梁百慧　譚小寧　成金林　林靜　陳燕

〔摘要〕 目的 探討補(bǔ)腎藥膳方對(duì)成骨細(xì)胞Runx2、Col-Ⅰ、MGP的影響。方法 30只大鼠隨機(jī)分為兩組，每組15只。一組予以生理鹽水灌胃干預(yù)7 d，另一組予以同劑量補(bǔ)腎藥膳方灌胃干預(yù)7 d;分別提取兩組大鼠血清，將血清分別與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）共同培養(yǎng)，生理鹽水大鼠血清培養(yǎng)為對(duì)照組，補(bǔ)腎藥膳方大鼠血清培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)組，分別提取外泌體，并加入成骨細(xì)胞中。采用Western blot法檢測(cè)兩組成骨相關(guān)蛋白表達(dá)量，利用RT-qPCR法檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組BMSCs分泌外泌體增加（P<0.01），miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p表達(dá)量升高（P<0.05），Runx2、Col-Ⅰ、MGP蛋白及mRNA表達(dá)量均增多（P<0.01）。結(jié)論 補(bǔ)腎藥膳方可能通過(guò)促進(jìn)BMSCs分泌成骨相關(guān)miRNA及更多成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)因子，促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化。

〔關(guān)鍵詞〕 補(bǔ)腎藥膳方;成骨細(xì)胞;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥;外泌體

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.015

Study on the effect of reinforcing kidney medicinal diet on osteoblast Runx2， Col-Ⅰ， MGP based on the theory of "kidney producing marrow， marrow nourishing bone"

LIANG Baihui TAN Xiaoning CHENG Jinlin LIN Jing CHEN Yan

（1. Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital， Changsha， Hunan 410006， China; 2. Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of reinforcing kidney medicinal diet on Runx2， Col-Ⅰ， MGP of osteoblasts. Methods Thirty rats were randomly divided into two groups， 15 rats in each group. One group was given normal saline gavage for 7 days， and the other group was given the same dose of reinforcing kidney medicinal diet for 7 days; serum was extracted from the two groups of rats， and the serum was co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs）. The normal saline rat serum culture group was the control group， and the reinforcing kidney medicinal diet rat serum culture group was the experimental group， and exosomes were extracted respectively， and added to osteoblasts. Western blot was used to detect the expression of osteogenic-related proteins of the two groups， and RT-qPCR was used to detect the expression of osteogenic-related genes. Results Compared with the control group， the secretion of exosome of BMSCs in the experimental group was increased （P<0.01）; the expression levels of miR-26a-3p， miR-218-3p and miR-199b-3p in the experimental group were higher （P<0.05）; the protein expression levels of Runx2， Col-Ⅰ， and MGP and the mRNA expression levels of Runx2， Col-Ⅰ and MGP were higher （P<0.01）. Conclusion Reinforcing kidney medicinal diet can promote the osteogenic differentiation of osteoblasts by promoting BMSCs to secrete osteogenic-related miRNA and more osteogenic transformation-related factors.879B4C35-4350-4A26-B58A-A13EDCB72EF8

〔Keywords〕 reinforcing kidney medicinal diet; osteoblasts; bone marrow mesenchymal stem cells; postmenopausal osteo-porosis; exosome

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis， PMOP）又稱“Ⅰ型骨質(zhì)疏松癥”，以絕經(jīng)后全身性骨量減少及骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征，是危及中老年婦女健康的常見(jiàn)疾病。資料顯示，在我國(guó)50歲以上人群中，女性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率達(dá)20.7%，男性達(dá)14.4%[1]。骨質(zhì)疏松癥一旦發(fā)生，受到輕微外力即可引發(fā)骨折，從而嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量，難以逆轉(zhuǎn)，加強(qiáng)預(yù)防則能更有效地降低骨折的發(fā)生率。近年來(lái)，研究[2-3]認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）是骨再生的種子細(xì)胞，在骨穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。BMSCs的分泌因子并不能定向輸送到病灶，只有BMSCs分泌的外泌體具有定向輸送功能，并能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化。Liu等[4]在進(jìn)行BMSCs移植研究中發(fā)現(xiàn)，抑制Rab27a/b表達(dá)后（外泌體釋放減少），可抑制體外BMSCs的成骨分化作用，而在培養(yǎng)體系中補(bǔ)充BMSCs來(lái)源的外泌體則可以促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化作用。表明BMSCs源性的外泌體能夠促進(jìn)骨代謝和骨形成[5-6]。

