ｖ矙z部門在本區(qū)域常年種植草莓基地采集，采集地區(qū)相對集中，數(shù)量雖少，但均有一定的代表性。供測菌株中，抗性菌株數(shù)量高達(dá)159株，其中2019年63株，占2019年供測菌株的52.9%，2020年96株，占2020年供測菌株的82.05%，由此看來，抗性菌株比例有上升的趨勢。筆者曾經(jīng)測定了上海地區(qū)2016年和2017年采集的草莓灰霉病菌菌株，抗性菌株比例也呈上升趨勢[15]。從單個藥劑分析來看，仍然是多菌靈的抗藥性穩(wěn)居榜首，這與文獻(xiàn)報(bào)道中，江蘇省南京溧水市、鎮(zhèn)江市草莓灰霉病菌對多菌靈產(chǎn)生了很高的抗藥性結(jié)果一致[16]。從2年的結(jié)果看，藥劑的使用頻次與抗性水平呈正相關(guān)，連續(xù)使用同一種藥劑防治，同一地區(qū)灰霉菌株抗性呈上升趨勢，且上升速度較快，輪換使用或間隔使用，抗性水平會略有下降，但同一類型藥劑之間會存在交互抗性[17]。2007年禮茜等[4]就報(bào)道浙江省2個地區(qū)已檢測出對撲海因產(chǎn)生的抗藥性達(dá)24%，2016年徐州市草莓灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性也高達(dá)53.76%[18]，隨著時間的推移，各地的抗藥性水平都有上升趨勢，即便是以敏感種群為主的地區(qū)，也需要在生產(chǎn)中注意藥劑的使用次數(shù)和輪換交替用藥的原則，保持田間菌株的敏感性，延長各種藥劑的使用壽命，高度重視草莓灰霉病菌的抗性問題[19-20]。

同時，藥劑敏感性下降并不意味著就失去了使用價值，本研究分析了檢測藥劑的抑菌率，從而將供測藥劑分為3種類型：（1）敏感性藥劑，供試菌株對這一類藥劑敏感，未發(fā)現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)極少量抗性菌株，田間仍以這類藥物的敏感菌株作為優(yōu)勢種群，如咪鮮胺、咯菌腈[21]、環(huán)酰菌胺、氟唑菌酰胺、氟吡菌酰胺。（2）敏感性下降的藥劑，這一類包含2種情況，一是像戊唑醇、啶酰菌胺、嘧菌環(huán)胺這類藥劑[22]，供試菌株的抗性頻率較低，部分菌株對這幾種藥劑產(chǎn)生抗藥性，敏感菌株頻率占80%以上，抗性菌株的抑菌率也都集中在80%以上，該藥劑在田間還是具有較好的使用效果；二是像腐霉利、撲海因這2種藥劑，雖然供試菌株中大部分都對此藥劑產(chǎn)生了抗藥性[23]，抗性頻率較高，但抗性倍數(shù)不高，各藥劑的抑菌率均集中在70%以上，此類菌株的抗性倍數(shù)在逐步發(fā)展過程中，即該類藥劑對田間菌株的抑菌率是逐漸下降的，下降速度與使用濃度和使用次數(shù)呈正相關(guān)，此類藥劑對于灰霉病依然有一定的防治效果，而且通過加大使用濃度和增加使用次數(shù)，可以提高防治效果。如果不加以治理，這一類藥劑很容易發(fā)展成為第三類藥劑。（3）即高抗性藥劑，如多菌靈[24]、嘧霉胺、吡唑醚菌酯，田間采集到的菌株對此類藥劑的抗藥性頻率較高，而且這類藥劑對抗性菌株的抑菌率大都在30%以下，即使加大用藥劑量和增加使用次數(shù)，防治效果也收效甚微。

另外，并不是病原菌產(chǎn)生了抗藥性的藥劑就失去了防治效果，產(chǎn)生了高頻率抗藥性的藥劑就沒有了使用價值，病原菌對腐霉利和撲海因的抗藥性頻率分別高達(dá)45.79%和51.43%，兩者之間不存在顯著性差異，但在區(qū)分計(jì)量濃度下，腐霉利對抗性菌株的抑菌率分布在60%～100%之間，而撲海因?qū)剐跃甑囊志史植荚?0%～80%之間，在田間使用過程中，提高藥劑的使用濃度和使用次數(shù)，對草莓灰霉病的防治依然可以達(dá)到較好的效果。但是第三類藥劑在區(qū)分計(jì)量濃度下，各藥劑對抗性菌株的抑菌率均低于10%，即使加大藥劑濃度或用藥次數(shù)，該類藥劑對抗性菌株的防治效果也微乎其微，因此一旦菌株對此類藥劑產(chǎn)生的抗藥性頻率較高，則要考慮更換藥劑[25-26]。由此可以區(qū)分對待，為指導(dǎo)農(nóng)戶用藥提供科學(xué)依據(jù)。

從藥劑的多藥劑抗性類型分布來看，田間草莓灰霉病菌的多藥劑抗性類型以CarRPyraR、CarRPyraRPyrR、和CarRBosRPyraRPyrR為主，2年來，多藥劑抗性緩慢發(fā)展，本項(xiàng)目組在2016—2017年連續(xù)檢測上海地區(qū)灰霉病菌的多種抗藥性發(fā)現(xiàn)其單抗菌株在逐漸向雙抗菌株發(fā)展，三抗菌株逐漸向四抗菌株發(fā)展，而且隨著藥劑的使用，單抗類型比例減少，逐漸向多抗類型演變[15]。江蘇省各地縣市區(qū)近幾年來一直大力推廣草莓綠色綜合防控技術(shù)，指導(dǎo)農(nóng)戶在生產(chǎn)過程中要注意不同種類藥劑的輪用混用，避免抗藥性的快速發(fā)展，部分地區(qū)在抗藥性治理方面成效顯著。