屈用函，袁恩平，張雪廷，王紹祥，王 燦，趙水靈，李 罡，顧 凡，張洪玲，趙昶靈，李桂瓊，陳杞臨

（1文山壯族苗族自治州農業(yè)科學院生態(tài)環(huán)境資源研究所，云南文山 663000；2文山壯族苗族自治州農業(yè)科學院蔬菜研究所，云南文山 663000；3云南農業(yè)大學農學與生物技術學院，昆明 650201）

0 引言

目前，云南省文山州主栽的辣椒(Capsicum annuum)品種是有370余年種植史的丘北辣椒系列；辣椒已成為文山州繼三七(Panax notoginseng)后的第二大生物產業(yè)[1]?！淖辖?號’是文山州大面積種植的、葉、花和果均具觀賞性的丘北辣椒紫色品種的典型代表[2]?！淖辖?號’葉片近軸面為紫綠，遠軸面的葉脈、葉柄及花瓣頂端的2/3和邊緣為紫色，莖淡紫，花瓣基部白色，具縱向紫色條紋；果實果尖向上，在果實剛形成時，果尖為紫色，其余部分為綠色，果實在生長過程中從尖端向中部、基部由綠變紫，青熟時呈濃郁、亮麗的紫色，老熟時呈紅色，即在發(fā)育過程中，果色表現綠紫→淡紫→濃紫→紅的規(guī)律性變化?？梢?，‘文紫椒1號’葉、莖、花和果可形成以紫為主要色相，清新淡雅，能表達神秘、冷靜和浪漫等情感的紫色審美客體[3]，極具觀賞價值。

研究表明，辣椒果色取決于其果皮中色素的組合和組織定位。果實的綠色源于葉綠素(chlorophyll，Chl)，紫色源于屬于黃酮類(flavonoid，Fla)的花色苷(anthocyanin，AN)，且最主要的AN為花翠素3-反式香豆酰蘆丁糖苷-5-葡萄糖苷，花翠苷分子中B環(huán)上的鄰位三羥基結構決定了果實的紫色，花翠素C3位上反式香豆?；ㄟ^分子內共色效應賦予該花翠苷在細胞中擁有足夠的穩(wěn)定性，Fla多為淡黃、黃色，而橙紅色則源于類胡蘿卜素(carotenoid，Car)類，主要為辣椒紅素(capsanthin，Cap)等[4-6]。

但是，不同發(fā)育階段‘文紫椒1號’果實呈色的色素組合和組織定位迄今未見報道。筆者探究‘文紫椒1號’紫色果實在不同發(fā)育階段的Chl、Fla、AN和Car的含量配比及果皮中色素的組織定位[5]，旨在為丘北辣椒在觀賞園藝中的應用和觀賞型新奇果色新品種的選育提供參考[7]。

1 材料與方法

1.1 大田試驗和材料的采集與預處理

2019年4月26日，在文山州硯山縣江那鎮(zhèn)子馬社區(qū)（104°21'28″E，23°35'12″N，平均海拔1541.90 m）完成‘文紫椒1號’苗的壟作式移栽，壟的長、寬和高分別為10 m、1 m和10 cm，株行距為45 cm×50 cm，壟上覆蓋銀灰色塑料農膜；7月15日和8月2日，分別隨機采集開花結果期、健康的植株12株，將其假植于塑料桶中，加土和水適量。在室內，據果長并結合老熟期紅色果色將果實分為5個發(fā)育階段，即長0.0～1.5、1.5～3.0、3.0～4.5、4.5～6.0 cm及老熟的紅色果實；將果實隨機分為2批，一批在冰上縱剖為兩半，剔取果皮，加液氮研磨成粉，凍存于-80℃?zhèn)溆糜谏睾康臋z測，另一批在果實縱向中部進行徒手橫切、鏡檢色素的組織定位。

1.2 果實色素含量配比的測定

1.2.1 色素含量的測定

（1）Chl和Car含量。果實的Chl含量([Chl])和Car含量([Car])用比色法測定，參考文獻[8]操作并略作修改。取果皮粉1.0000 g，加5～7 mL 80% CH3COCH3快速研磨成勻漿，濾入預先以鋁箔包裹的25 mL容量瓶，用80% CH3COCH3沖洗濾渣、定容，用“T6新世紀”紫外-可見分光光度計（北京普析通用有限責任公司）檢測濾液的A663.0、A646.0和A470.0，以鮮重(fresh weight，FW)計算果實的[Chl]和[Car]。

