張明亮，耿亞春，連凱琪，馬 磊，常 瑩，王雙山，張福良

（1.安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安陽 455000;2.河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，安陽 455000）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的豬的高度接觸性腸道傳染性疾病，其臨床癥狀包括嚴(yán)重腹瀉、脫水和嘔吐，仔豬死亡率最高，可達(dá)90%[1-3]。該病的流行給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此,對(duì)該病的診斷和防控具有重大意義[4-6]。1971年，該病在英國首次暴發(fā)，之后迅速在歐洲各國發(fā)現(xiàn)[7]。1978年成功分離到該病病原體，并命名為PEDV CV777[8]。M蛋白是PEDV重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，也是病毒囊膜蛋白中含量最豐富的蛋白。該蛋白介導(dǎo)了病毒的裝配，還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生α-干擾素。因此，PEDV M蛋白被認(rèn)為是檢測和制備基因工程產(chǎn)品的有效候選抗原[9-10]。生物信息學(xué)分析在促進(jìn)建立和完善傳染病的診斷試劑、疫苗研制及抗體工程等方面具有重要作用。然而，針對(duì)M蛋白的生物信息學(xué)分析及蛋白表達(dá)的報(bào)道很少，本研究克隆了截短的M基因（rM），分析了rM蛋白的結(jié)構(gòu)特征，并對(duì)該基因進(jìn)行原核表達(dá)，以期為基于該蛋白檢測及預(yù)防性生物制品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料、試驗(yàn)動(dòng)物、菌種及質(zhì)粒 表達(dá)載體pET-28a（+）、采集于豫北某豬場的PEDV陽性病料（小腸）、PEDV陽性血清及陰性血清均由河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室保存；6月齡體重約3 kg的雌性新西蘭大白兔購自河南信誠有康生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 DL15000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、病毒RNA提取試劑盒、pMD18-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ及XhoⅠ均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自莫納生物科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；包涵體純化試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色液、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗豬二抗均購自Proteintech公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 病料RNA提取 參照病毒RNA提取試劑盒說明書提取病料RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 參照GenBank公布的PEDVM基因序列（登錄號(hào)：NC_003436.1），采用DNAStar軟件進(jìn)行基因的親/疏水性分析，選取親水性較好的基因片段，命名為rM，并設(shè)計(jì)合成特異性引物。 引物序列為：MF：5′-CCGGAATTCATG-ACACATTCTTGGTGGT-3′（下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）；MR：5′-CCGCTCGAGTTAGACTA-AATGAAGCACT-3′（下劃線處為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 截短的M基因擴(kuò)增及鑒定 以得到的cDNA為模板，用引物MF、MR擴(kuò)增截短的M基因片段。PCR反應(yīng)體系50 μL：5×PCR Buffer 5 μL，TaqHS 0.25 μL，MF/MR各0.5 μL，cDNA模板8 μL，滅菌去離子水35.75 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將得到的截短的M基因連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定正確后，命名為pMD18-T-rM，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.4 rM蛋白氨基酸序列特征分析 利用生物信息學(xué)軟件分析rM蛋白氨基酸序列，預(yù)測rM蛋白的結(jié)構(gòu)特征，軟件信息及功能見表1。

表1 生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)址Table 1 Bioinformatics softwares and websites

1.2.5 重組菌株的構(gòu)建及鑒定 將測序正確的質(zhì)粒pMD18-T-rM與原核表達(dá)載體pET-28a（+）同時(shí)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收酶切片段并連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，小批量提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確后，重組質(zhì)粒命名為pET-28a-rM，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定正確的重組菌株命名為BL21（pET-28a-rM）。 將原核表達(dá)載體pET-28a（+）轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，鑒定正確的重組菌株命名為BL21（pET-28a）。

