海永慧 ， 欽 倩 ， 李蓓蓓 ， 任靜靜 ， 馬 勛 ， 蔣建軍 ， 王鵬雁

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 新疆 石河子 832003)

腸外致病性大腸桿菌(Extra-intestinal pathogenicEscherichiacoli，ExPEC)可通過其特有的毒力因子定殖腸道外的其他組織中，最終導(dǎo)致宿主發(fā)病[1]。ExPEC包括新生兒腦膜炎大腸桿菌(Neonatal meningitis causingEscherichiacoli，NMEC)、尿道致病性大腸桿菌(UropathogenicEscherichiacoli，UPEC)、敗血癥大腸桿菌(SepticemicEscherichiacoli,SEPEC)[2]和禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)[3]。近年來，新疆多個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)的犢牛出現(xiàn)了以神經(jīng)癥狀為主的病例，剖檢發(fā)現(xiàn)患牛腦膜嚴(yán)重出血，從腦組織中分離出來的病原菌經(jīng)鑒定為腸外致病性大腸桿菌，這給奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)帶來了經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也給牛源ExPEC的防控帶來了挑戰(zhàn)[4]。

目前用于ExPEC的疫苗主要以傳統(tǒng)滅活苗為主，但此類疫苗免疫保護(hù)效果相對(duì)比較局限，且副作用大，此外，可用于牛源致腦炎大腸桿菌的疫苗鮮有報(bào)道。多表位候選疫苗可克服傳統(tǒng)疫苗的缺點(diǎn)，能更高效地刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并消除針對(duì)不良表位的免疫應(yīng)答[5]。多表位疫苗可以刺激機(jī)體保守和有利的表位，產(chǎn)生免疫反應(yīng)，具有更高安全性，還可以通過抗原表位的工程設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)來提高疫苗的廣度和效力[6]。

牛源致腦炎大腸桿菌S9922分離自新疆某奶牛場(chǎng)患病犢牛腦組織中，本課題組前期已對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序并將E.coliS9922全基因組序列分別與GenBank上公布的56個(gè)具有全基因組序列的大腸桿菌進(jìn)行比較分析，得到了69個(gè)E.coliS9922特有毒力基因，因此本試驗(yàn)從中選取了與黏附有關(guān)的FimD和PilN兩個(gè)菌毛蛋白，利用生物信息學(xué)工具分析其蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位，為牛源致腦炎大腸桿菌多表位疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 牛源致腦炎大腸桿菌S9922分離自新疆某奶牛場(chǎng)患病犢牛腦組織中，并已被鑒定為腸外致病性大腸桿菌，由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。將S9922進(jìn)行全基因組測(cè)序并進(jìn)行比較基因組學(xué)研究，篩選到與細(xì)菌致病有關(guān)的特異性黏附蛋白FimD、PilN等。

1.2 方法

1.2.1 蛋白的理化性質(zhì)分析 運(yùn)用在線服務(wù)器ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)，分析FimD、PilN蛋白的氨基酸組成、分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、原子組成、不穩(wěn)定指數(shù)和平均親水系數(shù)等理化性質(zhì)。

1.2.2 蛋白跨膜區(qū)、信號(hào)肽、糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)分析 運(yùn)用在線服務(wù)器TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、SignalP-5.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、NetNGlyc1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)，分別分析FimD、PilN蛋白氨基酸序列的跨膜區(qū)、信號(hào)肽區(qū)域、糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)。

1.2.3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 利用SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白的β轉(zhuǎn)角、β折疊、α螺旋、無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)。同時(shí)用DNASTAR軟件中的Protean板塊分析蛋白抗原性、親水性、柔韌性、表面可及性較好的肽段。

1.2.4 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 將FimD、PilN蛋白的氨基酸序列提交至在線服務(wù)器SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)，F(xiàn)imD蛋白選取3rfz.1.B作為模板，PilN蛋白選取3ezj.1.A作為模板，構(gòu)建FimD、PilN蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.2.5 蛋白優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 利用BepiPred(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred)、Immunomedicine Group(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)對(duì)FimD、PilN蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。綜合DNASTAR軟件中的Protean板塊的抗原性、柔韌性、親水性和表面可及性以及信號(hào)肽、跨膜區(qū)、二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)FimD、PilN蛋白的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 FimD、PilN蛋白的理化性質(zhì)分析 FimD蛋白由382個(gè)氨基酸組成，其中含量較多的氨基酸：Gly占10.7%，共有41個(gè)；Ser占10.2%，共有39個(gè)；Asn占9.4%，共有36個(gè)；Thr占8.1%，共有31個(gè)；Leu占7.1%，共有27個(gè)；帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)總數(shù)為28，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數(shù)為25，理論等電點(diǎn)為6.16。FimD蛋白的原子組成為C1828H2798N510O588S9，相對(duì)分子質(zhì)量為41 615.93 Da，不穩(wěn)定系數(shù)為28.31，小于閾值40，歸類為穩(wěn)定蛋白。平均親水系數(shù)(GRAVY)為-0.435，GRAVY的范圍為-2～2，負(fù)值表明蛋白為親水蛋白，F(xiàn)imD蛋白歸類為親水蛋白。

