何夢玲，林 丹，李嘉惠，歐曉華，劉曉瑩，高曉霞，馬文哲，張宏意，嚴(yán)寒靜*

? 藥材與資源 ?

白木香種質(zhì)資源ISSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析

何夢玲1, 2，林 丹1，李嘉惠1，歐曉華1，劉曉瑩1，高曉霞3，馬文哲4，張宏意1, 2，嚴(yán)寒靜1, 2*

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 國家中醫(yī)藥管理局中藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006 3. 廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 4. 廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510507

白木香是中國特有的、具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的珍稀瀕危藥用植物，由于人類對(duì)其自然資源的長期過度開發(fā)和生態(tài)破壞，白木香現(xiàn)僅有零星散生的野生資源，為更好地保護(hù)和利用白木香，現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析。采集了中國14個(gè)地區(qū)的232份白木香樣本，并利用ISSR標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)。ISSR標(biāo)記具有較高的多態(tài)性（100%），表明ISSR是檢測白木香遺傳多樣性的有效方法。對(duì)所有樣本進(jìn)行遺傳分析，在相似系數(shù)為0.71時(shí)，可將其聚為4個(gè)類群。期望雜合度（H）、Shannon’s信息指數(shù)（）在XL群體中最高，而61.84%的遺傳變異發(fā)生在群體之間。種群結(jié)構(gòu)分析表明，14個(gè)種群能夠按照區(qū)域和來源進(jìn)行嚴(yán)格劃分，說明種群間的基因交換很少。白木香種源有較好的遺傳多樣性，但野生資源大幅減少，需加強(qiáng)白木香資源的保護(hù)、繁育和利用。

沉香；白木香；ISSR；遺傳多樣性；資源保護(hù)

白木香(Lour.) Gilg來源于瑞香科，主要分布于我國廣東、廣西、海南、云南、香港及澳門等地[1]，其莖干受傷后產(chǎn)生的含樹脂的木材即是我國和東南亞國家的傳統(tǒng)名貴藥材——沉香。沉香性微溫，味辛、苦，歸脾、胃、腎經(jīng)，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之效，主治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等疾病[2]，并為治胃病特效藥[1]，白木香是國產(chǎn)沉香的唯一植物來源，也是“十大廣藥”之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著市場對(duì)沉香需求量的增長，沉香價(jià)格不斷攀升，人們對(duì)白木香野生資源展開無節(jié)制的開發(fā)和掠奪性的采伐，致使白木香的生存環(huán)境嚴(yán)重惡化，種群更新受阻，野生資源加速枯竭[3]。然而，由于長期的生境破壞和過度開發(fā)，白木香數(shù)量迅速減少，已被列為珍稀瀕危三級(jí)保護(hù)植物[4]。

ISSR是一種基于SSR的分子標(biāo)記技術(shù)。與SSR標(biāo)記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不像SSR標(biāo)記一樣具有較強(qiáng)的種特異性，而且揭示的多態(tài)性較高，檢測非常方便。ISSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定[5]、遺傳作圖[6]、中藥真?zhèn)舞b定[7]、遺傳多樣性[8-9]等研究中，為藥用植物的保護(hù)和發(fā)展提供了重要的參考。

本研究利用ISSR標(biāo)記分析14個(gè)種群232份樣本的遺傳多樣性，以期為白木香種質(zhì)資源的保存和開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

供試材料為采自廣東、海南、云南3省地理相對(duì)隔離的14個(gè)居群的白木香種質(zhì)，共計(jì)232份，經(jīng)廣東藥科大學(xué)嚴(yán)寒靜教授鑒定為白木香(Lour.) Gilg，樣品來源信息如表1所示。從每株白木香樹上釆集10～20片生長良好、無病蟲害的白木香葉片，硅膠干燥并放入?20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 白木香種質(zhì)資源地理信息

