王 森，戴婷婷，鐘榮玲，夏 智，羅利霞，寧 青，宋 捷*，謝 林

雪膽素片聯(lián)合阿霉素增強細胞免疫原性死亡的抗肝癌作用研究

王 森1, 2，戴婷婷3，鐘榮玲2，夏 智2，羅利霞1, 2，寧 青2，宋 捷1, 2*，謝 林1, 4*

1. 南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 第三臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210028 2. 江蘇省中醫(yī)藥研究院 國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇 南京 210028 3. 東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 南京 210002 4. 南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 骨傷科，江蘇 南京 210028

研究雪膽素片聯(lián)合阿霉素協(xié)同抗肝癌的作用，以及對細胞免疫原性死亡相關蛋白表達的調(diào)控。采用高效液相色譜法對雪膽素片主要成分進行分析；采用MTT法考察雪膽素片與阿霉素聯(lián)合使用對人肝癌HepG2細胞存活率的影響；采用平板克隆觀察雪膽素片與阿霉素聯(lián)合使用對HepG2細胞集落形成的影響；采用流式細胞儀分析雪膽素片與阿霉素聯(lián)合使用對HepG2細胞凋亡率和細胞周期的影響；采用免疫熒光檢測免疫原性細胞死亡關鍵指標鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）和高遷移率蛋白1（high mobility group protein B1，HMGB1）表達；采用ELISA法檢測細胞內(nèi)外三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）濃度。建立小鼠肝癌H22細胞皮下移植瘤模型觀察雪膽素片與阿霉素聯(lián)合使用的體內(nèi)抗腫瘤效果；采用免疫組化法檢測小鼠腫瘤組織CRT和HMGB1表達；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察雪膽素片與阿霉素聯(lián)合使用對小鼠心肌毒性的影響。雪膽素片聯(lián)合阿霉素對HepG2細胞具有濃度相關性的細胞毒性和促凋亡作用，可促進CRT膜外暴露，HMGB1向胞外分泌，ATP胞外濃度增加；雪膽素片聯(lián)合阿霉素可抑制H22細胞小鼠皮下移植瘤的生長，提高免疫能力，延長其生存期，增加小鼠皮下腫瘤組織內(nèi)CRT和HMGB1蛋白陽性表達的細胞數(shù)量。雪膽素片聯(lián)合阿霉素的抗肝癌作用可能與調(diào)節(jié)免疫原性死亡相關蛋白表達有關。

雪膽素片；阿霉素；免疫原性死亡；鈣網(wǎng)蛋白；高遷移率蛋白1；三磷酸腺苷

肝細胞癌是一種常見的致命惡性腫瘤，也是全球第5大癌癥死亡原因，具有復發(fā)率高、預后較差的特點[1]。目前在肝癌的治療方式中，化療占據(jù)重要位置[2]。研究發(fā)現(xiàn)，蒽環(huán)類等[3-8]傳統(tǒng)化療藥物在誘導細胞凋亡的同時，還能夠促進鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）、高遷移率蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等損傷相關分子（damage-associated molecule patterns，DAMPs）的釋放，促進抗原提呈到樹突狀細胞（dendritic cell，DC），激活細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells，CTL），從而誘導細胞免疫原性死亡（immunogenic cell death，ICD）[9-10]，ICD可將瀕死或死亡的癌細胞轉(zhuǎn)化為免疫“疫苗”，增強抗腫瘤免疫的能力[11]，通過上調(diào)CD8+、CD4+T細胞的表達，以及下調(diào)免疫抑制細胞的表達，最終改善免疫微環(huán)境[12]。因此，ICD的合理運用有望在腫瘤治療領域發(fā)揮巨大作用。

