程 晶 ， 許 健 ， 劉文曉 , 江 波 ， 李永清

(1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 北京 海淀 100097 ； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室 ， 甘肅 蘭州 730046)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種急性、烈性傳染病。ASFV 感染家豬和野豬后，死亡率極高，可達100%，是我國目前養(yǎng)豬業(yè)主要的傳染病[1]。由于目前對于該病尚無有效的疫苗和治療藥物，因此建立良好的生物安全體系是切斷該病傳播的最有效措施，而實施全面徹底的消毒又是生物安全體系中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。ASFV為具有雙層膜結(jié)構(gòu)的200 nm的大型囊膜病毒，基因組為170～193 kb的雙鏈DNA。病毒粒子呈現(xiàn)復(fù)雜多層的二十面體結(jié)構(gòu)，整體由內(nèi)向外依次是病毒基因組、核殼、內(nèi)膜、衣殼和外膜。正是由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，ASFV對外界環(huán)境有更強而廣泛的耐受性。ASFV在低溫保持高度穩(wěn)定[2]，在冷藏條件下，血液中存在的病毒可以存活18個月，在冷凍肉中可存活1 000 d以上[3]，加熱至56 ℃ 可70 min滅活，60 ℃滅活需要20 min；ASFV具有強耐酸堿性[4]，可耐受酸堿性范圍從pH<3.9至pH>13，血清可增加病毒的抵抗力，例如在pH為13.4時，無血清抗性持續(xù)長達21 h，而有血清則持續(xù)7 d。世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)手冊指出ASFV對一些消毒劑敏感[5]，如用8%氫氧化鈉(NaOH)作用30 min，3%福爾馬林作用30 min，或3%正苯基苯酚作用30 min等均能使病毒滅活，但目前市面上消毒劑品種眾多，各消毒制劑在臨床上對ASFV的滅活效果表現(xiàn)參差不一，因此比較分析不同消毒劑對ASFV的滅活效果，對在養(yǎng)殖過程中防控ASFV傳播和感染具有重要意義。

基于此，本試驗采用細(xì)胞感染試驗檢測10種消毒劑對ASFV的滅活效果?；诒容^分析結(jié)果，進一步選擇了3種消毒劑對曾經(jīng)暴發(fā)非洲豬瘟的廢棄豬場進行了環(huán)境消毒驗證，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病毒 中國非洲豬瘟病毒分離株ASFV SY18ΔMGF/ΔCD2v株[6](病毒含量107.5TCID50/mL)，該病毒感染豬原代肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)后表達綠色熒光蛋白，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所提供。

1.2 細(xì)胞 PAM取自1月齡經(jīng)檢測ASFV抗原和抗體陰性的臨床健康豬的新鮮豬肺。用止血鉗夾住豬喉部下方，用線繩結(jié)扎與心臟相連的血管；采用滅菌的生理鹽水或PBS沖洗肺外側(cè)雜物，移至生物安全柜中；用酒精棉球消毒喉頭部分，向肺內(nèi)灌入PBS，直至肺葉全部隆起；止血鉗結(jié)扎喉管，輕揉肺表面5 min，無菌收集灌洗液。反復(fù)4次后，用細(xì)胞濾器過濾全部的灌洗液，分裝離心管后1 000 r/min離心5～10 min，將收取的肺泡巨噬細(xì)胞計數(shù)。將細(xì)胞稀釋至2×106個細(xì)胞/mL。

1.3 消毒劑 本試驗所用消毒劑為由北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司提供的商品化消毒劑，主要成分和配制方法見表1。

表1 所用消毒劑的主要成分和配制方法

1.4 試劑和耗材 細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM和胎牛血清，均購自Gibco公司；Cell Counting Kit-8，購自北京安必奇生物科技有限公司；ASFV熒光定量PCR檢測試劑盒，購自百沃特(天津)生物技術(shù)有限公司。

1.5 病毒滴度的測定 將PAM以2×106個/孔接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將病毒液與細(xì)胞培養(yǎng)液按1∶10比例稀釋混合后，做8個稀釋度(10-3～10-10)，取100 μL各稀釋液接種到8個細(xì)胞孔中。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)72 h后，在熒光顯微鏡下觀察并計算有熒光的細(xì)胞孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法測定TCID50/mL的數(shù)值。本試驗在中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所BSL-3實驗室進行。