Table 1 Geographic information of 14 populations of A. sinensis

樣品編號(hào)數(shù)量采集地點(diǎn)緯度（N）經(jīng)度（E） MM1-1010廣東茂名電白區(qū)沉香山21.69°111.18° ZS1-2020廣東中山五桂山生態(tài)保護(hù)區(qū)22.52°113.38° CC1-2222廣東惠州博羅縣泰美鎮(zhèn)車村23.30°114.51° XL1-2222廣東惠州惠東縣巽寮灣22.69°114.76° GQ1-9 9廣東惠州惠陽區(qū)沙田鎮(zhèn)岡齊嶺22.85°114.58° SZ1-2323廣東深圳銀湖山郊野公園22.58°113.08° YC1-6 6廣東陽江陽春市春灣鎮(zhèn)幸福村22.37°112.02° DH1-4 4廣東肇慶鼎湖山23.18°112.54° DG1-2424廣東東莞大嶺山沉香基地22.91°113.78° YZS1-1313海南省?？谑腥f寧藥植所19.99°110.25° SJ1-1414海南省?？谑忻捞m區(qū)三江鎮(zhèn)19.86°110.61° BWL1-2222海南省昌江黎族自治縣霸王嶺19.10°109.20° NYY1-2222云南省景洪市南藥園22.01°100.79° MS1-2121云南省景洪市勐宋鄉(xiāng)滿金山22.13°100.68°

1.2 試劑與儀器

植物基因組DNA提取試劑盒（GMbiolab Co.，TW），PCR premix購自Takara（T）或Zoman（Z）。DL-600C型電泳儀（北京東林昌盛生物科技有限公司）；BG-subMIDI型水平電泳槽（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；Nanodrop ND-1000型分光光度計(jì)（Thermo公司，美國）；3K15型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；MJ-54A型高壓蒸汽滅菌鍋（美國施都凱儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 白木香基因組DNA的提取與檢測

從每份白木香樣品中取100 mg葉片，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉末，使用植物基因組DNA提取試劑盒依次提取白木香基因組DNA。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的質(zhì)量，并在260 nm/280 nm和230 nm/260 nm波長下檢測DNA的濃度和純度，符合要求的樣品于?20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ISSR-PCR反應(yīng)和檢測

PCR擴(kuò)增體系（20 μL）中，各因素濃度為：DNA模板10 ng/20 μL，引物（5 μmol/L）1.5 μL，dNTP 0.6 mmol/L，Mg2+3 mmol/L，Taq DNA聚合酶2.4 U/20 μL，引物0.2 μmol/L。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，引物m值下退火45 s，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

PCR結(jié)束后，取5～6 μL PCR產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，電泳緩沖液為1×TAE，將凝膠在100 V恒定電壓下電泳45 min，染色，隨后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

2.3 ISSR多態(tài)引物的篩選

選擇加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條ISSR通用引物進(jìn)行篩選，以獲得多態(tài)性好、穩(wěn)定的ISSR引物。同時(shí)篩選了各引物適合的PCR Premix和適合的退火溫度。

2.4 數(shù)據(jù)分析

使用Quantity One分析軟件識(shí)別和計(jì)算瓊脂糖凝膠電泳圖上各泳道條帶的有無及其遷移率，根據(jù)分析結(jié)果給條帶賦值，條帶清晰穩(wěn)定記為“1”，條帶模糊或無條帶則記為“0”，于Excel 2010中建立二元數(shù)據(jù)矩陣，用于進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。

運(yùn)用NTSYS-PC統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算相似系數(shù)（DICE系數(shù)），并且按照遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析，通過Dcenter變換得到二維主坐標(biāo)分析圖（PCoA）。利用軟件STRUCTURE v.2.3.4對(duì)白木香種質(zhì)資源進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。

運(yùn)用POPGENE 32 ver.1.32軟件計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的觀測等位基因數(shù)（a）、有效等位基因數(shù)（e）、Nei’s遺傳多樣性（）、Shannon’s信息指數(shù)（）、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分率、遺傳一致性和遺傳距離等參數(shù)。此外，利用群體間總遺傳多樣性（t）、群體內(nèi)平均遺傳多樣性（s）、遺傳分化系數(shù)（st）和基因流（m）對(duì)白木香的種群結(jié)構(gòu)和種群規(guī)模進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果與分析

3.1 多態(tài)引物篩選及多態(tài)性分析

隨機(jī)選擇3個(gè)省份的3份白木香種質(zhì)資源基因組DNA作為模板，對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選，最終篩選出12條穩(wěn)定性高，重復(fù)性好、條帶清晰的引物。

