王 鴻 ， 于泓瀟 ， 張嶼萌 ， 張雅琪 ， 鄧景月 ， 趙建國 ， 韓 謙

(1. 海南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ， 海南 ?？?570228 ； 2. 海南大學(xué)全健康研究院 ， 海南 ?？?570228 ; 3. 海南大學(xué)藥學(xué)院 ， 海南 ?？?570228)

多殺菌素(Spinosad)是在刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)發(fā)酵液中提取的一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，經(jīng)過近年的發(fā)展已經(jīng)成為國際公認的新型無害殺蟲劑[1]。多殺菌素在土壤中的光解半衰期為9～10 d，在水中的光解半衰期少于1 d，具有光解速度快、環(huán)境持久性風(fēng)險低的特點[2]。白紋伊蚊(Aedesalbopictus)屬于“半家蚊”，多滋生于居民點及其周圍的各種人工積水容器中,是傳播登革熱的重要媒介[3]。目前就蚊幼的控制而言，基于蘇云金桿菌以色列變種、球形芽孢桿菌和刺糖多孢菌的微生物殺蟲劑受到了廣泛的重視[4-5]。蚊蟲的許多行為(如吸血、產(chǎn)卵和宿主搜尋等)主要受宿主動物氣味物質(zhì)的影響。如人體對蚊蟲引誘的差異與人體汗液有關(guān)，而脂肪酸銨類物質(zhì)是人體汗液的主要成分，已被證實參與影響蚊蟲宿主搜尋行為[6]。均一體緩釋劑指在一定溫度下，將原藥均勻分散在高分子聚合物中，使兩者混為一體，形成固溶體、分散體或凝膠體，然后按需加工成固體形態(tài)的緩釋劑型[7-8]。本試驗利用十六醇、聚乙二醇和碳酸銨等材料采用物理包埋的方法搭建骨架層-緩釋層制成一種具有殺滅與引誘作用的緩釋塊并測定其緩釋性質(zhì)，運用生物測定的方法測試其對白紋伊蚊幼蟲的殺滅效果以及對成蟲的誘卵效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 多殺菌素標準品(純度為99%，上?，斞旁噭┯邢薰?；聚乙二醇-1000、十六醇(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)；碳酸銨(分析純，西隴科學(xué)有限公司)；二氯甲烷、甲醇、乙腈(色譜純，上海麥克林生化科技有限公司)。

1.2 主要儀器 高效液相色譜儀(LC-20ADXR，日本島津公司)；恒溫磁力攪拌儀(GL-3250A，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；氮吹儀(HSC-12B，天津恒奧科技有限公司)；超聲波清洗儀(PS-40，深圳市超藝達科技有限公司)。

1.3 蚊蟲飼養(yǎng) 白紋伊蚊由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與流行病所提供。飼養(yǎng)條件為:溫度(26±1) ℃、相對濕度60%～70%、光周期12 L∶12 D(光照∶黑暗)。

1.4 多殺菌素緩釋劑的制備 將聚乙二醇-1000與十六醇按2.0 g ∶1.5 g比例置于80 ℃中恒溫均勻攪拌形成骨架-緩釋層，使用恒溫磁力攪拌器攪拌冷卻至60 ℃后，加入多殺菌素原藥攪拌混勻，冷卻至50 ℃后迅速倒模并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按上述條件分別制成加入0.05 g和0.02 g多殺菌素原藥的成品(用Spi-Block1和Spi-Block2表示)，以不含多殺菌素(用Block表示)為對照。

1.5 高效液相色譜法(HPLC)測定緩釋濃度

1.5.1 色譜條件[9]色譜柱:島津C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相:甲醇—乙腈—水(40∶40∶20)，使用前經(jīng)超聲混勻備用；體積流量:0.8 mL /min；檢測波長:246 nm；柱溫:25 ℃；進樣量:10 μL。

