劉曉瑋，李瑞香，王興龍，李 曉

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100；2.動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，臨渭 714000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100）

林麝（Moschusberezovskii）在世界自然保護(hù)聯(lián)盟紅色名錄中被列為瀕危物種[1]，是中國(guó)珍稀瀕危物種[2]，對(duì)于中國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展有重要影響[3]。由成年雄性林麝分泌的麝香[4]，不僅是中藥中不可缺少的成分，而且在香水工業(yè)中也被廣泛使用[5]。由于市場(chǎng)對(duì)麝香的高需求，大量的野生林麝被狩獵以供應(yīng)麝香貿(mào)易，導(dǎo)致野生林麝的數(shù)量迅速減少[6]。為控制這種情況的持續(xù)發(fā)展并滿足市場(chǎng)對(duì)麝香的需求，中國(guó)自1958年以來(lái)大力支持人工飼養(yǎng)林麝，并逐漸擴(kuò)大規(guī)模[7]。林麝是一種膽小、警惕和孤獨(dú)的動(dòng)物[8]，與野生林麝相比，在圈養(yǎng)環(huán)境中種群易患腹瀉[9-10]、肺炎等疾病[11-12]，同時(shí)遺傳多樣性可能會(huì)降低。因此，分析遺傳多樣性對(duì)林麝資源的保護(hù)和利用具有關(guān)鍵性作用[13]。

彭紅元等[14]使用生物進(jìn)化距離（NJ）、統(tǒng)計(jì)特征（ML）和離散特征（MP）3種構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)常用方法研究麝與鹿的親緣關(guān)系，其中，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（Neighbor-Joining tree）利用樹(shù)狀分支圖形可以直觀地體現(xiàn)各物種間的親緣關(guān)系。Su等[15]利用細(xì)胞色素b （cytochrome b,Cytb）基因序列研究表明，麝與鹿科有較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。Guha等[16]基于線粒體Cytb基因部分片段分析了麝等各類群的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，結(jié)果顯示，麝與牛、鹿的關(guān)系更為密切。肖宇辰等[17]研究發(fā)現(xiàn)，麝科動(dòng)物的演化史可能起源于北亞，以中國(guó)為中心，由北向南呈輻射狀擴(kuò)散[18]。目前麝屬中有原麝（Moschusmoschiferus）、林麝（Moschusberezovskii）、馬麝（Moschuschrysogaster）、黑麝（Moschusfuscus）、安徽麝（Moschusanhuensis）及喜馬拉雅麝（Moschusleucogaster），了解它們之間的關(guān)系是進(jìn)行有效保護(hù)的前提[19]。

Cytb基因和D-loop區(qū)是種群遺傳多樣性研究中常用到的2個(gè)分子標(biāo)記。線粒體DNA（mtDNA）是研究物種遺傳多樣性的一種重要遺傳物質(zhì)，存在于真核生物中，在結(jié)構(gòu)和功能上與核DNA有明顯差異[20]，為群體遺傳學(xué)的研究提供了極大的便利[21]。mtDNA中的Cytb基因進(jìn)化速度適中，一個(gè)較小的基因片段可以包含從種內(nèi)到種間乃至科間的遺傳進(jìn)化信息，比較適用于生物系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究[22]。mtDNA中的非編碼序列置換環(huán)（D-loop）是長(zhǎng)度變異最大的區(qū)域[23]，其序列變異不僅包括核苷酸之間的替換，還包括核苷酸之間的缺失、插入和串聯(lián)重復(fù)[24]。本研究通過(guò)對(duì)陜西林麝樣品mtDNACytb基因和D-loop區(qū)序列進(jìn)行相關(guān)分析，探究陜西林麝的進(jìn)化關(guān)系及遺傳多樣性，以期為進(jìn)一步保護(hù)和利用遺傳資源提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取陜西渭南市鳳縣林麝養(yǎng)殖場(chǎng)人工圈養(yǎng)的43只林麝，非損傷法采集毛發(fā)，存放于裝有無(wú)水乙醇的離心管，用封口膜進(jìn)行密封保護(hù)，分裝編號(hào)后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

