王樂, 朱孝仁, 彭詩晴, 陳敏斌

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬昆山第一人民醫(yī)院腫瘤科,江蘇 昆山 215300)

乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤[1-2]。乳腺癌轉(zhuǎn)移是長期以來腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究的重要癌癥特征[3]。研究發(fā)現(xiàn),在最初診斷和治療后的幾個月或幾年內(nèi),乳腺癌細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移至其他部位[4-7],如肝臟[8]、大腦[9]、骨骼[10]或肺部[11]等。另有研究表明,伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者預(yù)后差[12],復(fù)發(fā)率高[13],生存期短[14]。目前認(rèn)為,多個促癌基因過度表達(dá)及活化是發(fā)生乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移和進(jìn)展的主要原因[15-16]。

富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白1(leucine-rich repeat protein 1, LRR1) 基因所編碼的蛋白質(zhì)含有一個富含亮氨酸的重復(fù)序列,對于腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控具有重要作用[17]。臨床研究表明,LRR1在侵襲性胃癌患者血清中呈高表達(dá)[18]。另有研究發(fā)現(xiàn),LRR1長鏈非編碼 RNA 可以促進(jìn)胃癌侵襲[19]。目前,關(guān)于LRR1和乳腺癌轉(zhuǎn)移間的相關(guān)性尚不清楚,本研究擬以乳腺癌 MDA-MB-231、HCC70 細(xì)胞株為研究對象,探討LRR1對乳腺癌細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑及儀器

人乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞系購于上海富衡細(xì)胞庫；人乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細(xì)胞系購于上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。PBS、胎牛血清(美國Hyclone公司)；HitransG病毒感染試劑 (A/P) 購自上海吉凱基因科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；四甲基乙二胺(碧云天生物技術(shù)有限公司)；MEM、1%青霉素/鏈霉素、胰酶、溴酚藍(lán)、二甲基亞砜、Triton X-100 (美國Sigma公司)；BCA蛋白定量試劑盒、離心機(jī)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；凝膠成像儀(美國Analytikjena公司)；電泳上樣緩沖液、TEMED(碧云天生物技術(shù)有限公司)；脫脂奶粉(美國BD公司)；PVDF 膜(美國Millipore公司) ；兔抗人LRR1、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, m-TOR)、β-肌動蛋白一抗,羊抗兔二抗(英國Abcam 公司)。轉(zhuǎn)染序列均由吉凱基因公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及慢病毒轉(zhuǎn)染

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在培養(yǎng)基中加入100 ng/mL霍亂毒素配制成完全培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人乳腺上皮MCF-10A 細(xì)胞；用含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的 DMEM,于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人乳腺癌 HCC70 和 MDA-MB-231 細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 取“1.2.1”乳腺癌MDA-MB-231和HCC70細(xì)胞,分為干擾對照組、LRR1干擾組、LRR1過表達(dá)組和空載體對照組,分別轉(zhuǎn)染LRR1干擾對照序列(TTCTCCGAACGTGTCACGT)、LRR1干擾序列(GTGGTCTTAGTAGATAATT)、LRR1過表達(dá)序列(AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAAGCTACACTGTGAGGTGGAG)和空載體序列(TCCTTGTAGTCCATACCCTTTAACATATCAGAGGAATT-AACATAAC)。每孔加入適量完全培養(yǎng)基,接種于6孔板,每孔細(xì)胞數(shù)5×105個,培養(yǎng)12 h左右；取1.5 mL無酶EP管,加入100 μL無血清培養(yǎng)基,再加入2 μL Lipofectamine 2000并輕輕混勻配置成a液；取無菌1.5 mL EP管,加入100 μL無血清培養(yǎng)基,加入LRR1干擾序列或者干擾對照序列,混勻配置成b液；再加入LRR1過表達(dá)序列或者空載體對照序列,混合配置成c液,將a、b液以及a、c液混合,室溫放置20 min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)30%～50%時,每孔加入200 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞遷移能力

取“1.2.2”4組轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于24孔板,培養(yǎng)過夜；每孔加入0.6 mL含10%胎牛血清的 DMEM, 37 ℃孵育過夜；胰酶消化并離心；取0.2 mL細(xì)胞混懸液沿著Transwell 小室的側(cè)壁勻速注入標(biāo)記好的相應(yīng)24孔板中,靜置2 min；37 ℃培養(yǎng)24 h；10%甲醇固定15 min；0.1%結(jié)晶紫染色30 min；光鏡下觀察膜背面侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞侵襲能力

取“1.2.2”轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于24孔板,培養(yǎng)過夜；每孔加入0.6 mL預(yù)熱的含有10%胎牛血清的DMEM, 37 ℃孵育過夜；每孔用預(yù)冷的槍頭吸取0.03 mL Matrigel 膠沿著小室側(cè)壁緩慢注入Transwell 小室；37 ℃孵育2 h；胰酶消化并離心；加入4 mL含有1%胎牛血清的DMEM進(jìn)行重懸,取細(xì)胞混懸液加入Transwell小室底部,靜置2 min；于37 ℃孵育24 h ；PBS清洗2次；每孔加入1 mL細(xì)胞固定液常溫固定30 min；PBS清洗2次；每孔加入1 mL結(jié)晶紫常溫染色30 min；PBS清洗3次；小室自然風(fēng)干；刮除小室上層未穿過小室孔膜的乳腺癌細(xì)胞；光鏡下觀察膜背面侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測乳腺癌細(xì)胞LRR1和m-TOR蛋白表達(dá)

