宋玉琴，魯梓旭，余 婕，董夢(mèng)旋，郭 爽，禚方圻，陳昊南，張友剛，韓利文*

基于斑馬魚模型及分子對(duì)接技術(shù)研究丹參促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵活性成分

宋玉琴1, 2，魯梓旭2，余 婕2，董夢(mèng)旋2，郭 爽2，禚方圻2，陳昊南2，張友剛2，韓利文2*

1. 淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086 2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)與制藥科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250000

建立新方法探索丹參中潛在的促進(jìn)血管生成的活性成分。以綠色熒光蛋白標(biāo)記血管的轉(zhuǎn)基因斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以血管抑制劑PTK787損傷造模建立血管生成活性評(píng)價(jià)模型，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地的丹參提取物對(duì)血管生成的促進(jìn)作用。采用分子對(duì)接技術(shù)篩選丹參促血管生成的潛在活性成分，結(jié)合分子對(duì)接篩選結(jié)果與斑馬魚活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確認(rèn)關(guān)鍵的活性成分。與模型組比較，不同產(chǎn)地的丹參提取物均能明顯促進(jìn)斑馬魚節(jié)間血管的生成（＜0.01）。通過分子對(duì)接篩選發(fā)現(xiàn)丹酚酸B與VHL-缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）復(fù)合物的對(duì)接結(jié)合能最低，并初步揭示可能的作用位點(diǎn)。利用斑馬魚模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B具有明顯的促進(jìn)血管生成作用（＜0.01）。建立了一種基于斑馬魚模型的“虛擬篩選-活性評(píng)價(jià)”的中藥藥效物質(zhì)辨識(shí)新方法，將計(jì)算化學(xué)數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)與斑馬魚活性實(shí)驗(yàn)結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了丹酚酸B是丹參中促血管生成的關(guān)鍵活性成分之一，為冠心病的防治及后續(xù)的新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

丹參；血管生成；斑馬魚；分子對(duì)接；丹酚酸B

冠心病也稱為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease，CHD），是由冠狀動(dòng)脈狹窄、供血不足引起的心肌功能障礙和（或）器質(zhì)性病變[1]。目前冠心病的治療主要為藥物治療、介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）及冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass grafting，CABG）[2]。已有研究表明，傳統(tǒng)中藥可通過促進(jìn)心臟梗死區(qū)或缺血區(qū)的旁路血管新生來治療CHD[3]。促進(jìn)血管新生可改善CHD患者的心肌缺血、減緩癥狀發(fā)作并能改善預(yù)后，降低不良心血管事件的發(fā)生率[4-5]。因此，從傳統(tǒng)中藥中篩選發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)血管再生的關(guān)鍵藥效成分，對(duì)于CHD的防治具有重要價(jià)值。

丹參為唇形科植物丹參Bge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參具有增加冠脈流量[6]、降低心肌興奮性和傳導(dǎo)性、保護(hù)心肌缺血性損傷[7]、抗氧化[8-9]、保護(hù)心血管[10]、改善腎功能[11]、抗菌消炎[12]、抗腫瘤[13]等作用。丹參的主要化學(xué)成分為脂溶性的二萜醌類、水溶性酚酸類及其他類型化合物[14]。雖然目前已有較多丹參藥效成分的研究，但采用新模型、新技術(shù)探索丹參中是否存在其他潛在的抗CHD活性成分，依然具有重要價(jià)值。