阿霉素是一種能夠誘導ICD的代表性蒽環(huán)類化療藥物。研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素與淫羊藿素、紫草素等藥物聯(lián)合使用可增強細胞免疫原性，從而發(fā)揮更有效的抗腫瘤作用[12-14]。雪膽素片是一類具有清熱解毒作用的中成藥，由葫蘆科雪膽屬植物提取的雪膽素制成。雪膽素的主要成分雪膽甲素和雪膽乙素對多種惡性腫瘤均有明顯的抑制作用[15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雪膽素片能夠增強阿霉素的抗腫瘤作用，同時伴隨細胞膜外CRT表達的上調(diào)，但其作用機制尚不明確。因此本研究探究雪膽素片聯(lián)合阿霉素對肝癌細胞增殖、集落形成、凋亡和ICD相關蛋白表達的影響以及潛在的作用機制，以期提供一種有效的肝癌治療策略。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，4周齡，購自蚌埠依諾佳生物科技有限公司，動物許可證號SCXK（蘇）2021-0025。動物飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院動物實驗室，獨立通風屏障系統(tǒng)，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會批準（批準號AEWC-20210426-139）。

1.2 細胞

人肝癌HepG2細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；小鼠肝癌H22細胞購自上海拜力生物技術有限公司。

1.3 藥品與試劑

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號C11078099）購自上海麥克林生化科技有限公司；MTT（批號H25N11B130393）購自上海源葉生物科技有限公司；雪膽素片（批號20042201，10 mg/片）購自云南一枝蒿制藥有限公司；鹽酸阿霉素（批號25316-40-9）購自南京康滿林化工實業(yè)有限公司；DMEM不完全高糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶、細胞周期檢測試劑盒（批號20190505）、DAPI凋亡試劑盒（批號KGA215）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；PBS購自武漢塞維爾生物科技有限公司；胎牛血清（批號21051001）購自Cell Biologics公司；色譜級甲醇（批號21010355）購自Tedia公司；結(jié)晶紫染料（批號20170525）購自凱基生物技術股份有限公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡試劑盒（批號A91231）購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；乙醇（批號20210908）購自國藥集團化學試劑有限公司；雪膽甲素對照品（批號HAO62805198，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自Herbest公司；雪膽素乙對照品（批號RFS-X03502002012，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司；4%多聚甲醛（批號71033600）購自Biosharp公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號EZ4567D106）購自BioFroxx公司；CRT兔單克隆抗體（批號ab92516）、HMGB1兔單克隆抗體（批號ab79823）購自英國Abcam公司；羊抗兔IgG抗體（批號AA44181）購自Bioworlde公司；增強型ATP試劑檢測盒（批號052421210390）購自碧云天生物技術公司。

1.4 儀器

培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶（美國Corning公司）；SPECTRA MAX 190型酶標儀（Molecular Devices公司）；普通光學顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；HH-4型水浴鍋（上海維誠儀器公司）；臺式離心機（德國Heraeus公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀；KQ5200型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Fresco 21型冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Synergy H1型酶標儀（美國BioTek公司）。

2 方法

2.1 雪膽素片和阿霉素溶液的制備

稱取5 mg阿霉素粉末溶于1 mL DMSO中，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的母液，于4 ℃保存，臨用時將母液用培養(yǎng)基稀釋1000倍配制成質(zhì)量濃度為5 mg/L的溶液，隨后使用培養(yǎng)基逐級稀釋到所需濃度。雪膽素片研磨粉碎后，稱取40 mg溶于1 mL DMSO-完全培養(yǎng)基（1∶9）的溶液中，隨后逐級稀釋到所需濃度，給藥體系中DMSO的終質(zhì)量分數(shù)不超過0.1%。

2.2 高效液相色譜定性分析雪膽素片主要成分

2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為水（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～23 min，25%～45% B；23～35 min，45% B；體積流量為1 mL/min；檢測波長為210 nm；進樣量為10 μL；柱溫為20 ℃。通過與已知對照品相匹配的保留時間（R）和光譜來識別成分。