（2）總黃酮類含量。果實的總黃酮類含量(total flavonoid content，TFC)用 AlCl3比色法測定[9]，以蘆丁(rutin,Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)為標樣[10]；取果皮粉0.5000 g，加25 mL 60% C2H5OH[11]，在85℃水浴加熱2 h；取出冷卻，過濾、定容至50 mL；取5 mL濾液，加1 mL 10% NaNO2；5 min后，加1 mL 10% AlCl3·6H2O；10 min后，加8.0 mL 10% NaOH；靜置15 min后測反應液的A510.0；TFC 用標準曲線方程 Y=0.8268X+0.0068[R2=0.9996，Y為A510.0，X為蘆丁濃度(μg/mL)]計算，表示為“mg rutin equivalent(RE)/(g·FW)”。

（3）總花色苷含量。果實的總花色苷含量(total anthocyanin content，TAC)以色價度量[12-13]；取果皮粉0.5000 g，加含1% HCl(v/v)的CH3OH 30 mL研磨成勻漿，濾入以鋁箔包裹的50 mL容量瓶，定容，計算如式(1)[14]。

式中，A539.0和A657.0分別表示在539.0 nm和657.0 nm處的吸光值。

（4）Cap含量。果實的Cap含量([Cap])參照《食品添加劑辣椒紅》(GB 10783—2008)以及文獻[15]和[16]測定。取果皮粉1.0000 g，加CH3COCH3（含0.1%2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）約20 mL研磨成勻漿，定容至100 mL。果實[Cap]表示為

1.2.2 色素含量配比的計算 果實的色素含量配比，即[Chla]/[Chlb]、[Chl(a+b)]/[Car]、[Chl(a+b)]/TFC、[Chl(a+b)]/TAC、[Chl(a+b)]/[Cap]、TFC/TAC、TFC/[Cap]和TAC/[Cap]，均據各色素的含量計算。

1.3 果實色素組織定位的檢測

果實色素的組織定位用Zeiss蔡司Primo Star（北京汗盟紫星儀器儀表有限公司）基于徒手切片檢測，鏡檢果實縱向中部橫切片，據色相（綠、紫和橙紅）和色度判斷色素的定位和積累量[17-18]。

1.4 數據分析

生物學重復和含量檢測均重復2次；雙因素相關分析用SPSS 20.0完成。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)育階段‘文紫椒1號’果實的色素組合特征

2.1.1 [Chla]/[Chlb]特征在階段3，‘文紫椒1號’果實的[Chla]/[Chlb]最大，約為3.137，分別比階段1、2、4、5的[Chla]/[Chlb]約高18.83%、20.12%、0.34%、168.79%，而且，階段1的[Chla]/[Chlb]接近階段2的，階段3的[Chla]/[Chlb]又接近階段4的（圖1）。可見，從階段1到3時，果實的藍綠色加深，到階段4時，藍綠色仍較穩(wěn)定，從階段4到5（即老熟期）時，[Chla]/[Chlb]降至最低，果實由藍綠轉向黃綠（圖2A）；但是，果實在階段1到4時的藍綠均被AN的紫色掩蓋，階段5的黃綠則被Car的紅色掩蓋。

圖1 ‘文紫椒1號’果實在不同發(fā)育階段的葉綠素a/b和[葉綠素(a+b)]/[類胡蘿卜素]

2.1.2 [Chl(a+b)]/[Car]特征在階段2，‘文紫椒1號’果實的[Chl(a+b)]/[Car]最大，約為3.992，分別比階段1、3、4、5的[Chl(a+b)]/[Car]約高11.63%、3.54%、19.41%、11607.62%（圖1）。可見，果實在階段2和5時分別最綠、最紅（圖1，圖2A、B、E），但綠色被AN的紫色掩蓋。

2.1.3 [Chl(a+b)]/TFC特征在發(fā)育過程中，‘文紫椒1號’果實的[Chl(a+b)]/TFC的變化趨勢與[Chl(a+b)]/[Car]的相似（圖1、3）；階段2的[Chl(a+b)]/TFC也最大，約為0.011，分別比階段1、3、4、5的[Chl(a+b)]/TFC約高9.28%、2.91%、9.28%、381.82%（圖3）?？梢?，在階段1～4時，Fla導致的（淡）黃色的變幅較小，且（淡）黃色被Chl的綠色和AN的紫色掩蓋，而在階段5時，（淡）黃色則貢獻于果實的老熟果色（圖2C）。

圖2 ‘文紫椒1號’果實在不同發(fā)育階段的色素含量

圖3 ‘文紫椒1號’果實在不同發(fā)育階段的[葉綠素]/[總黃酮類]