利用這12條ISSR引物對(duì)232份種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究，共擴(kuò)增出357條條帶，每條引物檢測到的條帶數(shù)介于18～49，平均每條引物檢測到的條帶數(shù)為30條，條帶片段大小基本上集中在200～2500 bp。擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物為UBC856，多達(dá)49條，擴(kuò)增條帶數(shù)最少的為UBC826和UBC887，僅有18條。357條條帶均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率為100%。每條引物的篩選結(jié)果見表2。

表2 12條引物的篩選結(jié)果

Table 2 Sequences and amplification results of 12 ISSR primers

引物引物序列(5’-3’)擴(kuò)增出的條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)PCR premix退火溫度/℃ UBC807(AG)8 T3232T48.5 UBC808(AG)8 C2929T53.0 UBC809(AG)8 G3636Z52.0 UBC810(GA)8 T3131Z51.2 UBC811(GA)8 C2020Z52.0 UBC826(AC)8 C1818T51.2 UBC827(AC)8 G2121T47.9 UBC834(AG)8YT4343Z53.3 UBC840(GA)8 YT2222T49.9 UBC856(AC)8 YA4949Z55.5 UBC886VDV (CT)73838T49.8 UBC887DVD (TC)71818T49.8 平均值 29.7529.75?? 總計(jì) 357357??

T-Takara公司的PCR引物 Z-Zoman公司引物

T-PCR premix from Takara Z-PCR premix from Zoman

3.2 基于ISSR分子標(biāo)記的白木香遺傳多樣性分析

14個(gè)居群白木香的遺傳多樣性指數(shù)見表3。t為0.260 5±0.016 5，s為0.112 7±0.016 5。st為0.567 6（＞0.5），表明種群間存在高度的遺傳分化。m為0.381 0，說明種群間基因流動(dòng)較弱。

值在0.089 6～0.147 9（表3）。在14個(gè)種群中，巽寮灣（XL）的多態(tài)性最高（43.98%），鼎湖山（DH）和深圳銀湖山（SZ）最低（23.53%）。種群大小與遺傳多樣性和百分比多態(tài)性無顯著相關(guān)。6個(gè)群體的遺傳多樣性指數(shù)均高于平均水平，分別是巽寮灣（XL）、車村（CC）、東莞大嶺山（DG）、海南藥用植物研究所（YZS）、海南三江鎮(zhèn)（SJ）和云南勐宋鄉(xiāng)（MS）。

表3 14個(gè)居群白木香的遺傳多樣性

Table 3 Genetic diversity in 14 populations of A. sinensis

居群樣本數(shù)量NaNeHI多態(tài)性位點(diǎn)（NPL）多態(tài)性位點(diǎn)比率（PPL）/% M101.282 91.175 10.100 70.149 810128.29 ZS201.369 71.187 90.111 50.169 913236.97 CC221.409 01.230 30.135 90.204 214640.90 XL221.439 81.254 80.147 90.221 415743.98 GQ 91.246 51.187 00.102 90.148 5 8824.65 SZ231.235 31.163 20.091 90.134 4 8423.53 YC 61.243 71.176 10.098 00.142 7 8724.37 DH 41.235 31.157 30.089 60.132 3 8423.53 DG241.336 11.208 40.120 80.179 512033.61 YZS131.364 11.215 10.124 30.185 913036.41 SJ141.364 11.205 60.120 40.181 513036.41 BWL221.285 71.194 20.109 50.160 410228.57 NYY221.296 91.179 90.106 20.158 710629.69 MS211.366 91.198 10.117 70.178 213136.69 平均值171.319 71.195 20.112 70.167 711431.97

采用分子方差分析（AMOVA）對(duì)白木香群體間的分子變異進(jìn)行分析（表4），總體遺傳多樣性中，群體間遺傳多樣性為61.84%，群體內(nèi)遺傳多樣性為38.16%。

表4 白木香群體遺傳變異的AMOVA分析

Table 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) for population of A. sinensis

變異來源自由度平方和方差分量變異比例/%P值 居群內(nèi)218 4 375.6120.07 38.16＜0.001 居群間 13 7 180.1532.53 61.84＜0.001 總計(jì)23111 555.7652.60100.00

