牛曉昊 ， 黎玉瓊 ， 郭亞男 ， 王 鑫 ， 李繼東

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ， 寧夏 銀川 750021 ； 2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所 ， 寧夏 銀川 750002)

牛球蟲病(Bovine coccidiosis)是艾美耳球蟲寄生于牛腸道上皮細胞引起的原蟲病，具有嚴格的宿主特異性[1-2]。球蟲寄生于腸上皮細胞可導(dǎo)致腸道嚴重損傷，出現(xiàn)不同程度的腹瀉，偶爾可見血便。牛感染艾美耳球蟲1周后，其腸黏膜就會被破壞，進而造成細菌繼發(fā)感染，此時體溫升高，前胃遲緩，腸蠕動增強，體液過度消耗。當(dāng)轉(zhuǎn)化為慢性病后，?？沙霈F(xiàn)長期下痢、貧血、形體消瘦等現(xiàn)象，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失。國內(nèi)外均有牛球蟲病的報道。Koutny等[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，奧地利在2010年的艾美耳球蟲感染率為83.67%，并發(fā)現(xiàn)了11種艾美耳球蟲，其中牛艾美耳球蟲為優(yōu)勢蟲種。Tamrat等[4]對埃塞俄比亞西北部的奶牛球蟲調(diào)查結(jié)果顯示，球蟲感染是犢牛腹瀉的主要因素。患球蟲病的成年奶牛雖無明顯癥狀，但免疫力和飼料轉(zhuǎn)化率低，繼而引發(fā)其他疫病[4]。國內(nèi)的報道顯示，北京、新疆、甘肅等都是奶牛球蟲病的高發(fā)地區(qū)[5-7]。因此，防治牛球蟲病是減少牛產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟損失不可或缺的環(huán)節(jié)。

近年來，寧夏回族自治區(qū)大力發(fā)展畜牧業(yè)，奶牛球蟲病也越來越被重視，但對該地區(qū)奶牛球蟲病流行狀況的了解還不夠全面。本試驗通過對寧夏四地區(qū)不同月齡的奶牛球蟲病進行調(diào)查，分析不同月齡奶牛艾美耳球蟲的球蟲種類、感染率和感染強度，以期為寧夏奶牛球蟲病的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 顯微鏡(型號為OLYMPUS CX31)，購自上海富萊光學(xué)科技有限公司；計數(shù)板(型號為A3875)，購自上海富雪生物科技有限公司；膠頭滴管、網(wǎng)篩、離心機(型號為Centrifuge 5810 R)，均購自雷德生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)箱(型號為HF90)，購自上海力申科學(xué)儀器有限公司；電子天平(型號為JD500-2)，購自西杰天平(北京)儀器有限公司；載玻片、蓋玻片、燒杯、培養(yǎng)皿、氯化鈉、重鉻酸鉀，均購自上海廣諾化學(xué)科技有限公司；PBS緩沖液，購自金克隆(北京)生物科技有限公司。

1.2 樣品來源 按照每個月齡段奶牛總數(shù)的15%比例隨機采集樣本，共采集1 938份糞樣，通過直腸取樣或采集新鮮糞樣，隨后立即放入盛有冰袋的保溫箱里，并詳細記錄樣本采集牛的圈舍、牛號、月齡以及糞樣性狀。樣本帶回實驗室于4 ℃冰箱保存待檢。本調(diào)查涉及的14個牛場在6個月內(nèi)均沒有使用過抗球蟲藥。

1.3 卵囊計數(shù) 通過麥克馬斯特法對球蟲卵囊進行計數(shù)。取2 g糞樣置于干凈的100 mL燒杯內(nèi)，加入8 mL飽和食鹽溶液，用玻璃棒搗碎混勻。再加入50 mL飽和食鹽溶液，混勻后立即用60目篩網(wǎng)過濾。然后立即吸取濾液充滿2個計數(shù)室，在顯微鏡載物臺上靜置3～5 min，在10倍物鏡下鏡檢計數(shù)。每個計數(shù)室內(nèi)有100個方格，其體積為1 cm×1 cm×0.15 cm=0.15 mL。分別查完2個計數(shù)室100個方格內(nèi)的卵囊數(shù)量n1和n2，按照如下公式計算每克糞便中球蟲卵囊數(shù)(OPG)[8-9]。