2.1.4 [Chl(a+b)]/TAC特征在階段2，‘文紫椒1號’果實的[Chl(a+b)]/TAC最大，約為0.290，分別比階段1、3、4、5的[Chl(a+b)]/TAC約高 5.87% 、36.36%、141.51%、402.25%（圖4）?？梢?，在階段1和2時，果實因AN合成和積累較少而表現紫綠和綠變紫；從階段3到4時，果實因AN合成和積累量不斷增加而表現為紫色越來越濃；在階段5時，Chl和AN均迅速降解，不再貢獻于老熟期的果色（圖2A、D）。

2.1.5 [Chl(a+b)]/[Cap]特征在階段1，‘文紫椒1號’果實的[Chl(a+b)]/[Cap]最大，約為0.521，分別比階段2、3、4、5 的 [Chl(a+b)]/[Cap]約 高 38.84% 、32.22% 、256.71%、10316.00%（圖4）?？梢?，在階段4時，果實Cap合成量開始明顯增加，但Cap的紅色被Chl的綠色和AN的紫色掩蓋；在階段5時，Cap合成量最大，同時Chl和AN大量、迅速降解，果實主要展示Cap的紅色（圖2A、E，圖4）。

圖4 ‘文紫椒1號’果實在不同發(fā)育階段的[總葉綠素]/[總花色苷]和[葉綠素]/[辣椒紅素]

2.1.6 TFC/TAC特征從階段1到4，‘文紫椒1號’果實的TFC/TAC持續(xù)下降至最低值，即從約28.20下降至約12.34；從階段4到5，TFC/TAC重新上升至約接近階段2時的水平（圖5）?？梢?，在階段3至4時，果實Fla主要為AN而導致果實的紫色在階段4最濃，而階段5時TFC/TAC的上揚應與老熟期果實中AN的大量、快速降解有關；在整個發(fā)育過程中，Fla主要充當AN的共色素而穩(wěn)定AN的紫色[19]（圖2C、D，圖5）。

2.1.7 TFC/[Cap]特征在發(fā)育過程中，‘文紫椒1號’果實的TFC/[Cap]的變化趨勢與[Chl(a+b)]/[Cap]的相似（圖4～5）。在階段1，果實的TFC/[Cap]最高，約為53.57，分別比階段2、3、4、5的TFC/[Cap]約高51.10%、40.26%、257.43%、2246.42%（圖5）。可見，在階段1至4時，果實TFC/[Cap]維持在較高水平，但呈現下降趨勢，在階段5時，Cap合成量劇增，故TFC/[Cap]驟降至最低（圖2C、E，圖5）。

圖5 ‘文紫椒1號’果實在不同發(fā)育階段的[總黃酮類]/[總花色苷]和[總黃酮類]/[辣椒紅素]

2.1.8 TAC/[Cap]特征在發(fā)育過程中，‘文紫椒1號’果實的TAC/[Cap]的變化趨勢與[Chl(a+b)]/[Cap]和TFC/[Cap]的相似（圖4～6）。在階段1，果實的TAC/[Cap]最高，約為1.90，分別比階段2、3、4、5的TAC/[Cap]約高47.04%、2.65%、56.35%、2085.73%（圖6）。可見，在階段1至4時，果實TAC/[Cap]波動式維持在較高水平，在階段5時，Cap合成量加劇，導致TFC/[Cap]驟降至最低（圖2E，圖6）。

圖6 ‘文紫椒1號’果實在不同發(fā)育階段的[總花色苷]/[辣椒紅素]

2.2 不同發(fā)育階段‘文紫椒1號’果實色素的組織定位特征

‘文紫椒1號’果實果皮橫切面上細胞群的呈色模式表明，果色相關色素主要定位在中果皮細胞中；在果實發(fā)育中，果皮細胞群的色相和色度變化趨勢與果色的高度一致（圖7）。在階段1，綠色的Chl和較少的紫色AN主要集中于中果皮細胞中；階段2～4，紫色的AN在中果皮、外果皮細胞中的積累量增加，AN同時向內果皮擴展，將Chl的綠色完全掩蓋，該現象與積累AN的綠色葉片的呈色恰好相反[20]，到階段4時，外、中和內果皮成片呈紫褐色；在階段5時，外、中和內果皮中紫色的AN和綠色的Chl快速消失，果皮顯示Car的橙紅色[21]（圖7）。