PilN蛋白由560個(gè)氨基酸組成，其中含量較多的氨基酸：Thr占12.7%，共有71個(gè)；Ser占11.1%，共有62個(gè)；Leu占9.1%，共有51個(gè)；Ala占7.7%，共有43個(gè)；Gly占7.5%，共有42個(gè)；帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)總數(shù)為43，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數(shù)為44，理論等電點(diǎn)為7.61。PilN蛋白的原子組成為C2586H4184N724O858S22。相對(duì)分子質(zhì)量為59 851.32 Da，不穩(wěn)定系數(shù)為36.5，小于閾值40，歸類為穩(wěn)定蛋白。GRAVY為-0.274，GRAVY的范圍為-2～2，負(fù)值表明蛋白為親水蛋白，F(xiàn)imD蛋白歸類為親水蛋白。

2.2 FimD、PilN蛋白的跨膜區(qū)、信號(hào)肽、糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)分析 利用在線服務(wù)器TMHMM分析FimD蛋白和PilN蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)imD蛋白不存在跨膜區(qū)，PilN蛋白在1～50位氨基酸上可能出現(xiàn)跨膜區(qū)。利用在線服務(wù)器SignalP-5.0 分析FimD蛋白和PilN蛋白的信號(hào)肽，結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)imD蛋白不存在信號(hào)肽；PilN蛋白在26～27位氨基酸上出現(xiàn)信號(hào)肽。

圖2 蛋白信號(hào)肽分析

利用在線服務(wù)器NetNGlyc1.0進(jìn)行蛋白糖基化位點(diǎn)分析，F(xiàn)imD蛋白共有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，PilN蛋白共有2個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。利用在線服務(wù)器NetPhos 3.1進(jìn)行蛋白磷酸化位點(diǎn)分析，分析結(jié)果如彩版封二圖3所示，F(xiàn)imD蛋白共有潛在的48個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中有23個(gè)Ser位點(diǎn)，15個(gè)Thr位點(diǎn)，10個(gè) Tyr位點(diǎn)；PilN蛋白共有85個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中有47個(gè)Ser位點(diǎn)，33個(gè)Thr位點(diǎn)，5個(gè)Tyr位點(diǎn)。

圖3 磷酸化位點(diǎn)分析

2.3 FimD、PilN蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 利用在線服務(wù)器SOPMA對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，F(xiàn)imD蛋白結(jié)果如彩版封二圖4所示，α螺旋占6.54%，延伸鏈占32.94%，β轉(zhuǎn)角占5.50%，無規(guī)則卷曲占56.02%；PilN蛋白結(jié)果如彩版封三圖5所示，α螺旋占23.75%，延伸鏈占20.54%，β轉(zhuǎn)角占4.29%，無規(guī)則卷曲占51.43%。

圖4 FimD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 PilN蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用DNASTAR軟件中的Protean板塊分析蛋白抗原性、親水性、柔韌性、表面可及性的結(jié)果如彩版封三圖6所示，綜合分析得出親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性都較好的肽段(表1)。

圖6 DNASTAR軟件預(yù)測(cè)蛋白親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性

表1 FimD、PilN蛋白親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性都較好的肽段預(yù)測(cè)

2.4 FimD、PilN蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 利用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，同源建模也可稱比較建模，是利用已知的同源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)建立目的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型。FimD蛋白、PilN蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖7所示，F(xiàn)imD蛋白選取3rfz.1.B作為模板，全局模型質(zhì)量評(píng)估(GMQE)結(jié)果為0.78,QMEAN為-2.01,相似性為56.81%；PilN蛋白選取3ezj.1.A作為模板，GMQE結(jié)果為0.10,QMEAN為-4.44,相似性為12.78%，所有圖中都存在α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果相符合。

圖7 FimD蛋白、PilN蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5 FimD、PilN蛋白的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 采用BepiPred預(yù)測(cè)的蛋白B細(xì)胞表位結(jié)果如表2所示，Immunomedicine Group預(yù)測(cè)的蛋白B細(xì)胞表位結(jié)果如表3所示。參照高瞻等[7]的方法進(jìn)行最終的蛋白優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)，由于表位大多出現(xiàn)在表面可及性、抗原性、柔韌性、親水性都較好的肽段，并且目前預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位的在線工具都未達(dá)到百分之百的準(zhǔn)確率，因此需要選取用BepiPred預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位結(jié)果和用Immunomedicine Group預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位結(jié)果的共同部分，并綜合DNASTAR軟件、SOPMA分析的結(jié)果，選出表面可及性、抗原性、柔韌性、親水性都較好并且沒有α螺旋的肽段，預(yù)測(cè)出最終的蛋白優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位。最終預(yù)測(cè)出FimD蛋白潛在的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位為：7～18、144～152、307～315、365～373；PilN蛋白潛在的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位為：77～86、138～149、516～524。