1.5.2 標準曲線的繪制 稱取多殺菌素0.01 g標準品，精確到0.000 1 g，用甲醇配成 1 mg/mL的標準溶液，使用甲醇逐級稀釋為5、20、40、80 μg/mL和100 μg/mL 的梯度濃度溶液，用0.45 μm濾膜過濾后經(jīng)HPLC檢測，用峰面積W對濃度C(mg/mL)作線性回歸，得到回歸方程y=85.713x+26.544，R2= 0.999 8，成良好線性關(guān)系。

1.5.3 樣品緩釋濃度的測定 稱取0.25 g Spi-Block1于生測杯中,加入500 mL純水，分別取1、3、5、7 d和9 d的緩釋液1 mL，同時加入0.5 mL二氯甲烷超聲10 min，用氮氣吹干后加入1 mL甲醇復(fù)溶，以等量多殺菌素原藥作為對照，二者均設(shè)3個重復(fù)，用1.5.1的色譜條件進行測定，用1.5.2繪制的標準曲線計算出9 d緩釋濃度。

1.6 多殺菌素緩釋劑的快速滅蚊效果測試 選擇聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)推薦的幼蟲浸漬法[10]來測試Spi-Block的速殺效果，在生測杯中加入25條3～4齡期的白紋伊蚊幼蟲和100 mL去氯水，試驗組加入Spi-Block1、Spi-Block2；對照組加入質(zhì)量相同的Block；空白對照組不作處理(25條幼蟲+100 mL去氯水)，每組均設(shè)3個重復(fù)，24 h內(nèi)每隔3 h測定1次，記錄活幼蟲數(shù)目。

1.7 多殺菌素緩釋劑的長效滅蚊效果測試 在生測杯中加入25條3～4齡期的白紋伊蚊幼蟲和100 mL 去氯水，試驗組加入Spi-Block1和Spi-Block2；對照組加入0.05 g純多殺菌素，空白對照組不作處理(25條幼蟲+100 mL去氯水)，每組均設(shè)3個重復(fù)，每周進行1次幼蟲生物測定，持續(xù)4周，記錄每周活幼蟲數(shù)目。

1.8 多殺菌素緩釋劑對白紋伊蚊誘卵試驗 按照1.4的試驗方法加入0.2 g碳酸銨制成帶有引誘劑的Spi-lu-Block。根據(jù)WHO關(guān)于孳生地陷阱測試指南[11]進行試驗設(shè)計，于40 cm×40 cm×40 cm規(guī)格養(yǎng)蚊籠中，在等面積范圍內(nèi)放置3個生測杯,試驗組為用100 mL Spi-lu-Block浸出液浸潤1 d的濾紙+100 mL去氯水，對照組為用100 mL Block浸出液浸潤1 d的濾紙+100 mL去氯水，空白對照組為濾紙+100 mL去氯水；放入20只孕雌蚊，產(chǎn)卵1 d后收集濾紙，記錄各組中蚊卵的數(shù)目，計算誘卵率和產(chǎn)卵活躍指數(shù)。

誘卵率(OR)=試驗組卵數(shù)/產(chǎn)卵總數(shù)×100%

產(chǎn)卵活躍指數(shù)(OAI)=(試驗組卵數(shù)-對照組卵數(shù))/產(chǎn)卵總數(shù)

當(dāng)OR>50%，OAI>0時，表明試驗組具有誘卵作用，反之，則具有趨避作用。當(dāng)OAI>0.3時，表明試驗組具有顯著的誘卵作用。

1.9 統(tǒng)計分析 對1.6中時間、幼蟲死亡數(shù)、幼蟲總數(shù)3個因子通過SPSS 22.0軟件Regression中Probit板塊計算致死中時(LT50)，對1.6、1.7中致死率數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行分析并繪圖，使用GraphPad Prism 8.0軟件對OR和OAI進行分析并繪圖。

