梁海丹， 楊 慧， 李 倩， 秦曉玥， 李穗敏， 陳淑貞，鄺素娟， 饒 芳， 鄧春玉△

（1華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；2廣東省心血管病研究所臨床藥理重點實驗室，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080）

房顫（atrial fibrillation，AF）是臨床上常見的持續(xù)性心律失常，AF 發(fā)生的機制主要是心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，其中結(jié)構(gòu)重構(gòu)主要表現(xiàn)為膠原過量沉積和纖維化增加，這改變了心肌原有的電生理特性，使心房傳導(dǎo)異常，引起心房環(huán)路折返，最終導(dǎo)致房顫的發(fā)生［1］。高血壓是AF 的獨立危險因素，其可以通過左心室肥厚、左心房增大和激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，導(dǎo)致心房的結(jié)構(gòu)和電重構(gòu)，促使AF 的發(fā)生［2］。雖然控制血壓可以減少AF 發(fā)生，但高血壓相關(guān)心房纖維化的分子機制尚未完全闡明。

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，幾乎參與了機體所有的生理功能。鈣池操縱性鈣內(nèi)流（store-operated calcium entry，SOCE）是非興奮性細(xì)胞Ca2+進入的重要機制，維持胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)；基質(zhì)相互作用分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）和Orai1 是鈣池操縱性鈣通道（store-operated calcium channel，SOC）的兩個重要分子基礎(chǔ)［3］。研究顯示，心衰患者心臟纖維化過度，人心室成纖維細(xì)胞的膠原分泌能力增強，與Orai1 表達增強和SOCE 介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流增加有關(guān)［4］。在成年大鼠心臟成纖維細(xì)胞中，血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）通過上調(diào)Orai1 和STIM1 表達，促進STIM1 與Orai1 相互作用，胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增加，進而誘發(fā)心肌纖維化［5］。以上結(jié)果提示SOC通道與心肌纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。此外，SOC通道還參與高血壓所致的心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。研究顯示，在敲除Orai1小鼠心肌細(xì)胞中，Ang II誘導(dǎo)的心肌肥厚的程度比正常小鼠低［6］；敲減小鼠心肌細(xì)胞的STIM1則可降低壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚，并可逆轉(zhuǎn)肥厚的心肌細(xì)胞，減慢心力衰竭的進程［7］。同時，在體外再狹窄和高血壓動物模型中，STIM1 和Orai1 介導(dǎo)的SOCE 能驅(qū)動活化T 細(xì)胞核因子轉(zhuǎn)錄因子，促進血管重構(gòu)［8-9］。但SOC 在高血壓導(dǎo)致心房纖維化中的作用尚未見報道。因此，本項工作從高血壓動物及細(xì)胞水平，探討Orai1 通道在高血壓誘導(dǎo)的心房纖維化中的作用及機制。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）13 只，Wistar 大鼠16只，45～46 周齡，500～600 g，購自北京維通利華，生產(chǎn)許可號為SCXK（京）2016-0006，質(zhì)量檢測單位為中山大學(xué)實驗動物中心。1～3 d 的SD 乳大鼠，雌雄不限，SPF級，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2016-0041，質(zhì)量檢測單位為廣東省實驗動物檢測所。

1.2 試劑 澳洲胎牛血清和0.25%胰酶（Gibco）；I型膠原蛋白（collagen type I，Col1）抗體、III 型膠原蛋白（collagen type III，Col3）抗體和環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）均購自Abcam；基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）抗體和MMP9 抗體（Millipore）；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）抗體和活化T 細(xì)胞核因子3（nuclear factor of activated T cells 3，NFAT3）抗體（Cell Signaling Technology）；Orai1 抗體和GAPDH 抗體（Proteintech）；Fluo4 AM 熒光探針（Invitrogen）；毒胡蘿卜素（tharpsigargin，TG）和硝苯地平（Sigma）；Ad-Orai1 病毒及其陰性對照病毒（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司）。

無鈣臺式液配方（mmol/L）：NaCl 136.00，KC1 5.40，NaH2PO40.33，MgCl6·2H2O 1.00，glucose 10.00，HEPES 10.00，以NaOH調(diào)整至pH 7.4。