2.2.2 混合對照品的制備 取雪膽甲素、雪膽乙素置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至5 mL，分別制備雪膽甲素對照品溶液、雪膽乙素對照品溶液、混合對照品溶液，臨用時用0.45 μm微孔濾膜濾過，于4 ℃保存。另以甲醇配制陰性對照1瓶。

2.2.3 供試品溶液的制備 取雪膽素片，研細，精密稱定0.14 g，精密加入甲醇5 mL，超聲處理10 min，放冷，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，于4 ℃保存。

2.3 MTT法檢測雪膽素片聯(lián)合阿霉素對HepG2細胞存活率的影響

HepG2細胞用含10%胎牛血清的DMEM不完全高糖培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的HepG2細胞，接種于96孔板，每孔8000個。培養(yǎng)24 h后分別給予不同質(zhì)量濃度雪膽素片（20、40、80、120、160、200 mg/L）、阿霉素（0.05、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00 mg/L）及雪膽素片（20～200 mg/L）＋阿霉素（0.05 mg/L）處理細胞，以不含藥液的培養(yǎng)基作為對照，以不含細胞的培養(yǎng)基作為調(diào)零孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/L），37 ℃孵育4 h后，每孔加入100 μL DMSO溶液，振蕩10 min后置于酶標儀中測定490 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(給藥－調(diào)零)/(對照－調(diào)零)

2.4 平板克隆檢測雪膽素片聯(lián)合阿霉素對HepG2細胞增殖的影響

取處于對數(shù)生長期的HepG2細胞，接種于6孔板中，每孔1000個。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后換液，分別給予雪膽素片（80 mg/L）、阿霉素（0.05 mg/L）及雪膽素片（80 mg/L）＋阿霉素（0.05 mg/L）處理細胞，以不含藥液的培養(yǎng)基作為對照，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后吸棄舊培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，甲醇固定20 min后，按照結(jié)晶紫染色試劑盒說明書操作，干燥后觀察增殖情況并拍照記錄。

2.5 流式細胞術檢測HepG2細胞凋亡和細胞周期

取處于對數(shù)生長期的HepG2細胞，接種于6孔板上，每孔1×106個，培養(yǎng)24 h后分別給予雪膽素片（80 mg/L）、阿霉素（0.05 mg/L）及雪膽素片（80 mg/L）＋阿霉素（0.05 mg/L），進行細胞周期實驗給藥時增加雪膽素片（40 mg/L）組及雪膽素片（40 mg/L）與阿霉素（0.05 mg/L）聯(lián)合給藥組，以不含藥液的培養(yǎng)基作為對照，孵育24 h后收集細胞，用冷的PBS洗滌細胞2遍，根據(jù)Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒和細胞周期試劑盒說明書操作，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡和周期。

2.6 免疫熒光檢測HepG2細胞ICD相關蛋白表達

取處于對數(shù)生長期的HepG2細胞，接種于24孔板中，每孔5×104個，培養(yǎng)24 h后分別給予雪膽素片（80 mg/L）、阿霉素（0.05 mg/L）及雪膽素片（80 mg/L）＋阿霉素（0.05 mg/L），以不含藥液的培養(yǎng)基作為對照，繼續(xù)孵育24 h后吸棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min；1% BSA封閉30 min，分別滴加CRT和HMGB1單克隆抗體稀釋液50 μL，4 ℃避光孵育過夜；第2天滴加二抗，避光孵育60 min；按照DAPI凋亡試劑盒說明書進行核染。染色完畢后滴加封片液50 μL于24孔板中，于激光共聚焦顯微鏡上進行熒光檢測并拍照。

2.7 ELISA檢測HepG2細胞ATP分泌

取處于對數(shù)生長期的HepG2細胞，接種于6孔板上，每孔5×105個，置于5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，分別給予雪膽素片（80 mg/L）、阿霉素（0.05 mg/L）及雪膽素片（80 mg/L）＋阿霉素（0.05 mg/L），以不含藥液的培養(yǎng)基作為對照，孵育24 h后根據(jù)ATP檢測試劑盒說明書操作，利用多功能酶標儀的化學發(fā)光功能進行檢測。

