翟 哲,陳 思，吳艷茹，王雪梅，李崇瑞，劉志勇，陳巧玲，王鳳陽，杜 麗，李 昌，金寧一

（1.海南大學(xué)動物科技學(xué)院，海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？谑袆游锘蚬こ讨攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122）

趨化因子C-C基序配體19（C-C motif chemokine ligand 19，CCL19）基因編碼的CCL19蛋白是機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞活化、免疫耐受和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體免疫監(jiān)測、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[1]。在動物體內(nèi)，CCL19主要由淋巴結(jié)內(nèi)的網(wǎng)狀細(xì)胞分泌，也能夠由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌[2-3]。CCL19通過與趨化因子C-C基序受體7（C-C motif chemokine receptor 7，CCR7）形成異源二聚體，誘導(dǎo)攜帶抗原的樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞遷移至淋巴器官，從而啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答，并同時促進(jìn)淋巴細(xì)胞遷移、血小板激活、細(xì)胞骨架重排等生物學(xué)過程。研究表明，CCL19是唯一能夠有效刺激CCR7磷酸化、內(nèi)化的趨化因子，可導(dǎo)致受體脫敏和抗原遞呈樹突狀細(xì)胞的遷移，同時還可以有效促進(jìn)β-抑制蛋白募集[4-5]；CCL19可作為血小板激活過程中釋放的可溶性趨化因子，是血液高凝狀態(tài)下的標(biāo)志物，可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞聚集到病變部位，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[6-7]；CCL19還可以通過促進(jìn)金屬蛋白酶家族MMP-2、MMP-9的表達(dá)使細(xì)胞骨架重排和上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移[8]。因此，CCL19被認(rèn)為是通過調(diào)控炎癥細(xì)胞遷移的方式促進(jìn)炎癥反應(yīng)，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答和先天性免疫應(yīng)答的重要趨化因子。最新研究表明，CCL19在肥胖機(jī)體內(nèi)的脂肪組織中表達(dá)量增加，并參與代謝與局部炎癥，提示CCL19可能是代謝炎癥及抑制胰島素表達(dá)的標(biāo)志物[9]。

綿羊是一種對外界環(huán)境因素有較強(qiáng)適應(yīng)能力的反芻動物。中國綿羊品種資源豐富，分布范圍廣泛，生活環(huán)境復(fù)雜[10-12]。不同品種綿羊?qū)τ诩膊〉牡挚沽Σ町愝^大。因此，研究綿羊免疫相關(guān)基因功能及其作用機(jī)制，篩選和發(fā)掘綿羊免疫基因，對于探索綿羊的環(huán)境適應(yīng)性以及免疫保護(hù)機(jī)制極為重要[13]。CCL19是重要的免疫基因，目前相關(guān)研究多集中在以人和小鼠為模型，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答、先天性免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)功能等方面，而關(guān)于綿羊該基因在表達(dá)調(diào)控、炎癥反應(yīng)等方面的機(jī)制研究相對較少。因此，本研究利用生物信息學(xué)分析綿羊CCL19基因啟動子序列，預(yù)測其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，確定啟動子的核心啟動子區(qū)域，鑒定對CCL19基因起關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，以期為揭示綿羊CCL19基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，闡明其在綿羊炎癥反應(yīng)和啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答等方面的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集2只10月齡雌性健康小尾寒羊的頜下淋巴結(jié)組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

組織基因組DNA提取試劑盒、2×PfuPCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、1 kb DNA Ladder、DNA膠回收純化試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、（無內(nèi)毒素）質(zhì)粒提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；產(chǎn)物純化試劑盒及定點(diǎn)突變試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；T4 DNA連接酶、Lipofectamine?2000及限制性內(nèi)切酶SacⅠ、Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ均購自Thermofisher公司；胰蛋白酶、胎牛血清均購自Gibco公司；1×PBS緩沖液、DMEM高糖培養(yǎng)基均購自Boster公司；雙熒光素酶基因內(nèi)參pRL-TK載體、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（Dual-Luciferase?Reporter Assay System）均購自Promega公司；氨芐青霉素購自北京索萊寶科技有限公司；pGL3-Basic質(zhì)粒、pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒均由海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 CCL19基因生物信息學(xué)分析