OPG=[(n1+n2)/(2×0.15)]×60÷2

1.4 球蟲卵囊形態(tài)觀察 收集保存鏡檢球蟲卵囊呈陽性的糞樣每份20 g，將糞樣加入離心管內(nèi)，加入適量水?dāng)嚢杈鶆?。然后?0目和60目銅篩分別過濾，加PBS緩沖液3 500 r/min離心15 min，傾去上清液，重復(fù)1次。再加飽和食鹽水2 000 r/min離心10 min，此時糞渣沉于管底，卵囊漂浮于飽和食鹽水表面。移液槍吸取上清液注入含2.5%重鉻酸鉀溶液的培養(yǎng)皿中，保存于29 ℃的恒溫箱中每6 h鏡 檢觀察1次，待所有卵囊孢子化達到95%以上，得到孢子化卵囊，在400倍顯微鏡下觀察卵囊形態(tài)[10-12]。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SAS 8.2統(tǒng)計分析軟件中的卡方檢驗，對寧夏不同地區(qū)的奶牛球蟲發(fā)病率進行差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 寧夏四地區(qū)不同牛場球蟲的陽性率及感染強度 在寧夏四地區(qū)采集的1 938份新鮮糞樣中，共檢出856份為艾美耳球蟲陽性，平均感染率為44.17%。 各牛場均存在感染情況，其中奶牛球蟲病的最高陽性率為64.29%，最低陽性率為11.11%，最高平均OPG為5 776.32，最低平均OPG為283.58。每個牛場均存在混合感染，檢出艾美耳球蟲種類最多為12種，最少為2種。不同牛場奶牛艾美耳球蟲感染率無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在本次調(diào)查中，石嘴山市、銀川市、吳忠市和青銅峽市的奶牛球蟲陽性率分別為46.38%、46.36%、50.00%和27.71%，其中吳忠市的奶牛球蟲感染率最高，但平均OPG最大的是銀川市(5 776.32), 見表1。青銅峽市的陽性率與其他3個市的陽性率相比差異極顯著(P<0.01)。被檢測出的艾美耳球蟲種類分別有牛艾美耳球蟲、柱狀艾美耳球蟲、邱氏艾美耳球蟲、阿拉巴艾美耳球蟲、奧博艾美耳球蟲、巴西艾美耳球蟲、拔克朗艾美耳球蟲、加拿大艾美耳球蟲、橢圓艾美耳球蟲、皮利他艾美耳球蟲、亞球形艾美耳球蟲和懷俄明艾美耳球蟲，共12種艾美耳球蟲(見封底彩版圖1)，并檢出12 640個卵囊。

表1 寧夏四地區(qū)的不同牛場球蟲的陽性率及平均OPG

2.2 寧夏四地區(qū)的艾美耳球蟲感染種類及感染強度 本調(diào)查結(jié)果顯示，寧夏四地區(qū)牛艾美耳球蟲的感染率最高，為39.99%，是優(yōu)勢蟲種，其次為柱狀艾美耳球蟲，感染率為20.17%，石嘴山市奶牛球蟲的優(yōu)勢蟲種為牛艾美耳球蟲，銀川市奶牛球蟲的優(yōu)勢蟲種為牛艾美耳球蟲，吳忠市奶牛球蟲的優(yōu)勢蟲種為柱狀艾美耳球蟲，青銅峽市奶牛球蟲的優(yōu)勢蟲種為亞球形艾美耳球蟲和牛艾美耳球蟲。