2 結(jié)果

2.1 多殺菌素緩釋劑液相測定 結(jié)果如圖1所示，緩釋劑中多殺菌素出峰時間約為5.6 min，峰型良好，不受其他雜質(zhì)峰影響。

圖1 緩釋樣品液相色譜圖

2.2 多殺菌素緩釋劑的緩釋性能 結(jié)果如圖2所示，純多殺菌素9 d最大溶出率為37.39%，且在第5天達到最大，無緩釋規(guī)律；緩釋劑中多殺菌素7 d平均緩釋率為14.54%(P<0.01)；重復(fù)試驗之間無顯著差異(P=0.126)。

圖2 緩釋劑中多殺菌素與純多殺菌素釋放曲線

2.3 緩釋劑的殺滅與引誘效果

2.3.1 快速滅蚊效果測試 24 h幼蟲毒力測試結(jié)果如圖3所示，對照組沒有出現(xiàn)死亡數(shù)，與試驗組存在極顯著差異(P<0.01),不同劑量的多殺菌素緩釋劑之間的滅殺效果存在極顯著差異(P<0.01)，重復(fù)試驗之間無顯著差異(P=0.955)。

圖3 不同劑量多殺菌素緩釋劑的快速滅蚊效果

2種緩釋劑對白紋伊蚊幼蟲的致死中時如表1所示，緩釋劑與空白對照間的致死中時有顯著差異(P<0.05)；緩釋劑之間致死中時無顯著差異(P=0.963)。

表1 2種不同劑量緩釋劑對白紋伊蚊幼蟲的致死中時

2.3.2 長效滅蚊測試 多殺菌素緩釋劑1個月長效滅蚊效果測試結(jié)果如圖4所示，多殺菌素原藥對照組在第4周滅蚊效果突降，1個月平均滅蚊率為81.33%，2種多殺菌素緩釋劑的1個月平均滅蚊率分別為95.33%和86.80%；Spi-Block1組滅蚊率與對照組相比有顯著差異(P<0.05)；Spi-Block2組則受劑量因素影響與對照組無顯著差異(P=0.566)。

圖4 多殺菌素緩釋劑1個月長效滅蚊效果

2.3.3 引誘作用 結(jié)果如圖5所示，在白紋伊蚊孕蚊對試驗組和對照組的產(chǎn)卵偏好選擇時，試驗組的平均OR為83.71%，對照組僅為32.45%，試驗組OAI為0.68，與對照組相比具有極顯著的誘卵效果(P<0.01)。

圖5 多殺菌素緩釋劑的誘卵效果

3 討論

目前，關(guān)于多殺菌素緩釋劑型的研究多以懸浮劑和微球制劑為主，其中多以高分子化合物作為輔料包埋藥物以達到控釋目的。Xu等以殼聚糖為載體制成多殺菌素微球緩釋劑[12]；Li等采用殼聚糖共沉淀法包埋多殺菌素進行控釋[13]；Cheng等制備多殺菌素與碳酸銨復(fù)合微球防治沙棘繞實蠅成蟲[14]；Huang等以聚脲異氰酸酯為壁材制備6%呋喃威-多殺菌素微囊懸浮劑[15]。而多殺菌素的毒力作用研究則以小菜蛾、蚜蟲等農(nóng)業(yè)害蟲為主，針對蚊蟲等媒介昆蟲的研究還尚不充分[16-18]。本試驗制備的緩釋片劑契合了白紋伊蚊容器型小水體的孽生習(xí)性且方便使用。選擇碳酸銨作為引誘劑集中蚊蟲進行殺滅，可用于家庭、養(yǎng)殖場等環(huán)境防治白紋伊蚊。采用十六醇和聚乙二醇組成的緩釋層延長了多殺菌素在水體中的釋放時間，達到了長控緩釋的效果，但聚乙二醇在高溫潮濕的環(huán)境下會發(fā)生消融，后期將會優(yōu)化輔料與藥物比例提高穩(wěn)定性與短控緩釋效果。