根據(jù)GenBank中綿羊CCL19基因序列（登錄號：NC_040253.1）、CCL19基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）的位置及Ensembl數(shù)據(jù)庫，選取綿羊CCL19基因5′-UTR上游1 000 bp作為CCL19基因啟動子序列。利用轉(zhuǎn)錄因子在線分析軟件JASPAR、PROMO預(yù)測CCL19基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；利用Promoter 2.0在線軟件分析CCL19基因啟動子的序列特征；利用MethPrimer軟件預(yù)測CCL19基因啟動子CpG島；利用RepeatMasker程序預(yù)測序列的重復(fù)元件；利用FPROM在線軟件分析TATA-box，具體軟件信息見表1。

表1 生物信息學(xué)分析軟件Table 1 Bioinformatics analysis softwares

1.4 CCL19基因啟動子報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建

利用組織基因組DNA提取試劑盒提取綿羊頜下淋巴結(jié)組織基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)CCL19基因啟動子全長引物，下游引物不變，再設(shè)計(jì)各截短體上游引物，引物序列及酶切位點(diǎn)見表2。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

利用表2特異性引物通過PCR擴(kuò)增綿羊CCL19基因啟動子序列及各截短體，序列分別命名為pGL3-P、P1、P2、P3、P4、P5、P6。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×PfuPCR MasterMix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸（延伸時間見表2），共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收目的片段。利用SacⅠ和Hind Ⅲ分別對啟動子1 000 bp序列及pGL3-Basic雙熒光素酶質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。 利用KpnⅠ和Hind Ⅲ分別對各截短體序列及pGL3-Basic雙熒光素酶質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。雙酶切體系20 μL：載體/目的片段1 μg，SacⅠ/KpnⅠ和Hind Ⅲ各1 μL，Buffer 1 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。37 ℃反應(yīng)2 h，利用膠回收純化試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化回收。將純化得到的目的片段與線性化質(zhì)粒通過T4連接酶22 ℃連接2 h，重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR鑒定挑選出陽性單克隆菌落。過夜搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定。 將重組質(zhì)粒送至北京六合華大基因公司測序。測序正確的陽性單克隆菌液過夜培養(yǎng)，利用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

表2 CCL19基因啟動子引物Table 2 Primers of CCL19 gene promote

1.5 293T細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將293T細(xì)胞接種于含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞以2×104/孔的密度接種于96孔板中，12 h后當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時，將完全培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其中Lipofectamine?2000體積與pGL3-Basic重組質(zhì)粒/轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)量比為0.5 μL∶200 ng，pGL3-Basic截短體重組質(zhì)粒/轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的質(zhì)量比為200 ng∶4 ng。以pGL3-Basic質(zhì)粒為陰性對照、pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒為陽性對照鑒定轉(zhuǎn)染效率，每組設(shè)3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染6～8 h將無血清培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h觀察熒光。

1.6 CCL19基因啟動子活性分析

293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行雙熒光素酶檢測。利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（Dual-Luciferase?Reporter Assay System）和Spark?多功能微孔板檢測儀檢測螢火蟲熒光素酶（F值）和海腎熒光素酶（R值）。通過計(jì)算螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的比值（Luc）檢測相對熒光活性，從而確定綿羊CCL19基因的核心啟動子區(qū)域及重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.7 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變

利用在線軟件預(yù)測核心啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變引物（表3）。根據(jù)定點(diǎn)突變試劑盒說明書構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變質(zhì)粒。以pGL3-P5重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系同1.4。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，68 ℃延伸10 min，共18個循環(huán)；68 ℃延伸10 min。DpnⅠ限制性內(nèi)切酶37 ℃酶切1 h，用DNA膠回收純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定后過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定陽性單克隆，送往深圳六合華大基因公司測序。測序正確的陽性單克隆菌過夜培養(yǎng)，用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。構(gòu)建成功的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失載體命名為pGL3-轉(zhuǎn)錄因子。

表3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的突變引物Table 3 Mutated primers for transcription factor binding sites

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 8.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 CCL19基因啟動子生物信息學(xué)分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載綿羊CCL19基因啟動子序列（-958/+42 bp），通過RepeatMasker軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CCL19基因啟動子序列無重復(fù)元件；采用Methprimer軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CCL19基因啟動子序列無CpG島；利用FPROM在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)-678/-671 bp處有TATA-box（圖1）。利用Promoter 2.0軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，綿羊CCL19基因-546 bp為啟動子位置，分值為0.582。利用在線軟件對綿羊CCL19基因啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，存在POU5F1、IRF家族、NF-1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（圖2）。