1.6 消毒劑稀釋液對細(xì)胞狀態(tài)的影響 將10種消毒液用含5%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基按照200、400、800、1 600倍和3 200倍稀釋。待96孔板中細(xì)胞長至單層時棄去培養(yǎng)基，加入100 μL含有稀釋消毒劑的培養(yǎng)液，每個稀釋度設(shè)置5個重復(fù)孔，同時設(shè)置不加消毒劑的陰性細(xì)胞孔。37 ℃孵育1 h，棄細(xì)胞上清液，更換新培養(yǎng)液。37 ℃孵育8 h，在光鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。利用CCK-8細(xì)胞增殖-毒性試劑盒檢測并計算消毒劑處理后的細(xì)胞活性，以篩選出對細(xì)胞安全的消毒液濃度。細(xì)胞活性計算公式：

細(xì)胞活性(%)=[A1-A0]/[A2-A0]×100%

式中A1為含消毒劑和CCK8溶液的細(xì)胞孔吸光度值，A2為不含消毒劑、含CCK8溶液的陰性細(xì)胞孔吸光度值，A0為含CCK8溶液和DMEM培養(yǎng)液、而不含細(xì)胞的空白孔吸光度值。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。判定標(biāo)準(zhǔn)：“0”表示細(xì)胞活性<10%；“1”表示細(xì)胞活性≥10%且<20%，“2”表示細(xì)胞活性≥20%且<40%；“3”表示細(xì)胞活性≥40%且<60%；“4”表示細(xì)胞活性≥60%且<80%；“5”表示細(xì)胞活性≥80%。

1.7 消毒劑滅活A(yù)SFV效果檢測 將10種消毒液用細(xì)胞培養(yǎng)基先按照160、320、640倍和1 280倍稀釋，各取80 μL稀釋消毒液至96孔板，分別加入20 μL病毒液，消毒劑終濃度達到1∶200 ～ 1∶1 600，同時設(shè)置80 μL細(xì)胞培養(yǎng)液加20 μL病毒液作為陽性對照，并設(shè)立不加病毒液僅加100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液的陰性對照，相同條件設(shè)2個重復(fù)孔?；旌暇鶆?，反應(yīng)條件設(shè)室溫靜置0.5 h和2 h。反應(yīng)結(jié)束，取各個消毒劑和病毒混合液加入含單層細(xì)胞的96孔板中，每孔100 μL。37℃孵育1 h后，棄細(xì)胞上清液，更換新培養(yǎng)液。37 ℃孵育72 h后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。若消毒液在終濃度1 600倍對細(xì)胞有損傷，則繼續(xù)取80 μL稀釋至1 600、3 200倍和6 400倍，分別加入20 μL病毒液，消毒劑終濃度達到1∶2 000、 1∶4 000和1∶8 000，混合均勻，室溫靜置0.5 h 和2 h，重復(fù)上述操作檢測消毒劑殺滅ASFV的效果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：有熒光信號，說明該稀釋度的消毒劑不能將病毒全部殺死；無熒光信號，說明該稀釋度的消毒劑可將病毒全部殺死。

1.8 消毒劑對豬場環(huán)境的消毒效果 根據(jù)上述消毒劑篩選結(jié)果，選取過硫酸氫鉀復(fù)合物、戊二醛和次氯酸這3種消毒劑，按照其使用說明書進行稀釋，在北京地區(qū)某豬場進行圈舍和場地消毒，1 h后分別采集畜欄、墻壁和場地等不同地點的樣品，帶回實驗室后用ASFV熒光定量PCR檢測試劑盒進行檢測。判定標(biāo)準(zhǔn)：樣品Ct值≤38并出現(xiàn)特定的擴增曲線，且陰性、陽性對照成立(陽性對照Ct值≤38并出現(xiàn)特定的擴增曲線，陰性對照無Ct值并無特定擴增曲線)，則判定為陽性。

