劉雙雙，袁杰，秦榜勇

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院疼痛科，貴州 遵義 563000)

慢性疼痛是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，影響患者的生活質量，并導致重大的社會經(jīng)濟負擔。慢性疼痛通?？煞譃槁园┌Y相關疼痛和慢性非癌癥相關疼痛，如慢性神經(jīng)性疼痛和慢性手術后或創(chuàng)傷后疼痛[1]。盡管許多研究闡明了慢性疼痛發(fā)展的潛在機制，但目前只有少數(shù)臨床藥物能有效緩解患者的疼痛癥狀，且有一定的不良反應。因此，探索治療慢性疼痛的新靶點勢在必行。

先前的研究表明，疼痛尤其是神經(jīng)病理性疼痛潛在的病理生理學包括外周和中樞敏化[2]。結構變化、許多細胞間相互作用和分子信號傳遞是傷害感受途徑敏感化的基礎。另外，還包括離子通道的改變、免疫細胞的激活、神經(jīng)膠質源性介質和表觀遺傳調節(jié)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)分布于疼痛調節(jié)的關鍵部位，并且其多種亞型參與疼痛的調節(jié)，在慢性疼痛的發(fā)展中還具有調節(jié)神經(jīng)免疫的作用[4-5]。外周損傷部位和中樞神經(jīng)系統(tǒng)PKC通過多途徑調節(jié)中性粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞的功能，介導施萬細胞和神經(jīng)元活性調節(jié)，參與中樞小膠質細胞和星形膠質細胞的炎癥反應，在神經(jīng)元和非神經(jīng)元之間疼痛的信息傳遞中起重要作用?，F(xiàn)就PKC調節(jié)疼痛的神經(jīng)免疫細胞機制進行綜述，以為疼痛的治療提供新見解。

1 PKC的概述

PKC是一種廣泛分布在哺乳動物真核細胞的鈣/磷依賴性蛋白激酶，哺乳動物中至少存在10個不同的基因，編碼不同的PKC亞型。目前已知的PKC分為3種亞型：經(jīng)典型PKC(α、βⅠ、βⅡ、γ)，對鈣和二酰甘油依賴；新型PKC(δ、ε、η、θ)，對鈣不依賴但對二酰甘油依賴；非經(jīng)典型PKC(ζ和ι/λ)，對鈣和二酰甘油不依賴。多種胞外信息分子與它們各自的受體結合時會激活磷脂酶C家族的成員，隨后膜相關磷脂酶C的激活導致質膜上4，5-酯酰肌醇二磷酸水解成1，4，5-肌醇三磷酸和二酰甘油，肌醇三磷酸反過來觸發(fā)內(nèi)質網(wǎng)中鈣的釋放，導致細胞溶質鈣濃度升高。二酰甘油和鈣水平的升高導致PKC的激活并使其從細胞溶質到質膜以及到其他亞細胞位置，PKC對調節(jié)多種神經(jīng)元功能尤為重要，對許多參與傷害感受的離子通道具有致敏作用[6]。PKC在靜息狀態(tài)下以無活性形式存在于胞質中，激活后轉位于細胞膜，通過磷酸化作用，在信號轉導過程中充當?shù)诙攀埂Ａ姿峄腜KC降低內(nèi)質網(wǎng)Ca2+-ATPase的功能，抑制Ca2+進入內(nèi)質網(wǎng)。同時，磷酸化的PKC激活肌醇三磷酸受體，允許Ca2+流出內(nèi)質網(wǎng)，導致內(nèi)質網(wǎng)鈣離子濃度下調，然而鈣通道開放引起Ca2+的流入和胞質內(nèi)Ca2+的上調。細胞內(nèi)Ca2+上調可進一步激活初級感覺神經(jīng)元瞬時受體電位通道蛋白(transient receptor potential channel protein，TRP)A1、TRPV1等受體，導致外周致敏的形成[7]。