斑馬魚是一種國(guó)際新興的新型脊椎模式動(dòng)物，在血管生成途徑上與人類表現(xiàn)出高度的遺傳和功能的保守性，有87%的基因片段相同[15]。斑馬魚為整體動(dòng)物，可以觀察到整體表型，與體外細(xì)胞模型相比，具有明顯優(yōu)勢(shì)。血管標(biāo)記熒光的轉(zhuǎn)基因系的斑馬魚不用染色即可觀察斑馬魚節(jié)間血管情況，使得測(cè)量血管再生結(jié)果更直觀精準(zhǔn)[16]。分子對(duì)接技術(shù)主要是研究受體與藥物分子之間的結(jié)合與相互作用，通過受體獨(dú)有特征，篩選可能結(jié)合的藥物分子以及結(jié)合模式和親和力，是當(dāng)下計(jì)算機(jī)模擬在藥物研究領(lǐng)域的重要輔助手段[17]。自20世紀(jì)70年代中期首次出現(xiàn)以來，分子對(duì)接已成為協(xié)助藥物設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特計(jì)算機(jī)模擬工具，如在大型化合物庫(kù)中識(shí)別新的化學(xué)支架[18]，為藥物重新定位、靶點(diǎn)確認(rèn)、預(yù)測(cè)不良反應(yīng)和其他方面進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[19]。中藥組成成分復(fù)雜，通過分子對(duì)接技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)活性成分的虛擬篩選，進(jìn)一步提高篩選的效率，降低篩選成本，已成為新藥發(fā)現(xiàn)的重要方法。因此，本研究應(yīng)用新型模式動(dòng)物斑馬魚模型和分子對(duì)接技術(shù)深入研究丹參中促血管再生作用活性的關(guān)鍵成分，為候選藥物的發(fā)現(xiàn)、資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

共收集2020—2021年不同產(chǎn)地的丹參藥材飲片，詳細(xì)信息見表1。所有樣品經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)韓利文副研究員鑒定為唇形科植物丹參Bge.的干燥根和根莖，保藏于藥學(xué)與制藥科學(xué)學(xué)院中藥資源樣品庫(kù)中。

1.2 藥品與試劑

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)K1723046）購(gòu)自北京芯硅谷；酪氨酸激酶抑制劑PTK787（批號(hào)M1648-04）購(gòu)自AbMole公司；亞甲基藍(lán)（批號(hào)619H022）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；鏈酶蛋白酶（批號(hào)41844523）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.3 動(dòng)物

血管標(biāo)記綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚（）來自國(guó)家斑馬魚資源中心。

1.4 儀器

Z-A-S5型斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；IX83型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；ZSA0745型體式顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津）；DFY-1000型搖擺式多功能高速中藥粉碎機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）；TDZ5型臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DZF型真空干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）。

表1 不同產(chǎn)地丹參樣品信息

Table 1 Information of S. miltiorrhiza samples from different origins

編號(hào)收集日期產(chǎn)地編號(hào)收集日期產(chǎn)地 DS012020-11-08山東菏澤DS062021-02-18 湖北神農(nóng)架 DS022021-03-13山東日照DS072021-02-23云南文山 DS032020-10-10山東菏澤DS082021-03-16陜西丹鳳 DS042021-03-02山東菏澤DS092021-03-23四川德陽 DS052020-11-12河南禹州DS102021-02-18云南麗江

2 方法

2.1 丹參提取物的制備

不同產(chǎn)地的丹參樣品按照相同方法進(jìn)行平行提取。丹參樣品用中藥粉碎機(jī)粉碎為粗粉，過3號(hào)篩；稱取15 g丹參樣品粉末放入500 mL圓底燒瓶中，加入90%乙醇120 mL（料液比1∶8），90 ℃水浴提取，提取2次，每次1.5 h；合并2次上清液，減壓濃縮，真空60 ℃干燥，即得丹參提取物。

隨機(jī)選取1個(gè)提取物樣本（DS01），準(zhǔn)確稱定，置10 mL量瓶中，加入80%甲醇溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。按照《中國(guó)藥典》2020年版一部丹參藥材含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定，采用島津LC-20A型高效液相色譜儀，以乙腈-0.02%磷酸水溶液為流動(dòng)相，測(cè)定DS12提取物中丹酚酸B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.46%，丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I之和為0.29%。

2.2 丹參提取物的斑馬魚耐受實(shí)驗(yàn)