1.3 儀器 Allegrax-64X 高速冷凍離心機（Beckman Coutler）；ImageQuant LAS500超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀（GE）；SP5-FCS 激光共聚焦顯微鏡（Leica）；iWorx 數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)和8 級心電導(dǎo)管（1.6F）（iWorx Systems）；小動物溫控加熱墊（RDW Life Science）。

2 方法

2.1 大鼠心房快速起搏 將大鼠稱重，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉后，將其采用仰臥位固定在恒溫（37±1）℃的加熱墊上。備皮，用碘酒局部消毒，將鉑金針刺電極連接到大鼠的四肢，記錄心電圖后在右側(cè)頸靜脈作小切口置入鞘管，沿鞘管送入電極導(dǎo)管至右心房。待記錄到腔內(nèi)心電圖后，進行快速起搏心內(nèi)膜，測定起搏閾值和采用心房Burst刺激（短猝電刺激）模式記錄AF 的誘發(fā)情況，AF 持續(xù)時間和竇房結(jié)恢復(fù)時間（sinus node recovery time，SNRT）等。以P 波消失、f 波出現(xiàn)為AF 發(fā)生標(biāo)志；竇性心律恢復(fù)、P 波復(fù)現(xiàn)、f 波消失為AF 終止標(biāo)志，AF持續(xù)時間為AF發(fā)生至終止所持續(xù)的時間［10］。

2.2 HE 染色和Masson 染色 取Wistar 大鼠或SHR 心房組織，用4%甲醛固定，石蠟包埋。將石蠟包埋的心房組織切成4 μm 切片，脫蠟，復(fù)水，水洗，然后分別進行HE 和Masson 染色，最后使用中性樹膠封片。在相同參數(shù)相同的情況下，用400 倍的光學(xué)顯微鏡觀察心肌形態(tài)及心肌纖維膠原的改變。

2.3 原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 1～3 d 的SD 乳鼠，置于75%乙醇中浸泡消毒后，在無菌超凈工作臺中取出心臟，剪碎，用1%胰蛋白酶和1%II 型膠原酶混合液消化，離心后接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，根據(jù)貼壁時間不同來分離心肌成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞，1.5 h 前貼壁的是心肌成纖維細(xì)胞，用含雙抗和10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。每48 h 換液1 次。當(dāng)細(xì)胞密度長到60%時，可對細(xì)胞進行加藥處理。

2.4 Orai1 過表達腺病毒感染 原代心肌成纖維細(xì)胞接種在6孔板中，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞密度為60%～70%時，吸除舊培養(yǎng)液，加入含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液1 mL。（1）分別加入100 感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）陰性對照病毒（negative control virus，Neg）和3 個不同MOI（25、50和100 MOI）的Ad-Orai1［10］；（2）設(shè)置空白對照（control）組、Neg 組、Ad-Orai1（100 MOI）組、Ad-Orai1+CsA 組（于100 MOI Ad-Orai1 轉(zhuǎn)染前加入10 μmol/L CsA），48 h后提取蛋白用于后續(xù)實驗。

2.5 Western blot 將離心機調(diào)至4 ℃預(yù)冷，按1 mL裂解液加入10 μL 100×蛋白酶抑制劑配裂解液，混勻后置冰上。細(xì)胞或剪碎研磨的組織置于EP 管中，加入適量的裂解液，然后置于冰上裂解30 min，4 ℃，13 500×g離心15 min。上清即為總蛋白，將上清分裝轉(zhuǎn)移至新的EP 管。BCA 法測定蛋白濃度，20 μg 樣本用4×loading buffer（TaKaRa）稀釋，55 ℃或100 ℃加熱10 min，將蛋白變性。10% SDS-PAGE 分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉-TBST 將膜封閉1 h，加入相應(yīng)的Ⅰ抗Col1（1∶1 000）、Col3（1∶1 000）、MMP2（1∶2 000）、MMP9（1∶1 000）、Orai1（1∶1000）、CaN（1∶1 000）、NFAT3（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000），放置于4 ℃搖床上孵育過夜。用TBST 洗膜3 次，每次5 min，然后放置于4 ℃搖床上孵育Ⅱ抗45 min 左右（Ⅱ抗用5%脫脂奶粉-TBST 稀釋，比例為1∶5 000）。TBST 洗3 次，每次5 min。ECL 試劑盒顯影蛋白條帶，ImageJ 圖像分析軟件測定目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶的灰度值，計算兩者間的比值進行統(tǒng)計分析。