DL2000 DNA Marker、核酸染料均購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；瓊脂糖購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司；2×TaqPCR MasterMix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Chelex-100試劑盒購(gòu)自天津諾維萊博科技有限公司。

超純水儀（Uitra Genetic）購(gòu)自威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司；全自動(dòng)高壓滅菌鍋（SQ810C）購(gòu)自上海爾迪儀器科技有限公司；超微量分光光度計(jì)（DS-11）購(gòu)自廣州深華生物技術(shù)有限公司；PCR儀（S1000）和全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（Geldoc XR+）均購(gòu)自時(shí)代聯(lián)想生物科技有限公司；電泳儀（JY-SPCT）購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 基因組DNA提取

按照Chelex-100試劑盒操作說(shuō)明從林麝毛發(fā)中提取基因組DNA[25]，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并合成Cytb基因[26]及D-loop區(qū)[3]引物，引物信息見(jiàn)表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系40 μL：TaqDNA聚合酶20 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板6 μL，超純滅菌水10 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取鑒定正確的PCR產(chǎn)物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行純化，并在Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer測(cè)序儀上雙向測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序峰圖和堿基的準(zhǔn)確性進(jìn)一步核對(duì)，統(tǒng)計(jì)序列堿基組成，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行 BLAST比對(duì)。利用ClustalX 2.0軟件對(duì)所有序列進(jìn)行整合比對(duì)，以獲得群體中核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。采用DNASP 5.10軟件統(tǒng)計(jì)種群序列核苷酸多樣性（Pi）、序列的單倍型數(shù)（H）、單倍型多樣度（Hd）、平均核苷酸差異數(shù)（K）等參數(shù)；運(yùn)用Mega 7.0軟件計(jì)算Cytb基因和D-loop區(qū)序列不同單倍型間遺傳距離，并構(gòu)建Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)林麝群體（表2）的遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增

對(duì)林麝樣品進(jìn)行mtDNACytb基因和D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，Cytb基因和D-loop區(qū)擴(kuò)增條帶整齊明亮，大小分別為472和669～711 bp（圖1、2），均與預(yù)期片段大小相符，符合測(cè)序要求。

M，DL2000 DNA Marker；1～5，Cytb基因PCR產(chǎn)物M，DL2000 DNA Marker；1-5，PCR products of Cytb gene圖1 林麝Cytb基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of Cytb gene in Moschus berezovskii

M，DL2000 DNA Marker；1～5，D-loop區(qū)PCR產(chǎn)物M，DL2000 DNA Marker；1-5，PCR products of D-loop region圖2 林麝D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of D-loop region in Moschus berezovskii

2.2 Cytb基因和D-loop區(qū)序列堿基組成

林麝群體Cytb基因和D-loop區(qū)序列的堿基組成見(jiàn)表3。由表3可知，所有樣品Cytb基因序列長(zhǎng)度為472 bp，經(jīng)NCBI系統(tǒng)BLAST查詢后確定為Cytb基因；4種核苷酸T、C、A、G的平均含量分別為30.9%、18.8%、30.9%及19.4%，AT堿基含量為61.8%，GC堿基含量為38.2%，具有明顯的堿基偏好性。林麝D-loop區(qū)序列全長(zhǎng)在669～711 bp之間，不同個(gè)體間存在序列長(zhǎng)度差異（表4）；T、C、A、G的平均含量分別為30.1%、22.9%、32.1%及14.9%，AT堿基含量為62.2%，GC堿基含量為37.8%，具有明顯的堿基偏好性（表3）。 D-loop區(qū)的A、T含量較高，C含量較低，群體的D-loop區(qū)比Cytb基因序列具有較高的AT含量及較低的GC含量。

表3 林麝群體Cytb基因和D-loop區(qū)序列的堿基組成Table 3 Base composition of Cytb gene and D-loop region sequences in Moschus berezovskii population %

表4 林麝群體D-loop區(qū)序列長(zhǎng)度信息Table 4 Length information of D-loop region sequence in Moschus berezovskii population