選擇發(fā)育至24 h（hours post fertilization，hpf）的斑馬魚受精卵，用脫膜劑鏈酶蛋白酶（1 mg/mL）進(jìn)行脫膜處理。隨機(jī)選取1個(gè)提取物樣本（DS01）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置不同質(zhì)量濃度的丹參提取物（100、200、400、600、800、1000、1500、2000 μg/mL）組和對(duì)照組（給予pH 7.1～7.4、溫度26.5～28.5 ℃、電導(dǎo)率490～530 μS、溶解氧質(zhì)量濃度5.0～7.5 mg/L的養(yǎng)魚水）。于體式鏡下觀察，記錄給藥24 h后斑馬魚畸形與死亡情況，計(jì)算死亡率。

采用GraphPad Prism 9統(tǒng)計(jì)軟件通過回歸分析計(jì)算丹參提取物的最低致死質(zhì)量濃度，考察斑馬魚對(duì)丹參提取物的耐受性。

2.3 丹參提取物對(duì)斑馬魚促進(jìn)血管生成活性的研究

將發(fā)育至24 hpf的斑馬魚受精卵用1 mg/mL的脫膜劑鏈酶蛋白酶進(jìn)行脫膜處理，將脫膜的斑馬魚放入24孔板，每孔10條。模型組中加入0.2 μg/mL PTK787，處理組先加入0.2 μg/mL PTK787后再加入丹參提取物或單體，對(duì)照組中加入空白溶劑（0.5% DMSO）。每孔加入養(yǎng)魚水保證每孔體積為2 mL。24 h后于熒光顯微鏡下觀察斑馬魚的節(jié)間血管情況并進(jìn)行拍照，用Image Pro 6軟件測(cè)量血管長(zhǎng)度，統(tǒng)計(jì)節(jié)間血管總長(zhǎng)度，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行單因素方差分析，＜0.05表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 基于分子對(duì)接技術(shù)篩選丹參促血管生成的活性成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php）中以“丹參”為關(guān)鍵詞檢索丹參的化學(xué)成分，剔除沒有PubChem信息的化合物，將具有PubChem CID的化合物批量導(dǎo)入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得化合物的sdf結(jié)構(gòu)，構(gòu)建丹參小分子庫(kù)，將獲得丹參小分子庫(kù)導(dǎo)入Schrodinger分子模擬包中，利用Ligpre模塊進(jìn)行2D sdf分子轉(zhuǎn)化為3D sdf格式，用于后期分子對(duì)接的準(zhǔn)備。

抑癌基因VHL介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）降解是調(diào)控下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)的重要途徑。因此，在RCSB pdb數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）中下載VHL-HIF-1α復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（PDB：3ZRC），將3ZRC導(dǎo)入Schrodinger的Maesrto10.1進(jìn)行蛋白前處理，由于3ZRC有多條同源鏈，選擇其中1條包含活性口袋的鏈進(jìn)行分子對(duì)接。蛋白經(jīng)過protein preparation模塊進(jìn)行補(bǔ)足缺失殘基以及中性化等操作，最后進(jìn)行能量最小化并添加OPLS2005力場(chǎng)。

分子對(duì)接的活性口袋由3ZRC自帶的配體進(jìn)行定義，直接選中3ZRC晶體中的配體生成對(duì)接盒子，對(duì)接盒子參數(shù)選擇軟件默認(rèn)。先進(jìn)性HTVS（high through virtual screening）模式的高通量篩選，將得到的化合物再次進(jìn)行SP（standard precision）模式的篩選，根據(jù)對(duì)接的結(jié)果篩選前10個(gè)結(jié)合能較高的化合物進(jìn)行可視化。為了驗(yàn)證對(duì)接的可靠性，本研究將3ZRC自帶配體抽出再對(duì)接到3ZRC中5次，計(jì)算對(duì)接結(jié)合模式的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值以評(píng)估對(duì)接的可靠性。對(duì)接的結(jié)果分別采用Pymol 2.4.1和Ligplus進(jìn)行可視化。

