欒慶東 , 曹 旭 ， 尹燕博 ， 王建琳

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

家禽尿酸鹽沉積是由于體內(nèi)嘌呤代謝異常而導(dǎo)致尿酸生成過(guò)多，或腎臟功能障礙而導(dǎo)致尿酸排出障礙造成體內(nèi)尿酸水平過(guò)高，以尿酸鹽的形式在體內(nèi)沉積，分為內(nèi)臟型痛風(fēng)和關(guān)節(jié)型痛風(fēng)[1]。據(jù)報(bào)道，家禽尿酸鹽沉積在世界范圍內(nèi)存在，是導(dǎo)致家禽死亡的重要因素之一[2]。引起雞尿酸鹽沉積的原因有多種，包括病原微生物感染、飼養(yǎng)管理和營(yíng)養(yǎng)性因素等，其中病毒感染主要包括雞腎型傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)[2]、禽腎炎病毒(Avian nephritis virus，ANV)[3]和雞星狀病毒(Chicken astrovirus，CAstV)[4]。

腎型IBV是雞傳染性支氣管炎的主要類型之一，為γ冠狀病毒，具有強(qiáng)烈的嗜腎性，該病毒感染后改變了多種代謝途徑而導(dǎo)致腎臟損傷，臨床以腎臟腫大、蒼白，腎小管和輸尿管內(nèi)尿酸鹽沉積為主要病理特征[5]，是多年來(lái)影響我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病。ANV最初被認(rèn)為是一種小核糖核酸病毒，2000年Imada等根據(jù)其核苷酸序列特征將之歸為星狀病毒，該病毒感染成年雞后無(wú)明顯臨床癥狀，感染雛雞引起生長(zhǎng)發(fā)育緩慢和腎臟損傷，臨床患雞出現(xiàn)腹瀉、間質(zhì)性腎炎和尿酸沉積等特征[6]。CAstV最初被歸為是腸道樣流感病毒，與臨床雞的矮小—發(fā)育遲緩綜合征、生長(zhǎng)抑制等相關(guān)，雞星狀病毒感染肉雞后出現(xiàn)明顯的體重增長(zhǎng)緩慢、腸道損傷和腎臟損傷等現(xiàn)象[7-10]，且部分毒株感染后出現(xiàn)明顯的尿酸鹽沉積[4,10]。近年來(lái)，不斷有研究報(bào)道我國(guó)存在雞星狀病毒感染[11-13]。

鑒于IBV、ANV和CAstV是引起雞尿酸鹽沉積的主要病毒，且在我國(guó)雞群中廣泛存在，本研究擬建立這3種病毒的多重PCR檢測(cè)方法，以期為臨床家禽尿酸鹽沉積的診斷及這3種病毒感染的監(jiān)控提供方法，為這3種病毒感染引起疾病的流行病學(xué)研究及綜合防控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒 雞星狀病毒(CAstV)、禽腎炎病毒(ANV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、J亞型禽白血病病毒(Avian leueosis virus subgroup J，ALV-J)、雞馬立克式病毒(Marek′s disease virus，MDV)、血清4型禽腺病毒-I群(Fowl adenovirus virus 4，F(xiàn)AdV-4)和減蛋綜合征病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)均為本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存毒株。

1.2 試劑和載體 DNAiso、RNAiso Plus、pMD18-T、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Mix，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；TIANprep Mini Plasmid Kit、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Gel Extraction Micro Kit，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒核酸的提取與反轉(zhuǎn)錄 按照DNAiso和RNAiso Plus說(shuō)明書提取FAdV-4、MDV、EDSV的DNA和CAstV、ANV、IBV和ALV-J的RNA，RNA按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將DNA和cDNA保存在-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的CAstV的ORF-1b基因、ANV的ORF-1b基因和IBV的N基因分別設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物(表1)，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 CAstV、ANV和IBV檢測(cè)用引物序列