圖1 綿羊CCL19基因啟動子甲基化位點(diǎn)和TATA-box分析Fig.1 Analysis of methylation site and TATA-box of CCL19 gene promoter in sheep

橫線或方框處為潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。圖6同Potential transcription binding sites are underlined or box.The same as fig.6圖2 綿羊CCL19基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測Fig.2 Transcription factor binding sites prediction of CCL19 gene promoter in sheep

2.2 CCL19基因啟動子報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建及活性分析

基于預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，采用DNAMAN設(shè)計(jì)引物CCL19-P/P1/P2/P3/P4/P5/P6對啟動子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測以及膠回收獲得7條逐段截短的CCL19基因啟動子序列（圖3）。經(jīng)過雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化、過夜搖菌及提取質(zhì)粒，雙熒光素酶重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)，各重組質(zhì)粒（pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6）均出現(xiàn)兩條帶，其中一條目的片段大小分別為1 000、898、808、650、466、298及228 bp，另一條片段為pGL3-Basic質(zhì)粒片段4 818 bp（圖4）。將酶切正確的重組質(zhì)粒送測，對測序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)各截短體序列與NCBI上CCL19基因啟動子序列一致，證明雙熒光素酶重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

P～P6，系列截短的片段；M，DL2000 DNA MarkerP-P6，A series of truncated segments；M，DL2000 DNA Marker圖3 綿羊CCL19基因啟動子不同截短片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of different truncated fragments of CCL19 gene promoter in sheep

P～P6，雙熒光素酶質(zhì)粒pGL3-P～pGL3-P6雙酶切鑒定結(jié)果；M，DL2000 DNA MarkerP-P6，Results of double luciferase plasmids pGL3-P to pGL3-P6 digested by double enzymes；M，DL2000 DNA Marker圖4 綿羊CCL19基因啟動子的雙熒光素酶重組質(zhì)粒電泳圖Fig.4 Electrophoresis diagram of double luciferase recombinant plasmid of CCL19 gene promoter in sheep

利用Lipofectamine?2000將構(gòu)建成功的7個雙熒光素酶報(bào)告載體（pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6）瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測各截短體的相對熒光活性，結(jié)果顯示，隨著CCL19基因啟動子逐漸截短，相對熒光活性也逐漸降低，隨后略微升高后再極顯著降低（P<0.01，圖5）。表明在啟動子-958/-857、-856/-767 bp中存在增強(qiáng)啟動子相對熒光活性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)截短到-256/-186 bp時，相對熒光活性變化最大。說明綿羊CCL19基因啟動子1 000 bp序列具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能，且-256/-186 bp為啟動子核心啟動子區(qū)域。

**，差異極顯著（P<0.01）。圖8同**，Extremely significant difference （P<0.01）.The same as fig.8圖5 綿羊CCL19基因啟動子不同截短片段的相對熒光素酶活性檢測Fig.5 Relative luciferase activity detection of different truncated fragments of CCL19 gene promoter in sheep

2.3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變及活性分析

利用JASPAR和PROMO在線軟件對綿羊CCL19基因核心啟動子區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果顯示，共存在POU5F1、ZBTB26、FOXI1、GLI2和SP2 5個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（圖6）。以CCL19-P5重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出5個不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失的重組質(zhì)粒pGL3-POU5F1、pGL3-ZBTB26、pGL3-FOXⅠ1、pGL3-GLI2及pGL3-SP2（圖7A）。經(jīng)雙酶切鑒定和測序發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的pGL3-轉(zhuǎn)錄因子重組質(zhì)粒的目的片段序列與預(yù)期缺失序列一致（圖7B）。

圖6 綿羊CCL19基因啟動子的核心啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測Fig.6 Transcription factor binding sites prediction in the core region of CCL19 gene promoter in sheep