2.3 寧夏不同月齡奶牛的球蟲感染情況分析 各個月齡奶牛的球蟲感染率不同，隨月齡呈現(xiàn)增長趨勢，1月齡以內(nèi)犢牛球蟲感染率最低，為11.32%，其中主要是大于21日齡的犢牛感染，小于21日齡的犢牛球蟲感染率為0；2～3月齡犢牛球蟲的平均感染強度最大，平均OPG為6 277.44；10～12月齡奶牛球蟲的陽性率最高，為62.07%，平均OPG為1 574.31，見表2。不同月齡奶牛球蟲的感染率統(tǒng)計學(xué)差異極顯著(P<0.01)。

表2 不同月齡奶牛球蟲感染情況

2.4 寧夏不同月齡奶牛感染艾美耳球蟲的種類變化情況分析 不同月齡奶牛感染艾美耳球蟲種類分析結(jié)果見圖2。1月齡以內(nèi)犢牛主要感染牛艾美耳球蟲，2～3月齡犢牛主要感染柱狀艾美耳球蟲，4～6月齡 奶牛主要感染牛艾美耳球蟲和皮利他艾美耳球蟲，7～9月齡奶牛主要感染亞球形艾美耳球蟲和牛艾美耳球蟲，10～12月齡奶牛主要感染牛艾美耳球蟲和亞球形艾美耳球蟲。不同月齡奶牛的優(yōu)勢蟲種也不一樣，牛艾美耳球蟲和邱氏艾美耳球蟲致病性最強，最容易危害犢牛。

圖2 寧夏四地區(qū)不同月齡奶牛感染艾美耳球蟲種類所占百分比

3 討論

近年來，奶牛球蟲病的發(fā)病率不斷上升，養(yǎng)殖戶對奶牛球蟲病也非常重視。張寬寬等[13]在2016年 對新疆7個地區(qū)18個規(guī)?；膛銮蛳x病的流行調(diào)查顯示，球蟲總感染率為35.0%(487/1 391)， 7～12月齡奶牛球蟲感染率最高，為48.8%。蔣業(yè)慧等[14]調(diào)查新疆奎屯地區(qū)5個規(guī)模化奶牛場發(fā)現(xiàn)，其奶牛球蟲平均感染率為34.14%(99/290)，2～3月齡犢牛球蟲感染強度最大，平均OPG為14 456。金蘭梅等[15]在2008年對江蘇部分地區(qū)奶牛場采集糞樣的調(diào)查結(jié)果顯示，奶牛球蟲感染率為33.52%(704/2 100)，其中2～6月齡奶牛球蟲感染率最高，為50.00%，0～1月齡犢牛感染率最低，為12.38%。倪曉婷等[16]在2015年對寧夏奶牛球蟲病的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，寧夏奶牛球蟲平均感染率為27.46%(117/426)。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，寧夏四地區(qū)奶牛球蟲的平均感染率為44.17%(856/1 938)，均高于我國已報道各地的奶牛球蟲病的調(diào)查結(jié)果。與倪曉婷等[16]的研究出現(xiàn)差異的原因可能與采集地區(qū)、奶牛場和樣本數(shù)量有關(guān)。這些調(diào)查報告結(jié)果進一步說明，奶牛球蟲病流行較普遍，以往長期添加抗球蟲藥，很大程度上掩蓋了球蟲病流行嚴重的事實，隨著國家限抗、禁抗政策的全面實施，尤其是離子載體抗生素在飼料中的禁用，使得奶牛球蟲的發(fā)病率出現(xiàn)激增現(xiàn)象，因此更加需要注意綜合防控。