1.2.6 rM蛋白的可溶性檢測及誘導(dǎo)表達(dá) 挑取重組菌株BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）單菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素），37 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)菌液按比例1∶100接種于5 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素），37 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，至D600 nm值約為0.6時(shí)，分別加入終濃度為0.5、0.8、1.0和1.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)12 h后，取2 mL菌液，12 000 r/min離心后棄上清，PBS 10倍濃縮重懸，分別在重懸菌液中加入適量的5×Loading Buffer，煮沸10 min，SDS-PAGE檢測蛋白的表達(dá)情況。待電泳完畢，將膠塊置于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色2 h，將染色后的膠塊置于脫色液中脫色；將誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）分別離心，無菌PBS洗滌2遍，適量PBS重懸沉淀。將重懸菌液置于小燒杯中，并在冰浴中超聲破碎，待菌體破碎完全時(shí)，取出菌液，12 000 r/min離心10 min，取上清及沉淀，之后用適量PBS重懸沉淀。在重懸液中加入適量的5×Loading Buffer，煮沸10 min，SDS-PAGE檢測上清及沉淀中蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7 rM蛋白的純化 將誘導(dǎo)表達(dá)的BL21（pET-28a-rM）離心，用無菌生理鹽水洗滌2遍，量取適量的生理鹽水將菌體重懸，將裝有重懸菌液的容器置于冰浴中，進(jìn)行超聲破碎，待破碎完全時(shí)，取出菌液。12 000 r/min離心10 min，取適量的Binding Buffer溶解沉淀。用0.8 μm濾器過濾沉淀溶解液，將濾液加入平衡好的His標(biāo)簽蛋白純化鎳柱，進(jìn)行rM蛋白的純化。待濾液與柱子作用一段時(shí)間后，向柱子中加入適量洗脫液洗脫rM蛋白，最后用SDS-PAGE檢測純化后的rM蛋白。

1.2.8 rM蛋白的Western blotting檢測 將誘導(dǎo)表達(dá)的BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）的蛋白樣品轉(zhuǎn)印PVDF膜。結(jié)束轉(zhuǎn)膜后，將膜置于封閉液中封閉4 h。以感染PEDV豬的陽性血清為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗，ECL發(fā)光液顯色、拍照。

1.2.9 rM蛋白多克隆抗體的制備及效價(jià)檢測 將0.5 mg純化的rM蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，背部皮下分點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔。分別在14和28 d各加強(qiáng)免疫一次（0.5 mg rM蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化）。在第3次免疫后的1周采集動(dòng)物血液，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.10 rM蛋白多克隆抗體效價(jià)檢測 將準(zhǔn)備好的rM抗原用包被液稀釋至一定的濃度，加入96孔ELISA板，100 μL/孔，4 ℃包被過夜；PBST洗滌3遍，每次10 min，將封閉液加入96孔ELISA板，200 μL/孔，37 ℃孵育2 h；將待檢測樣本按照相應(yīng)稀釋度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400）加入包被好的相應(yīng)的96孔ELISA板中，37 ℃孵育45 min；PBST洗滌3遍，每次10 min，加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗豬二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min；PBST洗滌3遍，每次10 min，加入TMB顯色液，100 μL/孔，避光顯色10 min，加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，100 μL/孔，酶標(biāo)儀檢測各孔的D450 nm值。

2 結(jié) 果

2.1 截短的M基因擴(kuò)增及鑒定

以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在約366 bp處觀察到目的條帶（圖1）。截短的M基因與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化后，提取質(zhì)粒，采用XhoⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切，得到大小約2 692和366 bp的條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果表明，克隆序列與GenBank中登錄的M基因序列一致，表明成功克隆得到了截短的M基因序列。

M,DL2000 DNA Marker；1～3,截短的M基因；4，陰性對(duì)照M,DL2000 DNA Marker;1-3,Truncated M gene;4,Negative control圖1 截短的M基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of truncated M gene

M1,DL2000 DNA Marker；1,陰性對(duì)照；2,雙酶切結(jié)果；3,截短的M基因；M2,DL15000 DNA MarkerM1,DL2000 DNA Marker;1,Negative control;2,Double enzyme digestion results;3,Truncated M gene;M2,DL15000 DNA Marker圖2 質(zhì)粒pMD18-rM酶切鑒定Fig.2 Double enzyme identification of plasmid pMD18-rM

2.2 rM蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam預(yù)測rM蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果表明，rM蛋白由121個(gè)氨基酸數(shù)組成，其分子式為C575H909N153O173S2，分子質(zhì)量為12.8 ku，該蛋白的理論等電點(diǎn)（pI）為8.89，為堿性蛋白質(zhì)，氨基酸殘基中Ser（10.7%）、Thr（12.4%）頻率較高，帶負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為6個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為8個(gè)。 其消光系數(shù)為22 460，不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為20.91（<40），屬于穩(wěn)定類蛋白，因?yàn)樾蛄械腘-端是Thr，估計(jì)在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞的半衰期是7.2 h。疏水指數(shù)為95.70，總平均疏水性（GRAVY）為0.242，屬于疏水類蛋白。 使用ProtScale中的Kyte & Doolittle對(duì)rM蛋白的疏水性進(jìn)行預(yù)測（windows size=9），該蛋白序列具有較高的疏水性，在第28位氨基酸處分值最高（1.933），疏水性最強(qiáng)；在第99位氨基酸處分值最低（-1.844），親水性最強(qiáng)。主要疏水部位分布在第16-18、21-57、59-78、90-92和106-108位氨基酸處，主要親水性部位分布在第5-14、79-89、93-105和109-112位氨基酸處。因此，綜合分析該蛋白為疏水性蛋白。