3.3 聚類分析

利用UPGMA方法進(jìn)行聚類，并構(gòu)建出232份白木香種質(zhì)的系統(tǒng)聚類圖。從圖1中可以看出，遺傳距離的取值范圍從0.66到0.96，當(dāng)閾值為0.71時(shí)，14個(gè)白木香居群被聚為4組。將廣東5個(gè)居群（MM、CC、XL、GQ和SZ）組成一個(gè)聚類，將7個(gè)居群（3個(gè)海南、3個(gè)廣東和1個(gè)云南）組成一個(gè)大聚類。

此外，當(dāng)遺傳距離的取值介于0.66～0.68時(shí)，云南南藥園NYY的種群聚在一起，而其他210個(gè)個(gè)體聚成第2支。聚類結(jié)果的主坐標(biāo)分析結(jié)果如圖2所示。這表明種群沒有明顯地聚集在一起。

利用STRUCTURE軟件對(duì)232個(gè)白木香種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。當(dāng)＝13時(shí)△值最大（圖2）。根據(jù)分析結(jié)果，當(dāng)＝13時(shí)可以得到合理的種群結(jié)構(gòu)（圖3）。不同的顏色代表不同的組，每條顏色的垂線代表一份材料。種群結(jié)構(gòu)幾乎嚴(yán)格按照地區(qū)和來源進(jìn)行劃分。

4 討論

多年生木本植物通常遺傳多樣性值高, 常表現(xiàn)出小群體之間的分化[10]，這一點(diǎn)在本研究中也有體現(xiàn)。白木香的期望雜合度（e）值為0.231 8，高于雙子葉植物的均值（0.190 0）和區(qū)域性植物（0.220 0）可能是因?yàn)椋?）白木香的地理分布在物種多樣性豐富的熱帶和低緯度亞熱帶地區(qū)；（2）花期長，主要繁殖方式為異花授粉；（3）果實(shí)成熟后，種子懸掛在裂開的果皮上，種子懸掛可以通過重力或昆蟲的長距離取食進(jìn)行傳播，這些環(huán)境因素和自身特性都有助于白木香群體之間進(jìn)行基因交流。

圖1 232份白木香種質(zhì)的聚類圖

圖2 K值曲線圖

與其他木本植物的H和相比較，如紅豆杉(Pilger) Rehd.（0.205 8，0.325 9）[11]和黃檗Rupr.（0.224 3，0.262 8）[12]，白木香的和均值分別為0.112 7、0.167 7，反映出白木香種群的遺傳多樣性相對(duì)較低。究其原因，可能是白木香的種子屬于頑拗性種子，水分和貯藏溫度高，代謝旺盛，在自然環(huán)境中容易脫水和失活。白木香的花期為4月，恰逢雨季，陰雨天氣會(huì)導(dǎo)致花粉敗育，阻止昆蟲異花傳粉，增加自花傳粉的概率，減少種群間的基因交換?；蛄饔址Q基因遷移，是基因從一個(gè)種群遷移到另一個(gè)種群的機(jī)制[13]?；蛄骺梢詼p弱群體間的遺傳差異，提高群體間的遺傳相似性。本研究中白木香的m值只有0.381 0，表明白木香種群間很少基因交流，這一結(jié)果和白木香種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)圖一致，各種群間相對(duì)獨(dú)立。但這一數(shù)值小于廣東中山市五桂山土沉香中（0.534）[14]的研究結(jié)果，可能因?yàn)楸狙芯恐邪啄鞠惴N質(zhì)來源地區(qū)較多，野生植株的種子傳播率低，種群之間也有較大地理隔離的原因。

作為一種具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的珍稀瀕危植物，白木香比其他物種受到更嚴(yán)重的人為干擾和破壞，直接導(dǎo)致種群個(gè)體數(shù)量的急劇減少、居群片段化嚴(yán)重和遺傳漂變加劇。一旦下一代個(gè)體不產(chǎn)生后代或沒有將所有等位基因傳給后代，就很容易導(dǎo)致某些基因的消失[15]。在本研究中，白木香14個(gè)種群的st值為0.567 5，低于大多數(shù)被子植物種群的平均水平（st＝0.637）[16]，這一點(diǎn)與賈文杰等[15]和Zou等[17]的結(jié)果一致。珍稀瀕危植物由于生存環(huán)境狹窄，種群數(shù)量少，隨機(jī)漂變和近交衰退常導(dǎo)致個(gè)體和群體變異性較低，往往表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性水平。瀕危會(huì)導(dǎo)致遺傳多樣性水平的下降，而低水平的遺傳多樣性會(huì)使其更加瀕危。