蛋白質磷酸化構成了疼痛信號通路中重要的轉錄后調節(jié)機制，目前認為PKC主要與慢性疼痛的細胞磷酸化和信號轉導機制有關[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性偏頭痛大鼠模型中，PKC促進N-甲基-D-天冬氨酸-2B受體蛋白磷酸化，參與代謝型谷氨酸受體5對突觸可塑性的調節(jié)，導致疼痛的中樞敏化[9]。此外，PKC在正常大鼠和神經(jīng)病理性疼痛大鼠杏仁核的傷害性調節(jié)中起重要作用，杏仁核內(nèi)注射PKC抑制劑抑制了甘丙肽誘導的抗傷害感受，進一步研究發(fā)現(xiàn)杏仁核PKC不僅參與調節(jié)疼痛，也調節(jié)壓力和情緒[10]。在外周神經(jīng)系統(tǒng)，PKC是TRPV1的激活和脫敏的關鍵調節(jié)因子[11]，TRPV1在調節(jié)慢性疼痛及免疫細胞活化和細胞因子產(chǎn)生方面發(fā)揮重要作用[12]。研究表明，多種PKC亞型的激活與持續(xù)疼痛條件下外周和(或)中樞敏化等有關，Sweitzer等[13]研究發(fā)現(xiàn)PKCγ和PKCε參與甲醛誘導的傷害感受，Bhatt等[14]證明PKCδ抑制劑可減弱肽聚糖誘導的誘導型一氧化氮合酶表達和一氧化氮釋放。大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)PKCα和PKCε通過磷酸化參與完全弗氏佐劑誘導的炎癥，PKCε參與前列腺素E2對疼痛的調節(jié)作用，PKCα還在嘌呤能受體P2X3介導的炎癥后痛覺過敏中起重要作用[15-16]。關于PKC在疼痛中的研究逐漸增多，需進一步研究和探討其在疼痛中的神經(jīng)免疫調節(jié)作用，以期成為治療疼痛的一個重要靶點。

注:Pain為疼痛，Brain為大腦，PLC為磷脂酶C，IP3為1，4，5-三磷酸肌醇，DAG為二酰甘油，PKC為蛋白激酶C，Microglia為小膠質細胞，Astrocyte為星形膠質細胞，Spinal cord為脊髓，Iummne cell為免疫細胞，IL-5為白細胞介素-5，5-HT為5-羥色胺，Histamine為組胺，NGF為神經(jīng)生長因子，LTB為白三烯B，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，Schwann cell為施萬細胞，Hurt為傷害性刺激

2 免疫細胞PKC介導疼痛的神經(jīng)炎癥反應

疼痛是一種與實際或潛在的組織損傷相關的不愉快的感覺和情緒情感體驗，或與此相似的經(jīng)歷[17]。在過去20年里，疼痛神經(jīng)免疫學相關研究在所有疼痛研究中的比例增加了近2倍[18]，疼痛的神經(jīng)免疫機制有利于揭示傷害性疼痛向慢性疼痛的轉變，神經(jīng)免疫學可能是解釋疼痛的關鍵所在，因此是當前重要的研究方向。大腦和脊髓中免疫細胞之間的信號傳遞是調節(jié)慢性疼痛的關鍵因素，并且與遺傳易感性有關，Arman等[19]研究認為，能夠實現(xiàn)在大鼠脊髓鞘內(nèi)對白細胞介素(interleukin，IL)-1β的監(jiān)測以闡明神經(jīng)痛時腦內(nèi)免疫信號的實時變化。另有研究認為，在疼痛的傳導部位神經(jīng)損傷引起免疫細胞和膠質細胞的反應不同：巨噬細胞和施萬細胞促進神經(jīng)損傷遠端神經(jīng)纖維的沃勒變性；巨噬細胞、淋巴細胞和衛(wèi)星細胞驅動DRG的免疫反應；脊髓小膠質細胞的激活則介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)對周圍神經(jīng)損傷的早期反應，隨后星形膠質細胞激活并增殖。初級感覺神經(jīng)元、施萬細胞和免疫細胞之間形成疼痛調節(jié)的復雜網(wǎng)絡，而細胞因子和多種趨化因子是其核心成分[20]。若能較好地闡明疼痛的神經(jīng)免疫學機制或將為疼痛治療提供新的靶點。

文獻報道，PKC在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中具有抗傷害性作用，單純皰疹病毒介導IL-10的表達降低了PKC磷酸化水平，同時增加了糖尿病大鼠DRG神經(jīng)元的細胞完整性，減少了糖尿病大鼠DRG中促炎細胞因子(如Toll樣受體4)的表達，由此也能看出PKC具有參與調節(jié)“神經(jīng)免疫”反應的作用，可通過神經(jīng)免疫機制阻斷DRG神經(jīng)元的傷害反應和應激反應[21]。在神經(jīng)性疼痛條件下神經(jīng)損傷部位、DRG和脊髓背角發(fā)生改變。在這些部位，內(nèi)皮細胞損傷和神經(jīng)元活動增加導致單核/巨噬細胞(外周)的招募和小膠質細胞(中央)的激活，小膠質細胞釋放導致神經(jīng)元敏感的介質，從而實現(xiàn)持續(xù)慢性疼痛的正反饋。