2.8 H22肝癌細胞小鼠皮下移植瘤模型的建立

收集處于對數(shù)生長期的H22細胞，用高糖培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至2×107個/mL。用一次性注射器注射到小鼠右側(cè)腋下，每只注射0.1 mL，注射24 h后將小鼠隨機分為4組，分別為模型組、雪膽素片（500 mg/kg）組、阿霉素（3 mg/kg）組和聯(lián)合給藥組，給藥劑量同單用組保持一致，常規(guī)飼養(yǎng)，每天記錄小鼠生存狀況。雪膽素片溶于0.9%氯化鈉溶液中，小鼠ig給藥，1次/d；阿霉素溶于0.9%氯化鈉溶液中，尾iv給藥，每3天1次；聯(lián)合組給藥方式與周期均同單用組保持一致。小鼠共分為2批，第1批每組5只，12 d后脫頸椎法處死，剝離移植瘤組織、脾臟、心臟，稱取瘤體與脾臟質(zhì)量。另一批每組7只，每3天使用游標卡尺測量1次腫瘤體積，共測量5次，記錄小鼠60 d內(nèi)的生存情況

腫瘤體積＝長×寬2/2

脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量

2.9 免疫組化檢測小鼠皮下移植瘤模型腫瘤組織ICD相關蛋白表達

將各組小鼠瘤組織保存于福爾馬林中，組織用石蠟包埋，切片脫蠟，0.3% H2O2孵育30 min。使用PBS沖洗切片3次，轉(zhuǎn)移至檸檬酸鹽抗原修復液中高壓加熱，室溫冷卻，加入CRT和HMGB1單克隆抗體后4 ℃孵育過夜。第2天，切片用PBS洗滌，加入經(jīng)生物素標記的二抗，室溫孵育1 h[16]。切片用DAB顯色后蘇木素復染，脫水后用中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察CRT和HMGB1表達情況。

2.10 小鼠皮下移植瘤模型心臟病理HE染色

取各組小鼠心臟組織，用10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切成4 μm切片，65 ℃烘箱中烘烤3 h后用二甲苯洗3次，梯度乙醇沖洗2次，蘇木素染色，流水沖洗后用鹽酸-乙醇溶液分化，氨水返藍，流水洗后用伊紅復染，浸入梯度乙醇中，二甲苯透明，中性樹脂封片[17]，風干后拍照觀察小鼠心肌毒性。

2.11 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 雪膽素片主要有效成分的定性分析

本研究選擇210 nm為檢測波長，利用高效液相色譜對雪膽素片主要成分進行定性分析。如圖1所示，雪膽素片的主要成分為雪膽甲素和雪膽乙素。

3.2 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對HepG2細胞存活率的影響

如圖2所示，阿霉素和雪膽素片抑制HepG2細胞增殖，呈劑量相關性。單獨給藥時，雪膽素片（80 mg/L）抑制率為21.37%，阿霉素（0.05 mg/L）抑制率為0.52%，而雪膽素片（80 mg/L）聯(lián)合阿霉素（0.05 mg/L）抑制率則達到51.15%，呈現(xiàn)較強的協(xié)同抗肝癌作用，差異具有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。因此后續(xù)體外實驗選擇80 mg/L雪膽素片聯(lián)合0.05 mg/L阿霉素。

1-雪膽甲素 2-雪膽乙素

與對照組比較：**P＜0.01

3.3 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對HepG2細胞集落形成的影響

如圖3-A所示，與對照組相比，阿霉素（0.05 mg/L）組、雪膽素片（80 mg/L）組和聯(lián)合給藥組細胞集落形成數(shù)量均有減少，其中聯(lián)合組的抑制作用最明顯，表明雪膽素片聯(lián)合阿霉素抑制腫瘤能力最強。