1～5，CCL19基因轉(zhuǎn)錄因子（POU5F1、FOXI1、ZBTB26、GLI2、SP2）結(jié)合位點(diǎn)缺失的PCR產(chǎn)物；M1，1 kb DNA Marker；6～11，CCL19基因結(jié)合位點(diǎn)缺失載體pGL3-POU5F1、pGL3-FOXI1、pGL3-ZBTB26、pGL3-GLI2、pGL3-SP2和CCL19-P5的雙酶切圖；M2，DL2000 DNA Marker1-5，PCR product of deletion loop expansion of CCL19 gene transcription factor（POU5F1，F(xiàn)OXI1，ZBTB26，GLI2 and SP2） binding sites；M1，1 kb DNA Marker;6-11，Dual enzyme digestion diagram of CCL19 gene binding site deletion vector（pGL3-POU5F1，pGL3-FOXI1，pGL3-ZBTB26，pGL3-GLI2，pGL3-SP2 and CCL19-P5）；M2，DL2000 DNA Marker圖7 綿羊CCL19基因核心啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失載體的PCR（A）和雙酶切（B）電泳圖Fig.7 Electrophoresis diagram of loop expansion （A） and double restriction （B） with deletion vectors of transcription factor binding sites in the core region of CCL19 gene promoter in sheep

將5個缺失成功的雙熒光素酶報(bào)告載體分別與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，48 h后進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測，結(jié)果見圖8。由圖8可知，與對照組相比，pGL3-FOXI1、pGL3-ZBTB26、pGL3-SP2的相對熒光活性極顯著上升（P<0.01），說明轉(zhuǎn)錄因子FOXI1、ZBTB26、SP2可能對綿羊CCL19基因的轉(zhuǎn)錄起負(fù)調(diào)控作用；pGL3-POU5F1的相對熒光活性極顯著降低（P<0.01），說明轉(zhuǎn)錄因子POU5F1的結(jié)合位點(diǎn)可能是綿羊CCL19基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控位點(diǎn)。

潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的缺失在序列中用白色標(biāo)明；預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)在序列中用黑色標(biāo)明The deletion of potential transcription factor binding sites are indicated by white in the sequence；And predicted binding sites are indicated by black in sequence圖8 定點(diǎn)缺失關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的相對熒光素酶活性測定Fig.8 Relative luciferase activity determination of site-deletions of key transcription factors

3 討 論

趨化因子是細(xì)胞因子中最大的家族，能夠引起趨化反應(yīng)，協(xié)調(diào)體內(nèi)細(xì)胞的定位。趨化因子在機(jī)體免疫細(xì)胞的發(fā)育成熟，先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動，以及感染病原菌和疾病中免疫細(xì)胞的募集中均發(fā)揮著重要作用[14]。趨化因子可分為4個亞類：CXC、CC、CX3C及C。其中，CCL19作為炎性趨化因子，屬于CC趨化因子家族，通過與CCR7結(jié)合，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的樹突狀細(xì)胞、抗原參與的B細(xì)胞和記憶T細(xì)胞從而發(fā)揮作用[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，奶牛發(fā)生急性瘤胃酸中毒時，奶牛瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)的CCL19基因表達(dá)上調(diào)[17]。Toll樣受體4（TLR4）的配體細(xì)菌的脂多糖（LPS）能夠刺激外周血單核細(xì)胞，激活先天性免疫保護(hù)，同時誘導(dǎo)CCL19基因的表達(dá)上調(diào)[18]。在HIV-1型病毒的刺激下，CCL19通過與CCR7結(jié)合能夠刺激免疫細(xì)胞釋放抗病毒相關(guān)的細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-4），從而促進(jìn)T細(xì)胞增殖和DC細(xì)胞對抗原的識別[1]。因此，趨化因子CCL19在機(jī)體內(nèi)炎癥發(fā)生、先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答等方面扮演著重要角色。