2.3 rM蛋白結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)rM氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，保守結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?-116位氨基酸。糖基化位點(diǎn)分析顯示，rM蛋白無N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)。rM共存在21個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為12個(gè)Ser、8個(gè)Thr和 1個(gè)Tyr（圖3）。

圖3 rM蛋白磷酸化位點(diǎn)分析Fig.3 Analysis of phosphorylation site of rM protein

氨基酸序列分析顯示，rM蛋白無信號(hào)肽（圖4），但有跨膜區(qū)（圖5）。該蛋白含有4個(gè)B細(xì)胞線性結(jié)合位點(diǎn)和7個(gè)T細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)。生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示，rM蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由延伸鏈和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，占比分別為33.88%和48.76%，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角分別占8.26%和9.09%（圖6）。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，蛋白序列與PDB數(shù)據(jù)庫中6xdc.1.A模板序列的相似性為22.09%（圖7）。

圖4 rM蛋白信號(hào)肽預(yù)測分析Fig.4 Prediction and analysis of signal peptide of rM protein

圖5 rM蛋白跨膜預(yù)測分析Fig.5 Prediction and analysis of protein transmembrance of rM protein

圖6 rM蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Secondary structure analysis of rM protein

圖7 三維結(jié)構(gòu)同源模型Fig.7 Three-dimensional homology model

2.4 重組菌株BL21（pET-28a-rM）的構(gòu)建及鑒定

用T4 DNA連接酶將回收后的截短的M基因和線性化的載體pET-28a（+）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后，使用XhoⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切消化，經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約5 300和366 bp的條帶（圖8），與預(yù)期相符。測序正確的質(zhì)粒pET-28a-rM轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，獲得鑒定正確的重組菌株BL21（pET-28a-rM）。

M,DL15000 DNA Marker；1,pET-28a-rM雙酶切；2,pET-28a（+）雙酶切；3，截短的M基因M,DL15000 DNA Marker;1,Double enzyme digestion of pET-28a-rM;2,Double enzyme digestion of pET-28a（+）;3,Truncated M gene圖8 重組質(zhì)粒pET28a-rM酶切鑒定Fig.8 Enzyme identification of recombinant plasmid pET28a-rM

2.5 rM蛋白的表達(dá)與純化

2.5.1 rM蛋白的表達(dá) 將IPTG誘導(dǎo)過的重組菌株BL21（pET-28a-rM）、BL21（pET-28a）超聲破碎，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)染色2 h，脫色液脫色過夜。在約15 ku處有蛋白條帶，其中，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為1 mmol/L時(shí)蛋白表達(dá)量最高（圖9）。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，空載體；2～5，IPTG濃度分別為0.5、0.8、1.0和1.5 mmol/LM，Protein Marker;1，Empty vector;2-5，The concentrations of IPTG were 0.5,0.8,1.0 and 1.5 mmol/L,respectively圖9 SDS-PAGE檢測rM蛋白表達(dá)情況Fig.9 Expression of rM protein detected by SDS-PAGE

2.5.2 rM蛋白的可溶性檢測 將重組菌株BL21（pET-28a-rM）和BL21（pET-28a）置于200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后，破碎菌體，對(duì)處理后的上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測。由圖10可知，上清中無條帶出現(xiàn)，沉淀中有大小約15 ku的蛋白條帶，說明目的蛋白以包涵體形式存在于沉淀中。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，空載體；2，沉淀；3，上清M，Protein Marker;1，Empty vector;2，Supernatant;3，Precipitate圖10 rM蛋白可溶性檢驗(yàn)Fig.10 Detection of rM protein solubility

2.5.3 rM蛋白的純化 將誘導(dǎo)后的沉淀溶解后，進(jìn)行rM蛋白的純化，對(duì)收集的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測，得到了大小約為15 ku、純度較高的rM蛋白（圖11）。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，空載體；2，純化后的rM 蛋白M，Protein Marker;1，Empty vector;2，Purified rM protein圖11 純化蛋白rM檢測Fig.11 Detection of purified protein rM