2.6 鈣離子濃度測定 大鼠心肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)48 h 后，傳代接種于共聚焦皿中，接種密度為40%～50%，培養(yǎng)24 h 后加入Orai1 過表達腺病毒100 MOI，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，PBS 輕洗2 次，吸掉PBS 加入1 mL 無FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)液，加入3 μL 濃度為5 μmol/L 的Fluo-4 AM 染料，避光放入37 ℃培養(yǎng)箱負(fù)載20 min；用無鈣臺式液清洗1 遍，然后在含有1 μmol/L 硝苯地平的無鈣臺氏液中，加入2 μmol/L 毒胡蘿卜素耗竭鈣池，進而激活SOC，隨后加入2 mmol/L CaCl2，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光值的變化。記錄每個細(xì)胞的基線值（F0）和熒光強度峰值（F1），將峰值除去基線值即代表胞內(nèi)鈣離子濃度的變化［5］。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

GraphPad Prism 7.0.4 和ImageJ 軟 件 分 析 數(shù) 據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。Wistar組與SHR組兩組間均數(shù)比較采用t檢驗；單因素多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 自發(fā)性高血壓大鼠房顫易感性增加

在體電生理檢測結(jié)果顯示，SHR 組比Wistar 組的AF誘發(fā)率顯著升高（P＜0.05）。SHR 組的AF持續(xù)時間、SNRT、P 波時限和PR 間期均顯著延長（P＜0.05）。同時，竇房結(jié)恢復(fù)時間和矯正的竇房結(jié)恢復(fù)時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。以上結(jié)果表明，與Wistar大鼠相比，SHR大鼠有更高的房顫易感性。

2 高血壓大鼠心房組織纖維化顯著增加

大鼠心房組織HE 染色結(jié)果顯示，Wistar 組心房肌細(xì)胞形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊，SHR 組可見細(xì)胞間質(zhì)增寬，細(xì)胞肥大，部分心肌纖維出現(xiàn)斷裂變性，纖維化程度加重。Masson 染色結(jié)果顯示，Wistar組心房肌細(xì)胞排列整齊，形狀基本一致，SHR 組可見大片藍(lán)色融合狀壞死灶內(nèi)膠原纖維，見圖2A。

同時，利用Western blot 檢測兩組大鼠心房組織纖維化相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示，與Wistar 大鼠相比，SHR 組MMP2、MMP9、Col1 和Col3 的表達均顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖2B、C。

Figure 1. Representative electrophysiology results of rapid atrial pacing Wistar rats and SHR rats. A：typical baseline surface electrocardiogram（ECG）and intra atrial electrocardiogram（IAEG）；B：typical sinus electrocardiogram nodal recovery time（SNRT）；C：typical surface ECG records of rats maintaining sinus rhythm after atrial explosive pacing；D：incidence of atrial fibrillation in Wistar group and SHR group；E：typical surface ECG records of AF rats can automatically restore sinus rhythm；F：typical disordered atrial wave（F wave）. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs Wistar group.圖1 Wistar大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠心房快速起搏的代表性電生理結(jié)果

3 高血壓大鼠心房組織中Orai1 鈣信號通路相關(guān)蛋白表達上調(diào)

利用Western blot 檢測Orai1 鈣信號通路相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，與Wistar 組大鼠相比，SHR 組心房組織中Orai1 蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）；同時，calcineurin 和NFAT3 蛋白表達也顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖3。

4 Orai1過表達促進大鼠心肌成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)因子的表達

Figure 2. Atrial fibrosis was increased in SHR. A：HE staining and Masson staining showed atrial myocyte disorder and collagen（blue color）increase in SHR，and the degree of fibrosis was more serious than that of Wistar rats（scale bar=50 μm）；B：representative Western blots of MMP9，MMP2，Col1 and Col3 proteins in atrial tissues of Wistar rats and SHR；C：densitometric analysis of MMP9，MMP2，Col1 and Col3 proteins in atrial tissues of Wistar rats and SHR. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Wistar group.圖2 自發(fā)性高血壓大鼠心房纖維化程度增高