對CCL19基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究表明，在人樹突狀細(xì)胞中，CCL19基因的表達(dá)是由轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、IRF和STAT家族的幾個成員共同調(diào)控的[19]；在小鼠模型中，外周血單核細(xì)胞中IRF-1能夠激活CCL19基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[7]。CCL19作為綿羊體內(nèi)免疫細(xì)胞富集的重要趨化因子，是綿羊機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)的重要組成部分。然而，綿羊CCL19基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)研究鮮見報(bào)道。本研究利用多個啟動子分析軟件對綿羊CCL19基因的啟動子區(qū)域進(jìn)行特征性分析，結(jié)果表明，CCL19基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 000 bp的序列（-958/+42 bp）上存在NF-1、POU5F1、GATA3、IRF-1、IRF-3等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，提示該部分序列可能是高轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域。脊椎動物CpG島（CGIs）是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的一段短的富含GC、CpG的非甲基化序列，含有CpG島的啟動子沉默主要是通過CpG甲基化實(shí)現(xiàn)的[20]。鑒于CGIs通常具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性和影響局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能，本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)軟件對綿羊CCL19基因啟動子序列1 000 bp序列的甲基化情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該序列無脊椎動物CpG島，提示CCL19基因的調(diào)控可能不受啟動子CpG島甲基化的影響。研究表明，基因轉(zhuǎn)錄是由3種RNA聚合酶完成的一種保守的細(xì)胞機(jī)制，每種RNA聚合酶都有一套專門的轉(zhuǎn)錄因子。 轉(zhuǎn)錄因子可識別特定的結(jié)合位點(diǎn)，形成能夠啟動基因轉(zhuǎn)錄的啟動前復(fù)合體[21]。 TATA-box是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物開始組裝并啟動轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)，通常代表著該基因的轉(zhuǎn)錄是高度調(diào)控的[22]。 通過對綿羊CCL19基因啟動子序列進(jìn)行TATA-box分析發(fā)現(xiàn)，該啟動子序列包含TATA-box（-678/-671 bp）。 以上結(jié)果表明，綿羊CCL19基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 000 bp的序列具有很強(qiáng)的啟動子活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，綿羊CCL19基因啟動子核心啟動子區(qū)域?yàn)?256/-186 bp，缺失轉(zhuǎn)錄因子POU5F1結(jié)合位點(diǎn)后，序列的轉(zhuǎn)錄活性相對于對照組顯著下降。POU5F1通常也被稱為八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor 4,OCT3/4），是POU家族的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子[23]。POU家族的轉(zhuǎn)錄因子都包含高度保守的結(jié)合DNA的POU結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地結(jié)合靶基因啟動子或增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的ATGCAAAT基序[24]。POU5F1基因編碼的OCT4蛋白具有維持細(xì)胞多能性和分化的功能[23]。研究表明，POU5F1/OCT4可通過控制bmp2b、bmp4和vox基因的表達(dá)從而影響斑馬魚胚胎發(fā)育[25]；miR-145可通過刺激POU5F1基因的表達(dá)從而影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、浸潤和遷移[26]；POU5F1還可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）的表達(dá)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化從而導(dǎo)致細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[27]。綜上，POU5F1/OCT4在機(jī)體內(nèi)的主要功能是影響胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化，且還會刺激免疫細(xì)胞的生長轉(zhuǎn)移。POU5F1同家族轉(zhuǎn)錄因子POU2F1過表達(dá)可以促進(jìn)PD-L1的表達(dá)，從而可能參與免疫逃避的過程[28]。因此，在綿羊機(jī)體內(nèi)POU5F1可能通過與CCL19基因啟動子ATGCAAAT基序結(jié)合調(diào)控CCL19基因的表達(dá)，從而控制淋巴細(xì)胞活化和遷移，參與炎癥反應(yīng)、先天性免疫和適應(yīng)性免疫過程。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，缺失FOXI1、ZBTB26、SP2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)后，序列的轉(zhuǎn)錄活性相對于對照組極顯著上升。大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子對基因表達(dá)具有激活作用，但是也有部分轉(zhuǎn)錄抑制因子通過干擾正在作用的轉(zhuǎn)錄因子（間接抑制）或通過與RNA聚合酶和相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用（直接抑制）直接干擾靶基因轉(zhuǎn)錄[29]。因此，在綿羊機(jī)體內(nèi)FOXI1、ZBTB26、SP2可能是CCL19基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子。本研究初步鑒定了在綿羊中POU5F1/OCT-4轉(zhuǎn)錄因子可能以轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方式參與CCL19基因的表達(dá)，該試驗(yàn)結(jié)果在綿羊上首次報(bào)道，而其他物種中未見報(bào)道，具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究通過體外試驗(yàn)確定了綿羊CCL19基因啟動子核心啟動子區(qū)域位于-256/-186 bp。利用在線軟件預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，點(diǎn)突變技術(shù)缺失結(jié)合位點(diǎn)序列及雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)初步鑒定出POU家族成員POU5F1/OCT-4轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)可能是綿羊CCL19基因的轉(zhuǎn)錄激活因子。