2 結(jié)果

2.1 消毒劑對細(xì)胞狀態(tài)的影響 不同濃度消毒劑對細(xì)胞狀態(tài)的影響不同。加入消毒劑1 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)，過硫酸氫鉀復(fù)合物、二氯異氰脲酸鈉、次氯酸、苯扎溴銨、聚酮維碘的最低稀釋度(1∶200)對細(xì)胞狀態(tài)幾乎無影響。戊二醛、復(fù)方戊二醛、雙癸基二甲基氯化銨、碘酸混合溶液、戊二醛癸甲氯銨則對細(xì)胞狀態(tài)的影響比較大，在低于400倍稀釋時，無存活細(xì)胞，在800～1 600倍稀釋時對細(xì)胞也產(chǎn)生不同程度的損害，但在3 200倍稀釋時對細(xì)胞損害較小，結(jié)果見表2。

表2 不同稀釋度消毒劑對細(xì)胞狀態(tài)的影響

2.2 消毒劑在細(xì)胞上滅活A(yù)SFV效果檢測 結(jié)果如表3所示，過硫酸氫鉀復(fù)合物在200倍稀釋，室溫作用時間≥0.5 h，可完全滅活A(yù)SFV；二氯異氰脲酸鈉和苯扎溴銨，稀釋到800倍，室溫作用≥0.5 h，可完全滅活A(yù)SFV；苯扎溴銨稀釋到1 600倍時，室溫作用2 h可完全滅活A(yù)SFV，室溫作用0.5 h，不能完全滅活A(yù)SFV；聚酮維碘稀釋到1 600倍，室溫作用≥0.5 h，可完全滅活A(yù)SFV。由于戊二醛、復(fù)方戊二醛、雙癸基二甲基氯化銨、碘酸混合溶液、戊二醛癸甲氯銨在稀釋度低于1 600倍時對細(xì)胞活性影響較大，故稀釋度低于1 600倍時，無法判斷其對ASFV的滅活活性。次氯酸在最低稀釋倍數(shù)200倍時，室溫作用時間≥2 h，都無法滅活A(yù)SFV。

戊二醛、復(fù)方戊二醛、雙癸基二甲基氯化銨和戊二醛癸甲氯銨在1 600倍稀釋時對細(xì)胞活性有影響，稀釋至3 200倍以上時對細(xì)胞狀態(tài)影響較小。上述消毒劑在細(xì)胞安全劑量范圍的稀釋度內(nèi)(4 000～8 000倍 稀釋)可有效滅活A(yù)SFV，滅活病毒能力較強。雖然在8 000倍稀釋比例下，碘酸混合溶液處理仍有ASFV病毒粒子的存在，然而，在4 000倍細(xì)胞安全劑量的處理下能有效滅活A(yù)SFV，這表明碘酸混合溶液也具有滅活A(yù)SFV的能力，見表3。

表3 不同稀釋度消毒劑室溫作用0.5 h和2 h對ASFV的影響

2.3 3種消毒劑對豬場環(huán)境的消毒效果 選取體外細(xì)胞試驗表明滅活效果好、中、差的過硫酸鉀復(fù)合物、戊二醛和次氯酸3種消毒劑，在北京地區(qū)某曾經(jīng)暴發(fā)過非洲豬瘟的廢棄豬場進行圈舍和場地消毒1h后，分別采集地面畜欄、墻壁和場地等不同地點的樣品，以ASFV熒光定量PCR檢測試劑盒進行檢測，結(jié)果如表4所示，過硫酸鉀復(fù)合物和戊二醛能夠有效滅活A(yù)SFV，消毒后Ct值均大于38，且無特征性擴增曲線，次氯酸消毒后的畜欄和場地樣品的Ct值為12.55和14.56，且出現(xiàn)特征性擴增曲線，這表明過硫酸鉀復(fù)合物和戊二醛消毒后的環(huán)境中的樣品無ASFV核酸的檢出，但次氯酸未能滅活A(yù)SFV，消毒后的環(huán)境樣品仍有ASFV核酸的檢出。