3 結(jié)果

3.1 丹參提取物在斑馬魚模型的耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了更好地觀察藥物對(duì)于斑馬魚的致死效應(yīng)，將劑量的對(duì)數(shù)值與死亡率進(jìn)行回歸曲線擬合。GraphPad Prism 9軟件擬合的結(jié)果（圖1）顯示，丹參提取物質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí)，斑馬魚開始出現(xiàn)死亡；丹參提取物質(zhì)量濃度為1000 μg/mL時(shí)，斑馬魚全部死亡，但在600 μg/mL時(shí)就開始出現(xiàn)了斑馬魚發(fā)育異常（脊柱彎曲）的情況，表明丹參提取物已經(jīng)出現(xiàn)了致畸作用，因此本研究中丹參提取物的耐受劑量為400 μg/mL，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中質(zhì)量濃度最高設(shè)為400 μg/mL。

圖1 斑馬魚幼魚死亡率回歸曲線圖

3.2 丹參提取物促進(jìn)斑馬魚血管生成的劑量效應(yīng)

如圖2所示，PTK787處理斑馬魚后，斑馬魚節(jié)間血管生長(zhǎng)不完整，沒有閉合，與對(duì)照組相比節(jié)間血管總長(zhǎng)度顯著縮短（＜0.01）且無畸形或死亡出現(xiàn)，表明血管損傷模型建立成功。隨機(jī)選取1個(gè)丹參提取物（DS01）考察樣品在斑馬魚模型上促進(jìn)血管生成作用的量效關(guān)系。發(fā)現(xiàn)丹參提取物質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，斑馬魚沒有明顯的血管生長(zhǎng)出現(xiàn)；丹參提取物質(zhì)量濃度為100、150 μg/mL時(shí)，斑馬魚開始出現(xiàn)明顯的血管生長(zhǎng)，與模型組相比具有顯著性差異（＜0.01）。說明丹參提取物能夠逆轉(zhuǎn)PTK787造成的斑馬魚血管損傷，且隨著丹參質(zhì)量濃度的增加，促血管再生作用有增強(qiáng)的趨勢(shì)。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01，圖3、5同

3.3 不同產(chǎn)地的丹參提取物對(duì)斑馬魚損傷血管生成的促進(jìn)作用

如圖3所示，不同產(chǎn)地的丹參提取物（150 μg/ml）均出現(xiàn)了不同程度的促血管生成作用，與模型組相比，均具有顯著性差異（＜0.01）。不同產(chǎn)地的丹參提取物表現(xiàn)出了不完全一致的生物活性，其中DS06樣品促血管生成的活性最低，DS05樣品促血管生成的活性最高。

3.4 分子對(duì)接技術(shù)分析

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中總共獲得143個(gè)具有PubChem信息的化合物，經(jīng)過Ligpre進(jìn)行處理轉(zhuǎn)化成3D結(jié)構(gòu)。在對(duì)接模型驗(yàn)證（Redocking）過程中，進(jìn)行了5次對(duì)接，最終3ZRC自帶的配體（PubChem ID：56684144）均對(duì)接到了活性口袋，且5次對(duì)接結(jié)合能均為?39.079 kJ/mol，RMSD值為0，對(duì)接具有非常高的可重復(fù)性，證明對(duì)接模型的可靠性。

在HTVS對(duì)接模式下由132個(gè)化合物成功對(duì)接到活性口袋，對(duì)接結(jié)合能?26.865～?2.807 kJ/mol。在SP對(duì)接模式下，總共有137個(gè)結(jié)合能小于0的化合物被成功對(duì)接，結(jié)合能為?31.091～?0.197 kJ/mol，有3個(gè)化合物的結(jié)合能大于0 kJ/mol，可能是VHL-HIF1a非抑制劑。表2為排名前10的化合物與3ZRC對(duì)接結(jié)合能及化合物信息，對(duì)接排名最高的化合物為丹酚酸B，結(jié)合能為?31.091 kJ/mol。對(duì)接結(jié)果顯示，3ZRC晶體自帶的共晶陽性配體（positive ligand，PL）剛好與3ZRC蛋白晶體的活性口袋契合（圖4-A），具有很好的重現(xiàn)性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PL與活性口袋的TYR-98、HIS-110、SER-111和HIS-115 4個(gè)氨基酸殘基形成氫鍵。圖4-B為丹酚酸B與3ZRC對(duì)接的模式圖，丹酚酸B主要通過PRO-99、TYR-98、ARG-107和HIS-110 4個(gè)氨基酸殘基形成氫鍵并錨定在3ZRC的活性口袋，其中TYR-98和HIS-110 2個(gè)氨基酸殘基同樣出現(xiàn)了PL與3ZRC的對(duì)接模式中。