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備 將保存的病毒cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每種病毒的反應(yīng)體系均為25 μL：2×TaqMix 12.5 μL，模板1 μL，正向引物和反向引物各1 μL，用8.5 μL蒸餾水補(bǔ)足體系至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：第1階段95 ℃ 5 min；第2階段30個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s，CAstV 55 ℃(IBV 57 ℃，ANV 50 ℃) 30 s，72 ℃ 1 min 30 s；第3階段72 ℃ 10 min。通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。通過(guò)膠回收試劑盒回收目的片段，然后將各個(gè)目的片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化后挑取單克隆，通過(guò)PCR驗(yàn)證后陽(yáng)性質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序正確的產(chǎn)物提取質(zhì)粒。測(cè)序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件優(yōu)化 取CAstV、ANV 和IBV 的cDNA，在建立單項(xiàng)PCR反應(yīng)條件基礎(chǔ)上，建立多重PCR檢測(cè)方法，優(yōu)化多重PCR的退火溫度，以確定最佳反應(yīng)條件。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.5 多重PCR的特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn) 應(yīng)用優(yōu)化后的多重PCR分別對(duì)FAdV-4、EDSV、MDV和ALV-J進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。提取CAstV、ANV 和IBV的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒后測(cè)定其濃度并計(jì)算拷貝數(shù)，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋進(jìn)行多種PCR敏感性的檢測(cè)，從而確定多重PCR檢測(cè)方法的最小檢測(cè)限度。以構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，采用建立的多重PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)第3周和第5周放置的模板，從而驗(yàn)證所建立方法的可靠性和重復(fù)性。

1.3.6 臨床病料的檢測(cè) 隨機(jī)采集臨床尿酸鹽沉積雞的肝臟、腎臟等臟器，加入5倍量生理鹽水后勻漿。置于-80 ℃冰箱反復(fù)凍融3次，7 500 r/min離心取上清液，提取核酸。用單項(xiàng)PCR和本試驗(yàn)建立的多重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 單項(xiàng)PCR方法的建立 單項(xiàng)PCR的反應(yīng)體系：2×TaqMix 12.5 μL、正向引物(10 mmol/L)和反向引物(10 mmol/L)各1 μL、模板 2 μL、ddH2O 8.5 μL；擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，CAstV55 ℃(IBV 57 ℃，ANV 50 ℃)30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，CAstV、ANV和IBV 均能擴(kuò)增出預(yù)計(jì)條帶，大小分別為350 bp、794 bp和1 600 bp(圖1)，經(jīng)測(cè)序結(jié)果均正確。

圖1 CAstV的ORF-1b基因、ANV的ORF-1b基因和IBV的N基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 多重PCR檢測(cè)方法的建立 通過(guò)設(shè)置梯度退火溫度來(lái)確定多重PCR檢測(cè)方法的最佳退火溫度條件，最終確定多重PCR檢測(cè)方法的最佳擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53.1 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min(圖2)。

圖2 CAstV、ANV和IBV多重PCR檢測(cè)方法優(yōu)化退火溫度

2.3 特異性檢測(cè) 取實(shí)驗(yàn)室保存的毒株FAdV-4、EDSV、MDV的DNA和ANV、CAstV、IBV、ALV-J的RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照已確認(rèn)的多重PCR檢測(cè)方法的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。其中CAstV、ANV和IBV均可擴(kuò)增出與預(yù)期一致的條帶，而FAdV、EDSV、MDV和ALV-J均無(wú)特異性條帶(圖3)。

圖3 CAstV、ANV和IBV多重PCR檢測(cè)方法的特異性

2.4 敏感性檢測(cè) 用TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒提取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度為CAstV 222 ng/μL、ANV 241 ng/μL和IBV 276 ng/μL，經(jīng)公式換算得出拷貝數(shù)為CAstV 6.68×1010copies/μL、ANV 6.30×1010copies/μL和IBV 5.87×1010copies/μL。 將質(zhì)粒10倍倍比稀釋后，經(jīng)多重PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)得出最低檢測(cè)限為CAstV 1.33×105copies/μL、ANV 2.10×102copies/μL和IBV 1.96×102copies/μL(圖4)。

圖4 CAstV、ANV和IBV多重PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 為驗(yàn)證所建立方法的可靠性和穩(wěn)定性，以建立的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，在第3周和第5周2個(gè)不同時(shí)間段使用不同PCR儀器進(jìn)行檢測(cè)，第3周和第5周的檢測(cè)結(jié)果如圖5、圖6所示，CAstV的最低檢測(cè)限仍為1.33×105copies/μL，ANV的最低檢測(cè)限為2.10×103copies/μL，IBV的最低檢測(cè)限為1.96×103copies/μL。結(jié)果表明建立的方法具有可靠性和穩(wěn)定性。

圖5 第3周重復(fù)性試驗(yàn)

圖6 第5周重復(fù)性試驗(yàn)