基于中醫(yī)藥食同源理論，藥膳以其“寓醫(yī)于食”的優(yōu)勢(shì)，在老年疾病防治、養(yǎng)生康復(fù)領(lǐng)域上有著一定的優(yōu)勢(shì)，已成為防控老年人常見(jiàn)病的應(yīng)用熱點(diǎn)，如老年糖尿病[7]、老年功能性消化不良[8]、老年高血壓和高血脂[9]，其中包括PMOP。而藥膳的作用機(jī)制研究極少，探索其作用機(jī)制，可為PMOP的防治提供理論依據(jù)[10]。本文對(duì)課題組前期防治PMOP的補(bǔ)腎藥膳方[11]（狗肉200 g，羊腎150 g，山藥30 g，枸杞子30 g）進(jìn)行研究，其中狗肉為君藥，有溫腎壯陽(yáng)的功效，羊腎為臣藥，有補(bǔ)腎益精的功效，山藥、枸杞子為使藥，有養(yǎng)肝益腎的功效，全方可補(bǔ)腎強(qiáng)骨生髓。前期研究證明，補(bǔ)腎藥膳方能促進(jìn)BMSCs外泌體的分泌，改善PMOP模型大鼠骨代謝水平、骨結(jié)構(gòu)，促進(jìn)骨形成[12]，本文旨在通過(guò)觀察補(bǔ)腎藥膳方干預(yù)下BMSCs釋放的外泌體對(duì)成骨細(xì)胞的成骨分化作用，深入了解補(bǔ)腎藥膳方干預(yù)成骨過(guò)程的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)材料與細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠BMSCs（貨號(hào)：CP-R131）、大鼠成骨細(xì)胞（貨號(hào)：CP-R091）均購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司;MSC完全培養(yǎng)基（美國(guó)ATCC公司，貨號(hào)：PCS-500-030）;ES級(jí)FBS（美國(guó)GIBCO公司，貨號(hào)：12664025C）;FGF2（貨號(hào)：233-FB-025）、rhIGF-1（貨號(hào)：291-G1-200）均購(gòu)自美國(guó)R&D公司;CD63（貨號(hào)：Ab134045）、TSG101（貨號(hào)：Ab125011）、ALIX（貨號(hào)：Ab275377）、Calnexin（貨號(hào)：Ab92573）、Runx2（貨號(hào)：Ab192256）、Col-Ⅰ（貨號(hào)：Ab299450）、MGP（貨號(hào)：Ab224367）均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

BMSCs培養(yǎng)條件為：含10% FBS的MSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加FGF2和rhIGF-1，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。匯合率達(dá)80%左右，0.25%胰酶消化細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞懸液，1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

成骨細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。匯合率達(dá)80%左右，0.25%胰酶消化細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞懸液，1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004購(gòu)買SPF級(jí)SD大鼠30只（4～5月齡），體質(zhì)量為200～220 g，大鼠質(zhì)量由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司檢測(cè)。大鼠由湖南省中醫(yī)藥研究院[許可證號(hào)：SYXK（湘）：2020-0008]專業(yè)人員統(tǒng)一管理飼養(yǎng)，其環(huán)境符合衛(wèi)生建議標(biāo)準(zhǔn)。大鼠平均分6籠，保證室溫22～25 ℃，濕度50%～70%，光照周期12 h/12 h，飼以標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料，常規(guī)自由攝食及飲水，定期清洗籠舍并更換墊料。