圖3 232份白木香種質(zhì)種群結(jié)構(gòu)分析（K＝13）

AMOVA分析顯示群體內(nèi)遺傳變異為38.16%，群體間遺傳變異為61.84%，這與蔣開彬應(yīng)用SRAP標(biāo)記進(jìn)行研究的結(jié)果相反[18]?？赡苁且?yàn)?項(xiàng)研究所用遺傳標(biāo)記不同的緣故。

STRUCTURE的分析結(jié)果表明，白木香的種群結(jié)構(gòu)幾乎嚴(yán)格按照區(qū)域和來源進(jìn)行劃分，說明白木香種群之間沒有廣泛的基因交換，這與m值和PCoA分析結(jié)果基本一致。究其原因，可能是因?yàn)榉欠撤?dǎo)致白木香個(gè)體數(shù)量銳減。

因此，對(duì)白木香的保護(hù)策略應(yīng)包括就地保護(hù)和遷地保護(hù)。就地保護(hù)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)原生境的關(guān)注，保持種群的有效規(guī)模，避免個(gè)體數(shù)量的減少，這主要依賴于自然保護(hù)區(qū)的建立。為擴(kuò)大白木香種群，有必要組織人力進(jìn)行種子采集和引種試驗(yàn)。為了進(jìn)行遷地保護(hù)，需要精心設(shè)計(jì)保護(hù)策略，從不同地點(diǎn)/種群收集種子，并將不同種群的幼苗轉(zhuǎn)移到合適的生境，以建立該物種的種質(zhì)庫；從而人為增加種群間的基因流動(dòng)。廣泛開展科普宣傳教育，提高公眾保護(hù)珍稀瀕危樹種及其生存環(huán)境的意識(shí)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Evaluation of genetic diversity ofgermplasm resources using ISSR markers

HE Meng-ling1, 2, LIN Dan1, LI Jia-hui1, OU Xiao-hua1, LIU Xiao-ying1, GAO Xiao-xia3, MA Wen-zhe4, ZHANG Hong-yi1, 2, YAN Han-jing1, 2

1. College of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. Key Laboratory of Production & Development of Cantons Medicinal Materials, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 3. College of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 4. Guandong Aib Polytechnic, Guangzhou 510507, China

, a precious medicinal plant with high economic value, has been driven to the brink of depletion due to the long-term overexploitation of natural resources and ecological destruction by anthropogenic activities. There are only scattered wild resources of. In order to better protect and utilize schistosomiaceae, the genetic diversity ofwas analyzedA total of 232 samples ofwere collected from 14 areas in China and its genetic diversity was evaluated with ISSR markers.High levels of polymorphism (100%) were observed, indicating that ISSR was an efficient method to detect genetic diversity of wild. All samples were genetically analyzed and divided into four major clusters at the similarity coefficient of 0.71. The highestandvalues were observed in XL population and most genetic variations occurred among populations. The analysis of population structure showed that 14 populations were strictly divided by region and source, indicating that there was little gene exchange amongresources.There was a good genetic diversity inresources. Due to the sharp decrease of wild resources, the protection, breeding and utilization ofresources should be strengthened.

agarwood;(Lour.) Gilg; ISSR; genetic diversity; materials protection

R282.12

A

0253 - 2670(2022)11 - 3441 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.021

2021-11-09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81773829）；廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃（2020B020221002）；廣東省科技項(xiàng)目（2015A030302084）；廣東省科技項(xiàng)目（2017A030303082）；廣東省科技項(xiàng)目（2017A030303081）；廣東省中管局項(xiàng)目（20163010）

何夢玲，女，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥資源開發(fā)與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究工作。E-mail: hmldf@126.com

嚴(yán)寒靜，女，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥資源開發(fā)與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究工作。E-mail: yanhanjing1211@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]