2.3 遺傳多樣性指數(shù)

利用ClustalX 2.0、DNASP 5.10軟件對(duì)獲得的Cytb基因和D-loop區(qū)序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Cytb基因和D-loop區(qū)序列分別有241和383個(gè)SNPs，其中241個(gè)SNPs中包含236個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和5個(gè)單一信息位點(diǎn)，383個(gè)SNPs中包含347個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和36個(gè)單一信息位點(diǎn)；單倍型數(shù)、單倍型多樣度、核苷酸多樣度等結(jié)果均為Cytb基因序列較高，林麝所有個(gè)體樣本在Cytb基因和D-loop區(qū)分別檢測(cè)出35和29個(gè)單倍型，單倍型比例分別為81.4%和67.4%，單倍型多樣性分別為0.983和0.975；核苷酸多樣度分別為0.28343和0.07707（表5）。

表5 林麝Cytb基因和D-loop區(qū)序列遺傳多樣性指數(shù)Table 5 Genetic diversity indexes of Cytb gene and D-loop region sequences in Moschus berezovskii

單倍型具體分布情況見(jiàn)表6。由表6可知，43條Cytb基因序列共定義35個(gè)單倍型（Hap1～Hap35），其中單倍型Hap12的數(shù)量最多，共有5個(gè)（11.63%），單倍型Hap3的數(shù)量為3個(gè)（6.98%）；單倍型Hap5、Hap7的數(shù)量均為2個(gè)（4.65%），其余單倍型數(shù)量均為1個(gè)（2.33%）；43條D-loop區(qū)序列共定義29個(gè)單倍型，其中單倍型Hap1的數(shù)量最多，共有5個(gè)（11.63%），單倍型Hap4、Hap13和Hap14的數(shù)量均為3個(gè)（6.98%）；單倍型Hap3、Hap17、Hap19和Hap26的數(shù)量均為2個(gè)（4.95%）；其余單倍型數(shù)量均1個(gè)（2.33%）。

表6 林麝Cytb基因和D-oop區(qū)序列的單倍型分布Table 6 Haplotype distribution of Cytb gene and D-loop region sequences in Moschus berezovskii

續(xù)表

項(xiàng)目Items單倍型Haplotypes個(gè)體編號(hào)Individual No.數(shù)量Number單倍型頻率Haplotype frequency/%Hap176、1724.65Hap18812.33Hap1913、2424.65Hap201612.33Hap214312.33Hap221512.33Hap231012.33Hap243012.33Hap253512.33Hap267、4124.65Hap27412.33Hap281412.33Hap292012.33

2.4 遺傳距離

通過(guò)Mega 7.0軟件分別計(jì)算林麝Cytb基因和D-loop區(qū)序列不同單倍型間的遺傳距離，結(jié)果顯示，Cytb基因35個(gè)單倍型之間的遺傳距離在0.002～0.831之間，其中Hap6與Hap12的遺傳距離最小，為0.002；Hap1與Hap13、Hap10與Hap13的遺傳距離最大，均為0.831（圖3）。D-loop區(qū)序列29個(gè)單倍型之間的遺傳距離在0.006～1.342之間，其中Hap4與Hap17的遺傳距離最小，為0.006；Hap9與Hap25的遺傳距離最大，為1.342（圖4）。

圖3 林麝Cytb基因序列的單倍型遺傳距離Fig.3 Haplotype genetic distance of Cytb gene sequence in Moschus berezovskii

圖4 林麝D-loop區(qū)序列的單倍型遺傳距離Fig.4 Haplotype genetic distance of D-loop region sequence in Moschus berezovskii