1.3? 試驗(yàn)藥物及給藥方案

補(bǔ)腎藥膳方是課題組前期確定的防治PMOP的藥膳方，由狗肉200 g、羊腎150 g、山藥30 g、枸杞子30 g組成，由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院提供。將補(bǔ)腎藥膳方中的食材清洗干凈后放入砂鍋，加水2 L，先用武火煮沸，再改文火煎煮1 h，取湯汁，加水再煮一次，兩次煎煮湯汁需濃縮至100 mL，湯汁藥膳含量為4.1 g/mL，將湯汁冷卻后，放置于冰箱冷凍備用。用藥劑量為人體給藥劑量的6倍，大鼠的給藥劑量為41 g/（kg·d），折算標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量大鼠的給藥劑量為8.2 g/d。

30只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周進(jìn)入實(shí)驗(yàn)狀態(tài)，隨機(jī)分為兩組，一組在飼料飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上用生理鹽水灌胃，另一組用補(bǔ)腎藥膳方灌胃。給藥方法均為每日上午灌胃一次，每次2 mL，連續(xù)7 d。各組大鼠均自由飲食、水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意。

1.4? 主要儀器

透射電鏡（型號(hào)：H-7650，日立高新技術(shù)有限公司）;顆粒電位滴定及粒度分析儀（型號(hào)：ZETAVIEW，德國(guó)PMX公司）;電泳儀電源（型號(hào)：DYY-7C）、雙垂直電泳儀（型號(hào)：DYCZ-24DN）均購(gòu)自北京六一生物科技有限公司;酶標(biāo)儀（型號(hào)：ELX800，美國(guó)博騰儀器有限公司）;PCR儀[型號(hào)：ABI7500，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司]。

1.5? 含藥血清的制備879B4C35-4350-4A26-B58A-A13EDCB72EF8

實(shí)驗(yàn)大鼠在最后一次灌胃后，禁食24 h，處死后立即取材。腹主動(dòng)脈取血，將每只大鼠的血液分別移入無(wú)菌離心管，并于4 ℃保鮮冰箱內(nèi)靜置2 h，3000 r/min，離心半徑10 cm，離心20 min，吸取上層血清，同組含藥血清合并。含藥血清經(jīng)56 ℃水浴30 min滅活，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6? 實(shí)驗(yàn)分組

分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組采用補(bǔ)腎藥膳方灌胃大鼠血清，對(duì)照組采用生理鹽水灌胃大鼠血清，超速離心去除外泌體后分別培養(yǎng)BMSCs，收集BMSCs的外泌體后處理成骨細(xì)胞。

1.7? 外泌體的鑒定

（1）電鏡檢測(cè)。取10 μL外泌體溶液在透射電鏡下觀察，并與80 kV成像。（2）粒徑檢測(cè)。使用粒子矩陣ZetaView PMX 11計(jì)算外泌體濃度，用PBS稀釋外泌體并對(duì)其大小及質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，并分析粒子運(yùn)動(dòng)軌跡。（3）BCA檢測(cè)。通過(guò)測(cè)量外泌體吸光值，計(jì)算出蛋白濃度。（4）Western blot法檢測(cè)外泌體膜表面標(biāo)志性蛋白CD63、TSG101、ALIX、Calnexin，稀釋比例均為1∶1000。

1.8? 外泌體miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

取上述經(jīng)過(guò)提取的BMSCs外泌體，采用TRNzol總RNA提取試劑進(jìn)行樣本RNA提取，后行RNA質(zhì)量檢測(cè)，采用Reverse Transcriptase M-MLV進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)分析miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p的表達(dá)情況。目的基因引物序列見(jiàn)表1。

1.9? 成骨細(xì)胞Runx2、Col-Ⅰ、MGP蛋白表達(dá)量及mRNA表達(dá)量檢測(cè)