Figure 3. Upregulation of Orai1/CaN/NFAT3 expression in atrial tissues of SHR. Mean±SEM. n=6.**P＜0.01 vs Wistar group.圖3 自發(fā)性高血壓大鼠心房組織中Orai1/CaN/NFAT表達上調(diào)

為了進一步驗證Orai1 通道與心房纖維化之間的關(guān)系，我們利用腺病毒在原代心肌成纖維細(xì)胞中過表達Orai1，Western blot 結(jié)果顯示，隨著Orai1 病毒感染量的增加，纖維化相關(guān)蛋白MMP2、MMP9、Col1和Col3 的表達都顯著上調(diào)（P＜0.05），且濃度為100 MOI 的Ad-Orai1 過表達效果較好，因此在后續(xù)的實驗中我們均采用這一濃度，見圖4。

Figure 4. Orai1 overexpression increased the expression of fibrosis-related factors in rat cardiac fibroblasts. The protein levels of Orai1，MMP2/MMP9 and Col1/Col3 before and after treated with adenovirus Orai1 of different concentrations（25，50 and 100 MOI）in CFs. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Neg group.圖4 Orai1過表達增加了大鼠心臟成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)因子的表達

5 Orai1過表達使大鼠心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流增加

采用Fluo-4 AM 染料負(fù)載心肌成纖維細(xì)胞，用激光共聚焦顯微鏡檢測CFs 中鈣離子濃度變化。其結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，Orai1過表達組SOC通道介導(dǎo)的Ca2+熒光強度顯著增加（P＜0.01）。

6 CsA抑制過表達Orai1誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞纖維化

為了進一步明確CaN/NFAT3信號通路對過表達Orai1導(dǎo)致心房纖維化的影響，用10 μmol/L CsA在過表達Orai1 條件下處理CFs 48 h，結(jié)果如圖6 所示，與Ad-Orai1 組相比，Ad-Orai1+CsA 組的纖維化相關(guān)因子表達均顯著下調(diào)（P＜0.01）。

討論

通過本研究，我們觀察到高血壓大鼠心房組織纖維化及AF 誘發(fā)率顯著增加。Orai1/CaN/NFAT3 信號通路在高血壓大鼠心房組織中上調(diào)，可促進心房成纖維細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，上調(diào)纖維化因子的表達。而阻斷CaN/NFAT3信號通路，可抑制過表達Orai1誘導(dǎo)的CFs纖維化因子的表達。提示高血壓大鼠心房Orai1通道上調(diào)，增加胞內(nèi)Ca2+濃度，調(diào)控CaN/NFAT3 信號通路，促進心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，參與房顫的發(fā)生。

Figure 5. Orai1 overexpression promoted Ca2+ entry in cardiac fibroblasts. A：the change curve of intracellular Ca2+ concentration measured by laser confocal microscopy after the adenovirus Orai1（100 MOI）-treated CFs was loaded by Fluo-4 AM；B：the changes of intracellular Ca2+ concentration in adenovirus Orai1-treated CFs stimulated by CaCl2 were analyzed. Mean±SEM. n=50.**P＜0.01 vs control group.圖5 Orai1過表達促進心肌成纖維細(xì)胞Ca2+的內(nèi)流

高血壓是房顫發(fā)生的獨立危險因素，雖然目前關(guān)于高血壓增加房顫易感性的研究已有相關(guān)報道，但其相關(guān)機制尚未得到很好闡明。有研究認(rèn)為高血壓時左房增大，心房纖維化和左房壓力升高是房性心律失常發(fā)生率增加的重要原因［11］。在羊的高血壓模型中也證實了房顫易感性增加與高血壓所致心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)有關(guān)［12］。本研究通過頸靜脈快速起搏心房觀察到自發(fā)性高血壓大鼠的AF 誘發(fā)率較對照Wistar 大鼠顯著升高。由此進一步證實了高血壓可能是房顫易感性增加的重要因素。