圖3 不同產(chǎn)地的丹參提取物對(duì)斑馬魚節(jié)間血管生長(zhǎng)情況的影響(, n = 10)

表2 排名前10的化合物信息與結(jié)合能

Table 2 Information and binding energy of top 10 compounds

序號(hào)Pubchem CID化合物結(jié)合能/(kJ·mol?1) 16451084丹酚酸B?31.091 21794427綠原酸?28.146 310403222紫丹酸A?27.573 416730071丹參二醇A?27.179 55316800ziganein?26.447 65280445木犀草素?25.799 75280443芹菜素?25.782 864982黃芩苷?25.485 967097462-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(3-hydroxypropyl)-7-methoxy-1-benzofuran-3-carbaldehyde?25.451 1051066555(2R)-2-[(E)-3-[(2S,3R)-3-[(1R)-1-carboxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethoxy]carbonyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-2,3-dihydro-1-benzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxy-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic acid?24.966

A-3ZRC自帶的共晶PL與活性口袋契合 B-丹酚酸B與3ZRC對(duì)接的模式圖 a-3維對(duì)接結(jié)合圖 b、c-2維對(duì)接結(jié)合圖

3.5 丹酚酸B對(duì)斑馬魚損傷血管生成的促進(jìn)作用

如圖5所示，與模型組比較，10、20、40、80 μg/mL的丹酚酸B均具有顯著的促血管生成作用（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。

圖5 不同質(zhì)量濃度的丹酚酸B對(duì)斑馬魚節(jié)間血管生長(zhǎng)情況的影響(, n = 10)

4 討論

斑馬魚體系現(xiàn)已被廣泛用于藥物篩選和毒理學(xué)研究[20-21]。斑馬魚胚胎和幼魚體積很小，可用微孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，故適合于高通量篩選[22]。斑馬魚屬于脊椎動(dòng)物，是一種活體研究體系，可保留藥動(dòng)學(xué)過程，故其與其他的體外研究體系相比更加適合用于中藥這種復(fù)雜化學(xué)體系的藥效學(xué)研究[23]。斑馬魚的受精卵或者魚苗能夠便利地從培養(yǎng)介質(zhì)中吸收親水或親脂的物質(zhì)，使得其檢測(cè)中藥的活性變得非常方便[24]。PTK787是一種酪氨酸激酶抑制劑，能夠特異性地抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)，進(jìn)而抑制血管生成[25]。研究表明，瓜蔞[26]、白芍[27]、天麻[28]、丹紅注射液[29]等在斑馬魚模型上均體現(xiàn)了明顯的促進(jìn)血管生成的作用，可逆轉(zhuǎn)PTK787誘導(dǎo)的血管損傷。