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

2.5.1 林麝Cytb基因和D-loop區(qū)序列單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 利用Mega 7.0軟件構(gòu)建林麝群體的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖5、6。進(jìn)化樹(shù)分支上的百分比代表經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)有多少個(gè)數(shù)位于此分支，也反映了進(jìn)化樹(shù)的置信度；標(biāo)在分支上的數(shù)字為支長(zhǎng)的具體數(shù)值。由圖5、6可知，頂點(diǎn)上的百分?jǐn)?shù)全部為100%（>70%），整體上具有可信度，基于Cytb基因，林麝所有個(gè)體可以被歸為2個(gè)大分支，有較遠(yuǎn)的遺傳距離，其中單倍型Hap1、Hap8、Hap10、Hap16～Hap35聚為一支，單倍型Hap2～Hap7、Hap9、Hap11～Hap15聚為一支；基于D-loop區(qū)，林麝所有個(gè)體可以被歸為2個(gè)大分支，有明顯較遠(yuǎn)的遺傳距離，其中單倍型Hap9、Hap18聚為一支，其余單倍型聚為一支。與Cytb基因序列不同的是，大部分單倍型都處于一個(gè)分支，只有2個(gè)單倍型為另外一個(gè)分支，可能與D-loop區(qū)進(jìn)化速度較快有關(guān)。

圖5 林麝Cytb基因序列單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Haplotype phylogenetic tree of Cytb gene sequence in Moschus berezovskii

圖6 林麝D-loop區(qū)序列單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Haplotype phylogenetic tree of D-loop region sequence in Moschus berezovskii

2.5.2 麝屬系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 應(yīng)用Mega 7.0軟件構(gòu)建麝屬系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖7、8。由圖7、8可知，喜馬拉雅麝、原麝、林麝、原麝、黑麝、安徽麝為6個(gè)獨(dú)立種，林麝和原麝親緣關(guān)系較近，林麝與其他麝屬的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖7 基于Cytb基因部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree constructed based on partial sequences of Cytb gene

圖8 基于D-loop區(qū)部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree constructed based on partial sequences of D-loop region sequence

3 討 論

3.1 基于Cytb基因和D-loop區(qū)序列林麝的遺傳多態(tài)性研究

本試驗(yàn)采用林麝自然脫落的毛發(fā)樣本，避免對(duì)珍稀物種造成人為損傷。經(jīng)過(guò)序列分析，本研究獲得部分Cytb基因和D-loop區(qū)序列各43條。Cytb基因長(zhǎng)度為472 bp，共檢出241個(gè)SNPs位點(diǎn)，包含236個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和5個(gè)單一信息位點(diǎn)，沒(méi)有插入和缺失位點(diǎn)。 D-loop區(qū)序列長(zhǎng)度為669～711 bp，其中10條長(zhǎng)度為699 bp，占比23.2%；6條長(zhǎng)度為696 bp，占比14.0%；長(zhǎng)度為700和702 bp各5條，分別占比11.6%；長(zhǎng)度為697、698及701 bp各4條，分別占比9.3%；3條長(zhǎng)度為695 bp，占比7.0%；長(zhǎng)度為669及694 bp各1條，占比2.3%。與馮慧等[13]對(duì)野生林麝D-loop區(qū)研究不同的是，本試驗(yàn)圈養(yǎng)林麝D-loop區(qū)序列共檢出383個(gè)SNPs位點(diǎn)，包含347個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和36個(gè)單一信息位點(diǎn)，均大于野生林麝，但樣本時(shí)間與來(lái)源方式不同，需進(jìn)一步采集野生和人工圈養(yǎng)林麝樣本進(jìn)行比較。

單倍型多樣度和核苷酸多樣度是衡量一個(gè)群體mtDNA變異程度的2個(gè)指標(biāo)。單倍型多樣度是指樣本中隨機(jī)抽取到2個(gè)不同單倍型的頻率；核苷酸多樣度是指序列間每個(gè)位點(diǎn)的平均核苷酸差異數(shù)。Grant等[27]研究顯示，單倍型多樣性以0.5為臨界值，核苷酸多樣性以0.005為臨界值，二者的值越大，群體的多樣性程度越高。本試驗(yàn)樣本Cytb基因和D-loop區(qū)序列單倍型多樣度分別為0.983和0.975，核苷酸多樣度分別為0.28343和0.07707。單倍型多樣度和核苷酸多樣度都較大，群體的多態(tài)程度較高，遺傳多樣性較豐富。Hong等[28]認(rèn)為，當(dāng)核苷酸多樣度在0.0015～0.0047時(shí)，群體的遺傳多樣性較低。本研究中，林麝Cytb基因和D-loop區(qū)序列的核苷酸多樣度均>0.0047。藏羚羊的線粒體核苷酸多樣度為0.0296[29]，太平洋白鰭豚的線粒體核苷酸多樣度為0.0165[30]，同為珍稀哺乳動(dòng)物，林麝的核苷酸多樣度較高，再次驗(yàn)證其核苷酸多樣度處于中上水平。整體來(lái)看，林麝種群遺傳多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性特征。