本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，球蟲感染普遍存在于寧夏各個牛場，四地區(qū)的不同牛場球蟲感染率也存在差異，這與牛場的管理理念有很大關(guān)系，如斷奶犢牛的管理以及環(huán)境衛(wèi)生的要求等。其中1月齡以內(nèi)犢牛的優(yōu)勢蟲種為牛艾美耳球蟲，其致病性最強，對犢牛的危害也最嚴重。犢牛球蟲病的發(fā)病原因很多，斷奶應(yīng)激和轉(zhuǎn)群應(yīng)激都可能導(dǎo)致犢牛發(fā)病，其次就是犢牛飼養(yǎng)密度要合適，密度過大更易引起群體發(fā)病。本次通過對寧夏四地區(qū)的調(diào)查共發(fā)現(xiàn)12種艾美耳球蟲，其中牛艾美耳球蟲是寧夏部分地區(qū)的優(yōu)勢蟲種。不同月齡的奶牛所感染的球蟲種類也不一樣，倪曉婷等[16]發(fā)現(xiàn)1～3月齡犢牛主要感染柱狀艾美耳球蟲、奧博艾美耳球蟲和橢圓艾美耳球蟲。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)1～3月齡犢牛主要感染柱狀艾美耳球蟲、牛艾美耳球蟲和邱氏艾美耳球蟲。其中柱狀艾美耳球蟲的感染率最高，這與倪曉婷等[16]報道結(jié)果一致。在此次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，1～3月齡段的犢牛感染牛艾美耳球蟲和邱氏艾美耳球蟲的比例較高，這2種 艾美耳球蟲致病性最強，對犢牛危害最大。本調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，4～6月齡奶牛主要感染牛艾美耳球蟲和皮利他艾美耳球蟲，7～9月齡奶牛主要感染亞球形艾美耳球蟲和牛艾美耳球蟲，10～12月齡奶牛主要感染牛艾美耳球蟲和亞球形艾美耳球蟲，10～12月齡 奶牛球蟲感染率最高，為62.07%，但是感染強度最大的是2～3月齡的犢牛，其平均OPG為6 277.44。成年奶牛對球蟲具有較強的抵抗力，很少發(fā)病，一般呈隱性感染狀態(tài)，可排出卵囊污染環(huán)境。蔣業(yè)慧等[14]在新疆奎屯地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示，1～2歲奶牛球蟲的感染率最高，為39.72%，但2～3月齡犢牛的球蟲平均感染強度最大，OPG為14 456。 張寬寬等[13]在新疆的規(guī)模化奶牛場的調(diào)查結(jié)果顯示，7～12月齡奶牛的球蟲感染率最高，為48.8%，小于2月齡的犢牛的平均OPG最大，為2 667.1。 趙其平等[17]在上海地區(qū)奶牛球蟲的調(diào)查結(jié)果表明，0～2月齡犢牛的球蟲感染率最大，為61.9%。這些調(diào)查結(jié)果均與本調(diào)查結(jié)果一致。因此，對于規(guī)?；膛?，球蟲病主要危害1～3月齡犢牛，導(dǎo)致犢牛腹瀉、脫水、被毛粗糙，甚至導(dǎo)致犢牛出現(xiàn)血便以及死亡，大于1歲的奶牛球蟲感染率高，但感染強度低，大多都是球蟲攜帶者，已獲得自然免疫，但是奶牛會不斷排出卵囊，增加了牧場的環(huán)境污染。臨床型奶牛球蟲病的發(fā)生主要和艾美耳球蟲種類、攝入卵囊數(shù)量、感染奶牛月齡、繼發(fā)感染以及牛場管理措施等因素有密切關(guān)系。1～3月齡犢牛的球蟲感染率高，這與犢牛體質(zhì)有關(guān)，犢牛出生后免疫功能不健全，抗病能力較差，瘤胃發(fā)育不完全，容易引起發(fā)病，成年奶牛身體的各項機能發(fā)育較完善，抵抗力較強。

總之，準(zhǔn)確的診斷和流行病學(xué)調(diào)查是奶牛球蟲病綜合防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。奶牛養(yǎng)殖場必須加強飼養(yǎng)管理，注重環(huán)境衛(wèi)生；合理安排飼養(yǎng)密度，減少斷奶、轉(zhuǎn)群，分批進欄飼養(yǎng)；定期檢測，掌握抗球蟲藥持效期，綜合評估驅(qū)蟲效果。