表2 BepiPred方法預(yù)測(cè)蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置

表3 Immunomedicine Group方法預(yù)測(cè)蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置

3 討論

大腸肝菌(Escherichiacoli,E.coli)引起的腦膜炎是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，包括從腸黏膜的定植到進(jìn)入血液循環(huán)并形成高水平的菌血癥，然后進(jìn)一步穿過血腦屏障，進(jìn)入腦脊液最終引起腦膜炎[8]。黏附是NMEC致病機(jī)理中的第一步，也是穿越血腦屏障的重要一步。E.coli對(duì)構(gòu)成血腦屏障的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附被認(rèn)為是其侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要因素[9]。菌毛與E.coli的黏附、定植和致病都有著非常密切的關(guān)系[10]，F(xiàn)imD和PilN都屬于菌毛的亞單位蛋白，在菌毛的組裝中起著重要的作用[11-12]。

表位是蛋白抗原性的基礎(chǔ),而且與機(jī)體的固有免疫、獲得性免疫等密切相關(guān)，表位的研究對(duì)于疾病的診斷和分子疫苗的設(shè)計(jì)有至關(guān)重要的意義[13]。隨著生物信息學(xué)研究領(lǐng)域的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，生物信息學(xué)被廣泛地應(yīng)用[14]，目前，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行生物信息學(xué)技術(shù)分析已經(jīng)成為大多表位和疫苗研究的首選方法[15]，與傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法相比，生物信息學(xué)技術(shù)使蛋白結(jié)構(gòu)分析和表位的預(yù)測(cè)更加準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便[16]。表位大多出現(xiàn)在蛋白表面可及性強(qiáng)、柔韌性好、親水性和抗原指數(shù)高的肽段[17]，以及結(jié)構(gòu)較松散，易扭曲、盤旋并展示在蛋白表面的β轉(zhuǎn) 角及無規(guī)則卷曲和該蛋白的膜外區(qū)域，從而有利于抗體結(jié)合[18]。

本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法綜合分析FimD和PilN表面可及性、柔韌性、蛋白親水性、抗原指數(shù)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等參數(shù)來預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位。結(jié)果顯示，F(xiàn)imD和PilN蛋白的膜外區(qū)域占較高比例，因此可能被抗原遞呈細(xì)胞接觸并引發(fā)免疫應(yīng)答。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)imD蛋白的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲占61.52%，PilN蛋白的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲占55.72%，2個(gè)蛋白的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲所占比例之和大于50%。BepiPred-2.0基于隨機(jī)森林算法提供了最先進(jìn)的基于B細(xì)胞表位序列的預(yù)測(cè)[19]，與其他可用工具相比，該表位被認(rèn)為具有更高的質(zhì)量，并且確實(shí)顯著提高了預(yù)測(cè)能力[20]。Immunomedicine Group使用Kolaskar和Tongaonkar的方法預(yù)測(cè)表位，只有當(dāng)最小氨基酸殘基大小為8個(gè)時(shí)才被報(bào)告，該方法的準(zhǔn)確性約為75%[21]。IEDB為科學(xué)界提供了表位數(shù)據(jù)的開放訪問，以及表位預(yù)測(cè)和分析工具，收集了最廣泛的試驗(yàn)驗(yàn)證的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位數(shù)據(jù)[22]。分別使用在線預(yù)測(cè)工具BepiPred和Immunomedicine Group預(yù)測(cè)出FimD蛋白具有11個(gè)和14個(gè)B細(xì)胞表位肽段，PilN蛋白具有12個(gè)和23個(gè)B細(xì)胞表位肽段?，F(xiàn)已有的預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位的在線工具均未達(dá)到百分之百的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)選取除去信號(hào)肽和跨膜區(qū)后的肽段，綜合分析FimD、PilN蛋白在不同在線預(yù)測(cè)工具得出的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果以及DNASTAR軟件分析得出的2個(gè)蛋白表面可及性、柔韌性、抗原性、親水性較好的肽段，選取共同部分最終確定潛在的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位。綜上所述，F(xiàn)imD、PilN蛋白具有很多潛在的抗原表位，推測(cè)這2個(gè)蛋白具有良好的免疫原性，但還需要在后期的試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。本試驗(yàn)預(yù)測(cè)篩選得到的FimD、PilN蛋白潛在表位可為牛源致腦炎大腸桿菌多表位疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。