圖7 不同發(fā)育階段‘文紫椒1號’果實果皮中色素的組織定位和積累量

2.3 ‘文紫椒1號’果實在發(fā)育過程中[Chla]、[Chlb]、[Chl(a+b)]、[Car]、TFC、TAC和[Cap]的相關性特征

Pearson相關系數（表1）表明，在發(fā)育過程中，‘文紫椒1號’果色色素含量之間呈不同的相關性。其中，[Chla]與[Chlb]之間、[Chla]與[Chl(a+b)]之間、[Chlb]與[Chl(a+b)]之間以及[Car]與[Cap]之間均呈極顯著正相關；[Chla]與TFC、TAC之間，[Chlb]與TAC之間，[Chl(a+b)]與TAC之間，[Car]與TFC之間以及TFC與TAC、[Cap]之間均呈不顯著正相關；[Chlb]與[Car]之間呈極顯著負相關；[Chla]與[Car]、[Cap]之間，[Chlb]與[Cap]之間以及[Chl(a+b)]與[Car]、[Cap]之間均呈顯著負相關；[Chlb]與TFC之間、[Chl(a+b)]與TFC之間、[Car]與TAC之間以及TAC與[Cap]之間均呈不顯著負相關。

3 結論與討論

作為丘北辣椒紫色品種的典型代表，‘文紫椒1號’的果色在果實發(fā)育過程中呈現由綠變紫，最終由紫快速變紅，極具觀賞價值的規(guī)律性變化[2]，但該品種果色色素的組合和組織定位特征迄今未見報道。通過將‘文紫椒1號’果實的發(fā)育過程分為5個階段，本研究發(fā)現，在‘文紫椒1號’果實發(fā)育中，果實[Chla]/[Chlb]的最大值出現在發(fā)育階段3，[Chl(a+b)]/[Car]、[Chl(a+b)]/TFC和[Chl(a+b)]/TAC的均出現在階段2，而[Chl(a+b)]/[Cap]、TFC/TAC、TFC/[Cap]和TAC/[Cap]的均出現在階段1（圖1）；[Chla]、[Chlb]、[Chl(a+b)]、[Car]、TFC、TAC和[Cap]的相關性不盡一致，其中，TAC與[Chl(a+b)]、TFC之間均呈不顯著正相關，而與[Car]之間呈不顯著負相關，[Cap]則與[Chl(a+b)]、[Car]、TFC和TAC之間分別呈顯著負相關、極顯著正相關、不顯著正相關和不顯著負相關（表1），這與文獻[5]報道的結果不完全一致，意味著‘文紫椒1號’果色隨果實發(fā)育階段的變化在色素組合層面具備特殊性；同時，果色色素主要定位在中果皮細胞中，在果實發(fā)育中，果皮細胞的色相和色度變化趨勢與果色的高度一致（圖7）。所以，‘文紫椒1號’的果色源于果皮細胞Chl、Car（含Cap）和Fla（含AN）色素的發(fā)育階段差異性組合。但是，本研究暫未探究‘文紫椒1號’果實Chl、Fla、AN、Car和Cap合成、降解相關的關鍵結構基因和調節(jié)基因種類及其果實發(fā)育階段依賴性表達模式，所以，挖掘這些結構基因和以轉錄因子基因為代表的調節(jié)基因，澄清其在果實發(fā)育過程中的表達動態(tài)和調控網絡，將有望在基因層面明確果色色素代謝對‘文紫椒1號’等丘北辣椒果色的決定及其對辣椒產量和品質形成的效應[22]。

表1 ‘文紫椒1號’果實在發(fā)育過程中各色素含量間的Pearson相關系數

近年來，丘北辣椒已成為云南文山州的經濟支柱產業(yè)之一[23]，在全州乃至全省經濟發(fā)展、鄉(xiāng)村脫貧致富和振興方面發(fā)揮著重要作用，但是，丘北辣椒長期以來主要作為蔬菜類經濟作物創(chuàng)造效益。事實上，300余年來，器官顏色的豐富變化一直是丘北辣椒地方特色的重要內涵和表現之一[24]。目前，丘北辣椒觀賞價值的開發(fā)與利用已見端倪。以‘文紫椒1號’為代表的丘北辣椒紫色品種極具觀賞性的屬性有望從觀賞園藝作物開發(fā)的角度為丘北辣椒產業(yè)鏈的延伸和經濟效益的提升打開一個新的視角。具體而言，‘文紫椒1號’紫色的葉、莖、花和果，尤其是變化的果色，可構建成清新淡雅、神秘浪漫的審美客體，同時具備觀葉、觀花和觀果價值[3]，可用于室內和庭院擺放以及公園綠化、花壇、花境和現代農業(yè)觀光園等的布置[7,25]?？梢?，以紫果為代表的表型可實現丘北辣椒從傳統(tǒng)、單純的蔬菜用經濟作物向觀賞型經濟作物的轉型，從而拓展、提升丘北辣椒的社會、經濟價值。