2.6 重組蛋白的 Western blotting 檢測

以PEDV陽性血清作為一抗，對(duì)該蛋白進(jìn)行Western blotting檢測,結(jié)果顯示，在約15 ku處出現(xiàn)了特異性條帶，表明原核表達(dá)的rM蛋白能與PEDV陽性血清發(fā)生較好的免疫反應(yīng)，而對(duì)照菌株不能發(fā)生反應(yīng)（圖12）。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，空載體；2，重組菌株M，Protein Marker;1，Empty vector;2，Recombinant bacteria圖12 Western blotting檢測結(jié)果Fig.12 Western blotting results

2.7 多克隆抗體滴度測定

以表達(dá)的rM蛋白包被ELISA板，檢測得到抗體的效價(jià)為1∶51 200（圖13）。

圖13 多克隆抗體效價(jià)測定Fig.13 Determination of polyclonal antibody titer

3 討 論

自20世紀(jì)80年代中國首次分離到PEDV之后，很多省份及地區(qū)陸續(xù)報(bào)道了該病原的感染，PEDV已成為制約中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要傳染病之一，因此對(duì)PEDV的及早診斷對(duì)于控制豬流行性腹瀉具有重要意義[11]。PEDV屬冠狀病毒科成員，具有與其他冠狀病毒屬成員相似的病毒粒子形態(tài)[12-13]。傳統(tǒng)的診斷方法主要實(shí)施病毒分離、免疫組化等技術(shù)，然而該病毒分離較困難，采用PEDV結(jié)構(gòu)蛋白作為診斷抗原開發(fā)快速、簡便的診斷方法是目前檢測類產(chǎn)品發(fā)展的趨勢。M蛋白是PEDV眾多結(jié)構(gòu)蛋白中較為保守的蛋白。然而研究表明，冠狀病毒的M蛋白表達(dá)較困難[14-15]。因此，有必要對(duì)該蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測與分析，選擇成熟的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該蛋白，為進(jìn)一步研究M蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。本研究利用生物信息學(xué)軟件對(duì)截短的M蛋白的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)信息進(jìn)行了預(yù)測和分析。跨膜區(qū)預(yù)測顯示該蛋白存在跨膜區(qū)，推測該蛋白主要以包涵體形式存在，這可為后續(xù)的純化及研究奠定基礎(chǔ)。該蛋白存在21個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，推測可能與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白定位有關(guān)系。

盡管有報(bào)道指出M蛋白可通過真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，然而較低的蛋白獲得量及較高的成本限制了其應(yīng)用的范圍。原核表達(dá)以其高效、低成本的優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用到生物技術(shù)中。吳凌等[16]構(gòu)建了攜帶PEDVM基因的原核表達(dá)載體，但該載體在多種宿主細(xì)胞中并未表達(dá)。本研究初期曾嘗試將M基因全基因克隆至原核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，但未成功。Utiger等[17]研究結(jié)果表明，冠狀病毒的M蛋白在體外表達(dá)較困難，可能與M蛋白對(duì)細(xì)菌的毒性有關(guān)。Chen等[18]也通過原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)M蛋白進(jìn)行了表達(dá)，但在試驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)宿主菌有被抑制的現(xiàn)象，推測可能完整的M蛋白在細(xì)胞內(nèi)蓄積之后，破壞了宿主菌的細(xì)胞壁，引起了細(xì)菌的死亡。蛋白的親/疏水性程度與蛋白的表達(dá)有密切關(guān)系[19-20]。本研究選取了M基因親水性較高的一段基因進(jìn)行了表達(dá)，獲得了高純度的截短M蛋白。盡管很多研究涉及該蛋白的體外表達(dá)，但缺乏相應(yīng)的條件摸索，這也可能導(dǎo)致了表達(dá)失敗。本研究對(duì)重組蛋白的表達(dá)體系進(jìn)行了優(yōu)化，在37 ℃、1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h的條件下rM蛋白的表達(dá)量最高。

4 結(jié) 論

本研究成功獲得了高純度、截短的PEDV M蛋白，制備了高滴度的兔抗多克隆血清，對(duì)開發(fā)基于該截短蛋白的PEDV亞單位疫苗及檢測生物制品的研發(fā)具有重要意義。