取上述經(jīng)過(guò)提取的BMSCs外泌體，并分別將其與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)12 d。取處理后的兩組成骨細(xì)胞，一部分用于提取蛋白，對(duì)兩組行Western blot檢測(cè)。用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，獲得細(xì)胞內(nèi)總蛋白，通過(guò)免疫電泳檢測(cè)成骨細(xì)胞中Runx2、Col-Ⅰ、MGP蛋白含量。另一部分細(xì)胞用于提取RNA，行RT-qPCR檢測(cè)。采用TRNzol總RNA提取試劑提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，通過(guò)RT-qPCR定量檢測(cè)Runx2、Col-Ⅰ、MGP mRNA表達(dá)量。目的基因引物序列見(jiàn)表2。

1.10? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示，滿足正態(tài)性、方差齊性的采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);對(duì)于不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料，兩組比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。P<0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 外泌體鑒定

所提取的外泌體粒徑大小約為100 nm（圖1），電鏡下可見(jiàn)，外泌體形態(tài)均勻，標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)清晰，為杯狀脂質(zhì)雙分子層膜微小囊泡（圖2）。所提取的外泌體中可見(jiàn)陽(yáng)性蛋白標(biāo)志物ALIX、TSG101、CD63的表達(dá)，Calnexin無(wú)表達(dá)（圖3）。外泌體蛋白濃度為45.85 ng/μL（表3）。

2.2? 補(bǔ)腎藥膳方對(duì)BMSCs細(xì)胞分泌外泌體量的影響

實(shí)驗(yàn)組BMSCs細(xì)胞外泌體的釋放啟動(dòng)因子Rab27a/b、ISG15蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組（P<0.01）（圖4），說(shuō)明補(bǔ)腎藥膳方能促進(jìn)BMSCs細(xì)胞分泌外泌體。

2.3? 補(bǔ)腎藥膳方對(duì)BMSCs細(xì)胞分泌外泌體中成骨分化相關(guān)miRNA的影響

外泌體樣本中miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p均有表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組中的miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p表達(dá)量高于對(duì)照組（P<0.05）。詳見(jiàn)表4。

2.4? 補(bǔ)腎藥膳方對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化的影響

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Runx2、Col-Ⅰ、MGP蛋白表達(dá)量及Runx2、Col-Ⅰ、MGP mRNA表達(dá)量均增多（P<0.01）。詳見(jiàn)圖5-6。

3 討論

中醫(yī)將PMOP歸屬于“骨痿”“骨痹”范疇，《中西匯通醫(yī)經(jīng)精義·五臟所主》云：“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨”，認(rèn)為PMOP以腎虛型多見(jiàn)，腎精漸衰，骨髓生化無(wú)源，不能充養(yǎng)骨骼而致骨髓空虛，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，提示腎與骨髓和骨質(zhì)疏松癥有著極其密切的關(guān)系。

腎為先天之本，腎藏精。《靈樞·決氣》曰：“兩神相搏，合而成形，常先身生，是謂精。”由此可知，“先天”是指稟受于父母的“兩神相搏”之精，即胚胎，胚胎為腎所藏的先天之精。胚胎分化出人體各組織器官的干細(xì)胞（包括BMSCs），BMSCs主要來(lái)自于骨髓，在特定環(huán)境下向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，即實(shí)現(xiàn)髓養(yǎng)骨，與中醫(yī)理論“腎精生髓養(yǎng)骨”高度吻合，故認(rèn)為中醫(yī)理論的“髓”與BMSCs二者同源同功[13]。前期有許多研究證明，補(bǔ)腎藥物對(duì)BMSCs的增殖和成骨分化都有促進(jìn)作用，也驗(yàn)證了腎、髓、骨之間的關(guān)聯(lián)[14-16]。藥膳是中醫(yī)學(xué)術(shù)與飲食文化相結(jié)合的產(chǎn)物，流傳悠久，“寓醫(yī)于食”，接受程度高，因此，將補(bǔ)腎藥膳與BMSCs外泌體相結(jié)合，研究其對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化的機(jī)制，對(duì)于骨質(zhì)疏松癥患者的治療意義重大。