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，廣泛參與增殖、凋亡、分化等重要的病理生理過程。有研究表明在自發(fā)性高血壓大鼠中，高血壓在代償性左室肥厚期間誘導(dǎo)早期左房肌細(xì)胞Ca2+重構(gòu)，隨著刺激頻率的增加，SHR心房肌細(xì)胞更容易發(fā)生致心律失常的Ca2+交替變化，提示心房的Ca2+穩(wěn)態(tài)是高血壓與房顫之間潛在的機制聯(lián)系［13］。Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡參與高血壓誘導(dǎo)的房顫主要表現(xiàn)為對心房電重塑的影響，如減少L 型鈣通道及雷諾丁受體表達，抑制Na+/Ca2+交換體活性等。然而，Ca2+穩(wěn)態(tài)在高血壓所致心房纖維化中的作用尚不十分清楚。SOC 通道作為非興奮性細(xì)胞Ca2+進入的主要途徑之一，Orai1 及STIM1 是該通道的兩個主要參與者，在心肌成纖維細(xì)胞中廣泛表達。既往研究顯示，SOC 通道參與高血壓所致的心肌肥厚［14］及血管收縮障礙［15］。此外，SOC 通道在纖維化中也起著重要作用。在成年大鼠心臟成纖維細(xì)胞中，Ang II可以激活SOCE，通過鈣信號介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過表達、心肌成纖維細(xì)胞的分化和成纖維細(xì)胞因子的增加，參與心臟纖維化的進程［5］。在大鼠腎損傷模型中Orai1 可以誘導(dǎo)腎T 細(xì)胞活化，而抑制SOCE 通道能減輕免疫細(xì)胞介導(dǎo)的腎纖維化［16］。同樣的，在培養(yǎng)的人近端小管上皮細(xì)胞中，敲減Orai1 通道可以通過抑制TGF-β/smad 通路誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化來減緩小鼠腎纖維化的進展［17］。與上述結(jié)果一致，本研究中我們觀察到，在高血壓大鼠心房組織中Orai1 通道表達上調(diào)，同時伴隨纖維化相關(guān)因子Col1/Col3 和MMP2/MMP9 的增加。而Orai1 過表達可促進心肌成纖維細(xì)胞Ca2+內(nèi)流增加及纖維化相關(guān)因子表達。以上結(jié)果提示了高血壓可能通過Orai1通道增加胞內(nèi)Ca2+濃度進而促進大鼠心房纖維化的發(fā)生。

CaN 是一種Ca2+依賴的蛋白磷酸酶，在心臟重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用［18］。NFAT 作為CaN 的下游靶點，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時被胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活CaN，使NFAT 去磷酸化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控［18］。有研究表明，過表達Orai1 或過表達STIM1 通過激活CaN/NFAT 信號通路導(dǎo)致心肌肥厚［19］。同樣的，基因沉默Orai1或STIM1可以通過抑制CaN/NFAT 信號通路來保護壓力超負(fù)荷大鼠的心臟［20］。CaN/NFAT 通路也介導(dǎo)了苯腎上腺素誘導(dǎo)新生大鼠CFs 的增殖和增加膠原蛋白的產(chǎn)生［21］。我們的研究結(jié)果也顯示，SHR 大鼠心房組織CaN 與NFAT3 蛋白明顯上調(diào)，而CaN 抑制劑CsA 可減輕過表達Orai1 誘導(dǎo)的CFs 纖維化相關(guān)因子的表達。因此我們認(rèn)為，Orai1 通道參與高血壓誘導(dǎo)的大鼠心房纖維化及房顫易感性增加，可能與激活CaN/NFAT3信號通路有關(guān)。

Figure 6. CsA inhibited Orai1 overexpression-induced cardiac fibrosis. In the case of overexpression of Orai1，the expression of fibrosis related proteins Col1/Col3 and MMP2/MMP9 in CFs were detected after CsA（10 μmol/L）intervention by Western blot.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Neg group；##P＜0.01 vs Ad-Orail1 group.圖6 CsA抑制Orai1過表達誘導(dǎo)的心肌纖維化

綜上所述，本研究初步證實了大鼠患高血壓可能會通過激活Orai1通道介導(dǎo)的SOCE，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，從而激活CaN，進一步使NFAT3 核易位，最終促進心肌組織纖維化相關(guān)因子的分泌，增加心房纖維化。