表4 熒光定量PCR檢測3種消毒劑對豬場環(huán)境消毒效果

3 討論

ASFV是一種對宿主豬感染力極強、傳播性極高的病毒。該病毒自2018年傳入我國以來，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失和極度恐慌。由于目前尚無疫苗等防控技術(shù)手段，嚴(yán)格而合理的生物安全防控成為保障豬場發(fā)展的最可靠屏障[7]。在所有的生物安全操作過程中，對養(yǎng)殖環(huán)境采用消毒劑進行消毒是最為核心的手段，而正確選擇和使用消毒劑是消毒有效的重要前提。由于當(dāng)前我國市場上消毒劑品種繁多，難以選擇對ASFV滅活效果最佳的產(chǎn)品，因此本試驗挑選了10種普遍使用的消毒劑，首先在豬肺巨噬細(xì)胞上進行了ASFV的體外滅活試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過硫酸氫鉀復(fù)合物、二氯異氰脲酸鈉、苯扎溴銨和聚酮維碘對肺泡巨噬細(xì)胞的影響較小，在較低濃度的稀釋比例下可有效滅活豬肺泡巨噬細(xì)胞中的ASFV；戊二醛、復(fù)方戊二醛、雙癸基二甲基氯化銨、碘酸混合溶液、戊二醛癸甲氯銨對豬肺泡巨噬細(xì)胞的影響較大，但在細(xì)胞安全劑量的情況下，依然能夠有效滅活肺泡巨噬細(xì)胞中的ASFV。然而，次氯酸在細(xì)胞的安全濃度下不具有滅活A(yù)SFV的作用。

體外評價消毒劑滅活A(yù)SFV的效果可采用懸液定量法，通過測定加入消毒劑前后病毒含量的變化，來判定消毒劑的滅活效果[7]。測定ASFV病毒含量的方法通常有紅細(xì)胞吸附試驗和間接免疫熒光(IFA)[8]。紅細(xì)胞吸附試驗需要制備新鮮SPF豬的紅細(xì)胞，并且不同批次的紅細(xì)胞吸附能力不同，甚至有些毒株不具有紅細(xì)胞吸附能力；IFA測定病毒滴度耗時長，加之需要抗體等昂貴試劑，加大了檢測的成本。本試驗采用的ASFV SY18ΔMGF/ΔCD2v株由于缺少了相應(yīng)的毒力基因，因此生物安全風(fēng)險大為降低，且其感染PAM后表達綠色熒光蛋白，因此可直接通過熒光顯微鏡觀察熒光信號來判讀結(jié)果，具有高效、快速和經(jīng)濟等優(yōu)點。

消毒劑對病毒的體外滅活效果通常是在實驗室理想狀態(tài)條件下進行的，但在臨床實際消毒實施過程中，消毒劑的使用效果可能會出現(xiàn)偏差，其原因可能是有機物的存在抵消了消毒劑的作用[9]，即血液、糞便等有機物存在的條件下，病毒更穩(wěn)定、存活時間更長；豬欄和畜舍的漏縫地板、水泥底面和飼槽等各種設(shè)施經(jīng)過多次使用后，在其表面會形成由糞便、灰塵和細(xì)菌組成的生物膜，會阻礙消毒劑有效成分與病原微生物的接觸；環(huán)境中存在降低消毒劑的濃度或改變消毒劑pH等因素。為此，本試驗基于細(xì)胞體外試驗的結(jié)果，挑選了3種正規(guī)上市的商品化消毒劑，根據(jù)其使用說明書對北京地區(qū)某曾經(jīng)暴發(fā)過非洲豬瘟的廢棄豬場進行圈舍和場地消毒1h后，分別采集畜欄、墻壁和場地等不同地點的樣品，使用ASFV熒光定量PCR檢測試劑盒檢測ASFV核酸，結(jié)果顯示過硫酸氫鉀復(fù)合物、戊二醛對環(huán)境中的ASFV核酸具有較好的清除作用，但次氯酸未能降低豬圈內(nèi)殘留的病毒核酸，甚至可能有具有活性的病毒存在，從而證實了本試驗中細(xì)胞體外試驗結(jié)果的可靠性。需要指出的是：很多人認(rèn)為，消毒劑在環(huán)境中滅活病毒后，檢測病毒核酸意義不大。這種觀點對酒精等僅破壞病毒囊膜的消毒劑是合理的，但強氧化物等消毒劑可以使病毒核酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)，火堿等堿性消毒劑可以使病毒核酸發(fā)生中和反應(yīng)，破壞病毒的核酸結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，所以這些消毒劑對豬場進行消毒不僅能夠滅活病毒，更重要的是可以降解和清除病毒核酸，因而利用熒光定量PCR方法檢測病毒核酸來評價消毒劑的使用效果是可行的[10]。建議養(yǎng)殖場多考慮使用過硫酸氫鉀復(fù)合物、二氯異氰脲酸鈉、戊二醛、苯扎溴銨和聚酮維碘等消毒劑防控ASFV的感染。