BMSCs具有很強(qiáng)的更新能力，可刺激相關(guān)組織再生，是可向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的干細(xì)胞，有臨床研究證明，BMSCs可加速改善骨質(zhì)疏松癥患者臨床癥狀，推動(dòng)骨再生[17]。外泌體是直徑30～100 nm的由內(nèi)涵體與質(zhì)膜融合后分泌到細(xì)胞外環(huán)境的囊泡，內(nèi)部包裹著豐富的蛋白質(zhì)、RNA等生物活性分子，可以激活下游的、遠(yuǎn)程的信號(hào)分子，被認(rèn)為是細(xì)胞與周圍靶細(xì)胞間信息交流的重要“內(nèi)分泌”物質(zhì)[18]。Rab家族是一種小GTP酶蛋白，控制著細(xì)胞內(nèi)囊泡的移動(dòng)、定位等，Rab27a/b是外泌體釋放的啟動(dòng)因子，控制外泌體分泌、移動(dòng)[19]。879B4C35-4350-4A26-B58A-A13EDCB72EF8

本研究中，通過(guò)補(bǔ)腎藥膳方灌胃大鼠血清、生理鹽水灌胃大鼠血清對(duì)BMSCs進(jìn)行干預(yù)，跟蹤觀察兩組產(chǎn)生的外泌體，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組釋放的啟動(dòng)因子Rab27a/b、ISG15蛋白表達(dá)量比對(duì)照組多（P<0.01），提示補(bǔ)腎藥膳方可促使BMSCs分泌外泌體增加。

miRNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在骨形成中發(fā)揮重要作用，可加快人體骨重建進(jìn)程[12]。郝靜等[20]研究證明外泌體miRNA對(duì)骨代謝具有積極作用。成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2的活化是成骨細(xì)胞開(kāi)始分化的標(biāo)志，高表達(dá)Runx2能促進(jìn)新生成骨細(xì)胞的分泌和成熟，并能調(diào)節(jié)多種成骨細(xì)胞增殖分化特異性標(biāo)志物的表達(dá)。目前，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNAs調(diào)控Runx2在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，外泌體攜帶并轉(zhuǎn)送miRNAs至成骨細(xì)胞，有miR-124-3p、miR-590、miR-122-5p，參與成骨分化的調(diào)節(jié)，促進(jìn)骨形成[21-23]。因此，探究如何促進(jìn)BMSCs分泌更多含有成骨相關(guān)miRNAs的外泌體，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化，可為促進(jìn)骨再生、修復(fù)骨缺損的骨質(zhì)疏松癥治療提供參考。

本研究中，實(shí)驗(yàn)組miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p表達(dá)量高于對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，Runx2、Col-Ⅰ、MGP蛋白與mRNA表達(dá)量增多（P<0.01）。這提示了補(bǔ)腎藥膳方可促進(jìn)BMSCs外泌體中成骨相關(guān)miRNA的產(chǎn)生，并在成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的產(chǎn)生中發(fā)揮著積極作用。補(bǔ)腎藥膳方可通過(guò)促進(jìn)BMSCs分泌成骨相關(guān)miRNA及更多成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)因子，促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化。

間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為是骨再生的種子細(xì)胞，可促進(jìn)成骨再生。本實(shí)驗(yàn)研究補(bǔ)腎藥膳方對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化的影響及其機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)腎藥膳方可增加ISG 15、Rab27a/b蛋白表達(dá)量，促進(jìn)BMSCs外泌體的分泌，外泌體可能攜帶miR-26a-3p、miR-218-3p、miR-199b-3p等miRNAs增加成骨細(xì)胞中Runx2、Col-Ⅰ、MGP表達(dá)，調(diào)控成骨信號(hào)、促進(jìn)成骨分化。可見(jiàn)未來(lái)可將外泌體作為切入點(diǎn)，更全面地研究中醫(yī)藥膳治療PMOP的機(jī)制。

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（本文編輯? 周? 旦）879B4C35-4350-4A26-B58A-A13EDCB72EF8