1.5.1 LRR1蛋白表達(dá)檢測 取“1.2.1”乳腺癌MDA-MB-231和HCC70細(xì)胞和人乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞,接種于6孔板,保證細(xì)胞數(shù)>1×106個,置于冰上,每孔按照細(xì)胞數(shù)加入0.09 ～ 0.15 mL細(xì)胞裂解液,裂解細(xì)胞15 min；12 000 r/min離心15 min,BCA法蛋白定量；行10% SDS-PAGE,80 V電泳,當(dāng)?shù)鞍讞l帶至分離膠時換成110 V,電泳2 h左右；110 V轉(zhuǎn)膜2 h至PVDF膜；10%脫脂牛奶4 ℃封閉120 min；分別加入兔抗人LRR1抗體、β-肌動蛋白抗體(內(nèi)參),均 1 ∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜；1% PBST洗膜3次；4 ℃孵育二抗(1 ∶1 000稀釋)2 h；ECL液曝光和顯影,Image J軟件進(jìn)行灰度掃描,計(jì)算目的條帶的相對灰度值。

1.5.2 m-TOR蛋白表達(dá)檢測 取“1.2.2”轉(zhuǎn)染細(xì)胞,檢測m-TOR蛋白表達(dá),其中兔抗人m-TOR蛋白1 ∶1 000稀釋,其余方法同“1.5.1”。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LRR1在人乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,人乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細(xì)胞中LRR1表達(dá)顯著高于人乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞(t=-13.472,-12.270,P均<0.01)。見圖1。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測不同乳腺細(xì)胞中LRR1表達(dá)

2.2 LRR1對乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

在乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細(xì)胞中,與干擾對照組相比,LRR1干擾組細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少(t=18.939,10.070,P均<0.01)；與空載體對照組相比,LRR1過表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)明顯增加(t=-22.840,-33.954,P均<0.01)。見圖2。

圖2 各組乳腺癌細(xì)胞遷移能力比較(×100)

2.3 LRR1對乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

在乳腺癌MDA-MB-231、HCC70 細(xì)胞中,與干擾對照組相比,LRR1干擾組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯減少(t=18.059,6.860,P均<0.01)； 與空載體對照組相比,LRR1過表達(dá)組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯增加(t=-24.050,-12.072,P均<0.01)。見圖3。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞侵襲能力(×100)

2.4 LRR1對乳腺癌細(xì)胞m-TOR 表達(dá)的影響

在乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細(xì)胞中,與干擾對照組相比,LRR1干擾組m-TOR表達(dá)水平顯著降低(t=7.804,7.496,P均<0.01)；與空載體對照組比較,LRR1過表達(dá)組m-TOR表達(dá)水平明顯增高(t=-10.405,-7.031,P均<0.01)。見圖4。

圖4 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞m-TOR蛋白表達(dá)

3 討論

以往研究發(fā)現(xiàn),LRR1高表達(dá)與乳腺癌患者不良預(yù)后相關(guān)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),LRR1在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá),與之前報道一致[21]。由此提示,LRR1可能作為乳腺癌新的診斷分子標(biāo)志物,其高表達(dá)極有可能參與調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。此外,本研究結(jié)果顯示, LRR1高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲,由此提示,在乳腺癌進(jìn)展中,LRR1可能作為促癌因子發(fā)揮作用。然而,在腎細(xì)胞癌中LRR1高表達(dá)則抑制腫瘤進(jìn)展[22],這可能與腫瘤的異質(zhì)性以及不同的分子調(diào)控機(jī)制有關(guān)。

LRR1可通過參與蛋白質(zhì)的泛素化過程和蛋白酶體降解[23-24],進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn),LRR1干擾后m-TOR表達(dá)顯著降低；而過表達(dá)則相反；由此提示LRR1可能通過調(diào)節(jié)m-TOR表達(dá)促進(jìn)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移。既往研究發(fā)現(xiàn),m-TOR異?；罨纱龠M(jìn)前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[25]；另有研究表明激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/m-TOR信號通路可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[26]。然而,LRR1是否直接靶向調(diào)節(jié)m-TOR表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移尚未明確,具體機(jī)制有待后續(xù)深入研究。

綜上所述, LRR1可能作為促癌因子通過調(diào)節(jié)m-TOR表達(dá)進(jìn)而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。但是,本研究僅在體外乳腺癌細(xì)胞中進(jìn)行,后續(xù)有待在臨床樣本中研究LRR1對乳腺癌的診斷價值。此外,LRR1與m-TOR在乳腺癌中的生物學(xué)功能以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有待后續(xù)進(jìn)一步研究。