2.1損傷部位 免疫細胞接收并整合來自其外部環(huán)境及其微環(huán)境中的鄰近細胞和細胞因子的信號，進而參與免疫反應。除了淋巴細胞參與慢性炎癥過程外，中性粒細胞是外周組織損傷早期的主要免疫細胞，巨噬細胞、肥大細胞在炎癥后期發(fā)揮更重要的作用。免疫細胞分泌如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、IL-1β、IL-6、神經(jīng)生長因子、前列腺素E2、組胺、5-羥色胺、白三烯B4等炎癥因子，導致神經(jīng)元離子通道Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、TRPV1和TRPA1的磷酸化，使動作電位生成和傷害感受器敏感增加，使機體對感覺刺激做出更強烈的反應，并促進疼痛[22]。有研究認為，PKC能夠與免疫細胞表面的受體發(fā)生物理聯(lián)系，這些表面分子的觸發(fā)會開啟PKC和其他分子信號通路，進而誘發(fā)免疫細胞下游信號轉導[23]。

中性粒細胞是人體最多的白細胞，當有炎癥時，中性粒細胞被趨化因子CX3C配體1(chemokine CX3C ligand 1，CX3CL1)和白三烯B4吸引，作為第一個響應有害刺激而遷移到損傷部位的細胞，發(fā)揮清除碎片、招募單核細胞/巨噬細胞的功能[24-25]，在中性粒細胞中表達絕大多數(shù)的PKC亞類，PKC參與中性粒細胞還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活，生成的活性氧可以促進免疫細胞的聚集和增強炎癥反應，還通過激活核因子κB通路調節(jié)炎癥細胞因子和CX3CL1的表達，從而進一步促進免疫細胞的募集[26]。

肥大細胞是神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)聯(lián)系的橋梁，被激活的肥大細胞脫顆?？舍尫叛装Y因子和CX3CL1等參與其他免疫細胞的募集和遷移。Madera-Salcedo等[27]認為，PKCδ和PKCβ通過磷酸化功能調節(jié)神經(jīng)細胞和免疫細胞中突觸體相關蛋白受體復合物形成，從而調控肥大細胞脫顆粒。研究表明，PKC參與對肥大細胞發(fā)揮效應功能的正向調節(jié)和負向調節(jié)，如PKCθ促進高親和力IgE受體結合后肥大細胞在纖連蛋白表面的黏附和擴散，而PKCε抑制這一過程[23]。此外，肥大細胞釋放組胺受PKCβ正向調節(jié)，但受PKCδ負向調節(jié)。

Zuniga等[28]證實PKCε參與巨噬細胞凋亡，介導巨噬細胞M1～M2亞型的極化，主要機制是PKCε調節(jié)還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和活性氧產(chǎn)生，導致細胞功能障礙和加劇下游炎癥。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子具有激活炎癥細胞，刺激炎癥相關因子分泌的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PKC通過胞外信號調節(jié)激酶通路調節(jié)粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子表達[29-30]。長春新堿可誘導單核細胞/巨噬細胞和小膠質細胞表達CX3CL1受體，內(nèi)皮細胞的激活也導致表達該受體的單核/巨噬細胞的募集，通過釋放活性氧激活TRPA1通道，引起疼痛反應，從而使痛覺神經(jīng)元敏感[31]。神經(jīng)元表達釋放CX3CL1，CX3CL1可增加病變處單核細胞、自然殺傷細胞和T淋巴細胞數(shù)量。CX3CL1與CX3CL1受體相互作用則激活小膠質細胞PKC信號通路，然后增加神經(jīng)缺血狀態(tài)下小膠質細胞中TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，促進炎癥反應發(fā)生[31-32]。

Sorge等[33]發(fā)現(xiàn)淋巴結清掃可以明顯減少選擇性神經(jīng)損傷大鼠星形膠質細胞激活，并減少活化的PKCγ興奮性中間神經(jīng)元數(shù)量。進一步研究發(fā)現(xiàn)，鳥嘌呤核苷酸交換因子DOCK8(dedicator of cytokinesis 8)是PKCα磷酸化的底物，DOCK8被磷酸化后進一步促進T細胞遷移，脊髓損傷后的T細胞促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)纖維化及自身免疫，進而介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥[34]。脊髓損傷后B細胞促進自身免疫和脫髓鞘，PKCβ轉運至B細胞抗原受體信號體時，募集IκB激酶α、IκB激酶β、IκB激酶γ/NEMO(核因子κB基本調制器)組成的IκB激酶復合物，通過核因子κB途徑促進B細胞活化、增殖和存活，相反，PKCδ的觸發(fā)卻有利于通過胞外信號調節(jié)激酶途徑導致B細胞凋亡[23]。