中藥的成分非常多，理化性質(zhì)復(fù)雜，在常規(guī)的細(xì)胞學(xué)篩選體系和分子篩選體系中采用中藥進(jìn)行新藥篩選時(shí)常常難以避免非特異性影響，從而產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。傳統(tǒng)中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)[30-31]，建立注重整體、精準(zhǔn)識(shí)別的藥效成分發(fā)現(xiàn)技術(shù)，一直是本領(lǐng)域的瓶頸環(huán)節(jié)。本研究借助計(jì)算化學(xué)的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，建立了基于斑馬魚模型的“虛擬篩選-活性評(píng)價(jià)”的藥效成分發(fā)現(xiàn)方法，使計(jì)算機(jī)模擬與實(shí)驗(yàn)結(jié)合，有效節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，降低實(shí)驗(yàn)成本，為天然藥效成分的高效發(fā)現(xiàn)提供新思路。研究表明，VHL蛋白中pVHL是HIF-1α家族的底物識(shí)別位點(diǎn)，靶向HIF-1α家族進(jìn)行泛素介導(dǎo)的蛋白酶體的降解[32-34]。在正常有氧條件下，HIF-1α通過脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD）家族，在脯氨酸上被羥基化引發(fā)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)。在低氧或缺氧條件下，當(dāng)PHD不能發(fā)揮功能或VHL突變時(shí)，則會(huì)改變pVHL與HIF-1α或elongin C的結(jié)合，HIF-1α不能被pVHL識(shí)別[35-37]。HIF-1α的聚集和轉(zhuǎn)錄會(huì)上調(diào)一些血管發(fā)育的重要基因（如促紅細(xì)胞生成素、VEGF），細(xì)胞增生的基因（血小板衍生因子-β、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α）和糖代謝的基因（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1）[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參中丹酚酸B與VHL-HIF-1α復(fù)合物具有較高的對(duì)接性能，提示丹酚酸B促進(jìn)血管生成的作用可能與此作用有關(guān)，為后續(xù)的深入研究提供了方向。

綜上，本研究中成功建立了一個(gè)基于斑馬魚模型的“虛擬篩選-活性評(píng)價(jià)”的藥物篩選方法，并發(fā)現(xiàn)丹參中丹酚酸B是發(fā)揮促進(jìn)血管生成作用的關(guān)鍵成分，為丹酚酸B應(yīng)用于冠心病的防治以及新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Crucial proangiogenic components inbased on zebrafish model and molecular docking technique

SONG Yu-qin1, 2, LU Zi-xu2, YU Jie2, DONG Meng-xuan2, GUO Shuang2, ZHUO Fang-qi2, CHEN Hao-nan2, ZHANG You-gang2, HAN Li-wen2

1. Zibo Institute for Food and Drug Control Shandong, Zibo 255086, China 2. School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250000, China

To establish a new method to explore the potential angiogenesis-promoting active components in Danshen ().Transgenic zebrafish with green fluorescent protein-labeled blood vessels was used as experimental animal, and PTK787, a vascular inhibitor, was used to establish the angiogenesis inhibition model. And this kind of experimental model was used to evaluate the angiogenesis-promoting effect ofextracts of different origins. The molecular docking technique was used to screen the potential active components offor pro-angiogenesis. The results of molecular docking screening were combined with the results of zebrafish activity assay to identify the key active ingredients.Compared with model group,extracts from different origins significantly promoted intersegmental vessels development in zebrafish (< 0.01). The lowest docking binding energy of salvianolic acid B with VHL-hypoxia inducible factor-1α complex was found by molecular docking screening, and the possible sites of action were initially revealed. The experiments using zebrafish model revealed that salvianolic acid B had a significant angiogenesis-promoting effect (< 0.01).A new method of “virtual screening-bioactivity evaluation” based on zebrafish model was established for identification of pharmacological substances in traditional Chinese medicine. Combining computational chemistry data mining technology with zebrafish activity experiments, salvianolic acid B was discovered as one of key pro-angiogenic active ingredients in. The research provides a scientific basis for the prevention and treatment of coronary heart disease and subsequent development of new drugs.

Bge.; angiogenesis; zebrafish; molecular docking; salvianolic acid B

R285.5

A

0253 - 2670(2022)11 - 3394 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.015

2022-02-23

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2019MH037）；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302-1907-09）；山東第一醫(yī)科大學(xué)學(xué)術(shù)提升計(jì)劃項(xiàng)目（2019LJ003）；山東省農(nóng)業(yè)科技資金（園區(qū)產(chǎn)業(yè)提升工程）項(xiàng)目（2019YQ033）

宋玉琴（1978—），碩士，副主任藥師，從事中藥質(zhì)量控制研究。Tel: 13953357709 E-mail: zbdasck@163.com

韓利文（1980—），博士，副研究員，從事藥物篩選及中藥質(zhì)量控制研究。Tel: (0531)59567223 E-mail: hanliwen08@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]