3.2 基于Cytb基因和D-loop區(qū)序列林麝不同單倍型的遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

單倍型間的平均遺傳距離可以體現(xiàn)一個(gè)群體的遺傳變異程度，即大多數(shù)哺乳動(dòng)物的平均遺傳距離值在0.01以上就可以認(rèn)為這個(gè)群體變異程度大[28]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Cytb基因和D-loop區(qū)序列平均遺傳距離分別為0.389和0.212，均>0.01，說(shuō)明林麝群體的遺傳變異較大。Cytb基因單倍型之間的最大遺傳距離是0.831，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于D-loop區(qū)單倍型之間最大距離（1.342），這是由于線粒體不同區(qū)域的進(jìn)化速率存在差異，Cytb基因作為線粒體編碼基因，其進(jìn)化速度相對(duì)較慢，D-loop區(qū)序列進(jìn)化速率較快。

中國(guó)麝類有6種，其中，原麝分布在東北、華北地區(qū)；馬麝分布在青藏高原及鄰近各??；黑麝見(jiàn)于西藏和云南的少數(shù)地區(qū)；喜馬拉雅麝幾乎只分布在西藏部分地區(qū)；林麝數(shù)量多，分布在長(zhǎng)江流域及以南各省區(qū)[31]。馮慧等[13]研究發(fā)現(xiàn)，原麝和林麝最先聚到一起，親緣關(guān)系較近，與馬麝、黑麝和喜馬拉雅麝親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，本試驗(yàn)研究結(jié)果與其一致，同時(shí)增加了安徽麝這一麝屬。安徽麝僅見(jiàn)于安徽西部大別山地區(qū)，是一種特有種。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，安徽麝與林麝、原麝親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與馬麝親緣關(guān)系較近，符合章敬旗等[32]根據(jù)麝頭骨數(shù)據(jù)所做的分析?；贑ytb基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，林麝和原麝先聚在一起，然后是安徽麝，與馬麝、黑麝和喜馬拉雅麝相距較遠(yuǎn)；而基于D-loop區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，林麝和原麝最先聚在一起，然后是安徽麝與馬麝，這一結(jié)果也與D-loop區(qū)序列變異速度較快、樣本數(shù)量少有關(guān)；但相同的是，黑麝與喜馬拉雅麝親緣關(guān)系較近，為一個(gè)小分支，原麝和林麝為一個(gè)小分支，充分驗(yàn)證且豐富了6種麝屬之間的親緣關(guān)系，但由于采集林麝樣本范圍較小，還需更多樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)Cytb基因和D-loop區(qū)序列測(cè)定分析，在2個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中均可以發(fā)現(xiàn)林麝具有2個(gè)母系來(lái)源，這與馮慧等[13]報(bào)道的其他中國(guó)林麝群體研究結(jié)果一致。因此，要加強(qiáng)對(duì)現(xiàn)有林麝資源的保護(hù)力度，對(duì)人工圈養(yǎng)林麝進(jìn)行科學(xué)管理，改善養(yǎng)殖環(huán)境，防止其遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而有利于遺傳資源的可持續(xù)發(fā)展。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)陜西林麝毛發(fā)樣本Cytb基因和D-loop區(qū)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)陜西林麝群體呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性特征，表現(xiàn)為較豐富的遺傳多樣性；進(jìn)化上存在2個(gè)母系起源，同時(shí)進(jìn)一步支持了林麝和原麝屬于一個(gè)分支的觀點(diǎn)。