免疫細胞是炎癥期間內(nèi)源性阿片肽的主要來源，中性粒細胞、巨噬細胞等產(chǎn)生內(nèi)源性阿片肽，如β-內(nèi)啡肽、腦啡肽，后者與阿片受體結合調節(jié)疼痛[35]。嗎啡對μ阿片受體的激活會進一步活化Gαi/o-Gβγ-PKCα磷酸化途徑，該途徑限制了μ阿片受體的分布，間接調節(jié)機體對疼痛的反應，研究發(fā)現(xiàn)該機制與PKC磷酸化μ阿片受體的Ser344、Ser363和Thr370等不同位點有關[36-37]。

總之，PKC在內(nèi)皮細胞損傷后通過炎癥因子的介導，參與中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞的招募及活化免疫細胞的相關功能，誘發(fā)免疫細胞下游信號轉導及調節(jié)阿片受體活化，從而促進疼痛的發(fā)生發(fā)展。

2.2外周神經(jīng)系統(tǒng) 施萬細胞是外周神經(jīng)系統(tǒng)中含量最多的膠質細胞，Lee-Kubli等[38]研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷導致的大鼠神經(jīng)病理性疼痛中，神經(jīng)膠質細胞主要是通過影響DRG的神經(jīng)元和施萬細胞而調節(jié)疼痛。施萬細胞在神經(jīng)損傷后產(chǎn)生多種促炎細胞因子(包括TNF、IL-6和IL-1)，有助于外周感覺神經(jīng)元的敏化和免疫細胞的募集，募集的巨噬細胞、T細胞和肥大細胞會增加促炎細胞因子的水平，以增強傷害性軸突的敏感性[20，39]。當神經(jīng)受損時，施萬細胞獲得增殖能力并釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)，它們可促進受損軸突的生長，但也會使感覺神經(jīng)元敏感，從而促進神經(jīng)性疼痛的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)損傷后，PKCα在施萬細胞中表達明顯上調，PKC激活劑佛波酯激活PKCα，PKCα通過激活胞外信號調節(jié)激酶信號通路促進施萬細胞增殖和遷移[40]。近來有研究認為，褪黑素使GDNF和PKC蛋白表達顯著提高，褪黑素激活GDNF/PKC通路，可促進施萬細胞增殖，同時促進外周神經(jīng)損傷的恢復[41]。因此，PKC可以通過施萬細胞發(fā)揮神經(jīng)免疫作用而調節(jié)疼痛。

外周神經(jīng)損傷后，初級傳入傷害感受器神經(jīng)元將CXC趨化因子配體1等促炎介質釋放到脊髓，誘導背角小膠質細胞產(chǎn)生TNF-α，TNF-α激活星形膠質細胞產(chǎn)生大量促炎介質導致脊髓神經(jīng)元發(fā)生相應變化，促進中樞敏化。研究表明，有害刺激使傷害感受器從其外周末端釋放神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質，如降鈣素基因相關肽、P物質。樹突狀細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞和T細胞表達這些神經(jīng)元介質的受體，使它們能夠直接響應傷害感受器[22]。神經(jīng)元通過CX3CL1受體活化相互作用與神經(jīng)膠質細胞交流，PKC激動劑佛波酯能夠以劑量依賴和時間依賴的方式誘導免疫物質(如CX3CL1)分泌，PKC抑制劑Ro-0432能夠減少CX3CL1分泌，進而在調節(jié)淋巴細胞的運輸以及調節(jié)細胞黏附、T淋巴細胞活化、吞噬作用、細胞因子分泌等方面發(fā)揮重要作用。PKC抑制劑(H-7)可以部分減弱免疫相關的降鈣素基因相關肽的作用，加速細胞遷移和增殖，抑制細胞凋亡[38]。當神經(jīng)損傷時，神經(jīng)細胞還會釋放大量P物質，使胞質內(nèi)無活性的PKC轉至細胞膜發(fā)生活化，活化的PKC又可誘導一氧化氮合酶發(fā)生磷酸化，使疼痛信號維持時間延長，導致中樞敏化[42]?？梢姡弁吹陌l(fā)生發(fā)展機制還可能與PKC調節(jié)外周神經(jīng)系統(tǒng)施萬細胞及免疫細胞在疼痛狀態(tài)下的功能有關，并與炎癥因子、神經(jīng)遞質等的釋放有關。