2.6 臨床病料檢測(cè) 采集臨床痛風(fēng)病料20份，核酸經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，同時(shí)采用單項(xiàng)PCR檢測(cè)方法和本試驗(yàn)建立的多重PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，2種檢測(cè)方法結(jié)果完全一致，IBV陽(yáng)性率為15%，ANV陽(yáng)性率為5%，CAstV陽(yáng)性率為5%(圖7)。

圖7 CAstV、ANV和IBV多重PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床病料的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

家禽痛風(fēng)是家禽常見的重要疾病之一，世界各地均有報(bào)道，大部分家禽痛風(fēng)是群體發(fā)病且死亡率較高，有時(shí)可高達(dá)30%[14]。尿酸由肝臟產(chǎn)生，是鳥類氮代謝的最終產(chǎn)物，主要通過(guò)腎臟排出體外，當(dāng)腎臟排出障礙，如輸尿管阻塞、腎臟損傷等，將導(dǎo)致高尿酸血癥，尿酸鹽將沉積于心臟、肝臟、腸系膜和氣囊表面等，嚴(yán)重病例可在脾臟和其他器官內(nèi)沉積，內(nèi)臟尿酸鹽的沉積可導(dǎo)致家禽死亡[15]。引起家禽痛風(fēng)的原因比較復(fù)雜，診斷確定病因采取相應(yīng)措施是有效控制家禽痛風(fēng)的關(guān)鍵。近年來(lái)，臨床陸續(xù)檢出CAstV和ANV感染，且研究表明這2種病毒的感染可引起家禽尿酸鹽沉積[4,10,16-17]，引起我國(guó)學(xué)者的關(guān)注。對(duì)我國(guó)不同省份雞群樣品進(jìn)行CAstV感染的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，CAstV感染在我國(guó)雞群非常普遍；病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明我國(guó)雞群中CAstV和ANV廣泛存在，且二者常常共同感染[11,18]。

傳統(tǒng)的病毒檢測(cè)方法包括病毒分離及電鏡觀察、瓊脂凝膠擴(kuò)散、血凝抑制和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等血清學(xué)檢測(cè)方法，這些方法存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、試驗(yàn)周期長(zhǎng)或需要相應(yīng)的抗體等不足，故分子生物學(xué)檢測(cè)方法在病原的檢測(cè)，尤其是病毒檢測(cè)方面得到了廣泛地應(yīng)用[19]。故本試驗(yàn)針對(duì)引起雞尿酸鹽沉積的3種病毒建立多重PCR檢測(cè)方法。

IBV基因編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為纖突糖蛋白(Spike protein，S)、核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，N)、膜蛋白(Membrane protein，M)和小囊膜蛋白(Envelope protein，E)，IBV的N蛋白是位于膜內(nèi)部的結(jié)構(gòu)蛋白，是IBV誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有高度保守性[20]。CAstV和ANV均屬于禽星狀病毒屬[21]，包括兩端的非編碼區(qū)、Poly(A)尾和ORF-1a、ORF-1b、ORF-2三個(gè)開放閱讀框，其中ORF-1a和ORF-1b編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF-2編碼衣殼蛋白，ORF-1b是整個(gè)基因組中非常保守的基因，常作為靶基因來(lái)檢測(cè)病毒[22-23]。本試驗(yàn)分別以IBV的N基因、CAstV和ANV的ORF-1b基因設(shè)計(jì)引物，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增相應(yīng)的基因，其條帶分別為1 600 bp、350 bp和794 bp，擴(kuò)增條帶大小可明顯區(qū)分3種病毒；且建立的多重PCR方法僅能檢測(cè)相應(yīng)的IBV、CAstV和ANV，其他常見病毒如FAdV-4、EDSV、MDV和LV-J經(jīng)檢測(cè)均無(wú)條帶，表明該多重PCR方法具有良好的特異性。建立的多重PCR方法經(jīng)條件優(yōu)化，3種病毒的最低檢測(cè)限分別為CAstV 1.33×105copies/μL、ANV 2.10×103copies/μL、IBV 1.96×103copies/μL，具有較高的敏感性。用建立的多重PCR方法對(duì)臨床雞尿酸鹽沉積病例進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與單項(xiàng)PCR檢測(cè)結(jié)果一致，具有較好的穩(wěn)定性。

本試驗(yàn)針對(duì)臨床引起雞尿酸鹽沉積的IBV、CAstV和ANV，建立檢測(cè)這3種病毒的多重PCR方法，能同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分這3種病毒，特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好，可為臨床這3種病毒的檢測(cè)、雞尿酸鹽沉積的診斷及流行病學(xué)調(diào)查等提供有力的技術(shù)支持。