2.3中樞神經(jīng)系統(tǒng) 在慢性疼痛期間，小膠質細胞在早期活化，并成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞，其主要參與清除神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞凋亡中的細胞碎片、幫助傷口愈合?；钴S的小膠質細胞能夠通過酶促作用從神經(jīng)元膜上活化CX3CL1受體，從而增強免疫細胞的活性[43]，PKCα、PKCβ、PKCδ、PKCγ、PKCζ已被證明參與調節(jié)小膠質細胞的免疫反應活性[44]。研究發(fā)現(xiàn)，PKC通過p38促分裂原活化的蛋白激酶激活核因子κB，使M1型小膠質細胞產(chǎn)生促炎細胞因子而加重神經(jīng)炎癥[45]。此外，PKC參與調節(jié)腺苷A2A受體從抗炎轉化到促炎狀態(tài)，參與小膠質細胞增殖和炎癥介質釋放[44]。CC趨化因子受體5是細胞內(nèi)趨化因子CC家族成員的受體，小膠質細胞CC趨化因子受體5表達水平與p-PKCγ有關，p-PKCγ通過CC趨化因子受體5介導小膠質細胞對免疫細胞的趨化作用[46]。Toll樣受體4是一種先天免疫模式識別受體，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質細胞表達，脊髓Toll樣受體4的激活在由神經(jīng)損傷、骨癌和組織炎癥引起的病理性疼痛發(fā)生中起關鍵作用，IL-1β/PKC信號參與脊髓背角Toll樣受體4對γ-氨基丁酸能突觸活動的調節(jié)[47]。

星形膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、體積最大的膠質細胞。星形膠質細胞表面分布著許多神經(jīng)遞質、神經(jīng)營養(yǎng)因子受體、神經(jīng)肽、激素及Na+、K+和Ca2+通道等。神經(jīng)損傷后星形膠質細胞從靜止狀態(tài)轉變?yōu)榉磻?，招募中性粒細胞和M1型巨噬細胞，參與膠質瘢痕形成。星形膠質細胞活化后炎癥介質的產(chǎn)生和釋放是神經(jīng)炎癥形成的關鍵因素，可介導中樞敏化和突觸重塑以維持疼痛[48]。研究表明，促炎條件下星形膠質細胞表達不同的PKC亞型，包括PKCα、PKCβ、PKCδ[49]。慢性壓迫背根神經(jīng)節(jié)模型中，大鼠術側脊髓背角內(nèi)PKCε和膠質細胞原纖維酸性蛋白表達上調，PKC參與星型膠質細胞激活[50]。PKC具有磷酸化星形膠質細胞縫隙連接蛋白43并升高促炎細胞因子濃度的作用，其可促進星形膠質細胞促炎狀態(tài)的形成[51]。PKC可介導神經(jīng)遞質谷氨酸和γ-氨基丁酸循環(huán)，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)相鄰突觸的谷氨酰胺利用率和神經(jīng)信號傳遞[49]，此外，PKCδ通過誘導表達型基因(c-Fos)/轉錄因子1炎癥信號轉導通路，上調基質金屬蛋白酶-9并促進星形膠質細胞的遷移[52]。

以上結果表明，由疼痛信號激活的PKC通路可在慢性疼痛過程中調節(jié)小膠質細胞和星形膠質細胞炎癥狀態(tài)下的神經(jīng)免疫反應活性。

3 小 結

自20多年前首次將神經(jīng)炎癥與慢性疼痛聯(lián)系起來，神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間的分界線已經(jīng)變得越來越模糊，大量研究支持周圍神經(jīng)系統(tǒng)免疫細胞浸潤和脊髓背角小膠質細胞激活在慢性神經(jīng)性疼痛機制中的作用。神經(jīng)免疫相互作用發(fā)生在外周損傷部位及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，PKC在外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)占據(jù)著慢性疼痛調節(jié)的重要部位。PKC通過活化多種免疫細胞介導疼痛的發(fā)生發(fā)展，介導施萬細胞和神經(jīng)元活性發(fā)揮神經(jīng)免疫調節(jié)作用，參與中樞小膠質細胞和星形膠質細胞的炎癥反應，在神經(jīng)元和非神經(jīng)元之間疼痛的信息的傳遞中起著重要的作用。研究PKC調節(jié)慢性疼痛的神經(jīng)免疫細胞機制有利于理解疼痛的神經(jīng)-免疫-炎癥機制，以期為慢性疼痛的治療及預防研究提供新的視角和靶點。