3.4 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對HepG2細胞凋亡和周期的影響

如圖3-B所示，不同組別藥物處理HepG2細胞24 h后，對照組、阿霉素（0.05 mg/L）組、雪膽素片（80 mg/L）組和聯(lián)合給藥組細胞凋亡率分別為17.31%、19.86%、48.8%、61.6%，說明雪膽素片與阿霉素聯(lián)用后誘導HepG2細胞凋亡的能力增強。

如圖3-C所示，不同組別藥物處理HepG2細胞24 h后，各組G2/M期細胞數(shù)量均高于對照組；與阿霉素組相比，雪膽素片（40 mg/L）聯(lián)合阿霉素（0.05 mg/L）組G2/M期的細胞數(shù)量明顯增多，雪膽素片（80 mg/L）聯(lián)合阿霉素（0.05 mg/L）組G2/M期細胞數(shù)雖然沒有增加，但出現(xiàn)凋亡亞峰。上述結(jié)果提示低質(zhì)量濃度（40 mg/L）的雪膽素片與阿霉素聯(lián)用可誘導HepG2細胞有絲分裂停滯在G2/M期，高質(zhì)量濃度（80 mg/L）的雪膽素片與阿霉素聯(lián)用誘導HepG2細胞凋亡。

圖3 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對HepG2細胞集落形成(A)、細胞凋亡(B) 和細胞周期(C) 的影響

3.5 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對HepG2細胞CRT和HMGB1蛋白表達的影響

CRT在ICD早期轉(zhuǎn)位到細胞膜上，同時細胞釋放HMGB1。免疫熒光檢測結(jié)果（圖4）顯示，雪膽素片（80 mg/L）與阿霉素（0.05 mg/L）聯(lián)合處理后HepG2細胞CRT明顯暴露于細胞膜；同樣，聯(lián)合組處理過的HepG2細胞中HMGB1向外分泌。說明雪膽素片（80 mg/L）與阿霉素（0.05 mg/L）聯(lián)合處理后促使CRT暴露于細胞膜，并促進HMGB1向胞外分泌。

3.6 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對HepG2細胞ATP釋放的影響

如圖5所示，阿霉素（0.05 mg/L）組、雪膽素片（80 mg/L）組和聯(lián)合組胞內(nèi)ATP濃度均低于對照組，其中雪膽素片組和聯(lián)合組有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。與對照組相比，聯(lián)合組胞外ATP濃度顯著升高（＜0.01），提示雪膽素片（80 mg/L）與阿霉素（0.05 mg/L）聯(lián)合使用促進ATP由胞內(nèi)向胞外分泌。

圖4 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對HepG2細胞CRT (A) 和HMGB1 (B) 蛋白表達的影響

與對照組比較：**P＜0.01

3.7 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對小鼠皮下移植瘤模型移植瘤生長及生存周期的影響

小鼠sc H22細胞建立異位移植瘤模型，模型組小鼠腫瘤體積持續(xù)增大，小鼠逐漸出現(xiàn)運動遲緩、食欲不佳、立毛等癥狀。在給藥12 d后取小鼠腫瘤組織并拍照（圖6-A），雪膽素片（500 mg/kg）、阿霉素（3 mg/kg）以及聯(lián)合給藥組小鼠移植瘤體積生長速度比模型組明顯減緩，聯(lián)合組腫瘤體積抑制程度最大，抗腫瘤作用顯著增強（圖6-B，＜0.01），并且在一定程度上改善阿霉素單用所致的小鼠脾臟指數(shù)降低現(xiàn)象（表1）。60 d生存期觀察結(jié)果（圖6-C）顯示，聯(lián)合組小鼠生存質(zhì)量最高，死亡率最低。

3.8 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對小鼠皮下移植瘤模型腫瘤組織CRT和HMGB1蛋白表達的影響

如圖7所示，與模型組相比，雪膽素片（500 mg/kg）與阿霉素（3 mg/kg）聯(lián)合給藥組CRT和HMGB1蛋白陽性表達的細胞數(shù)量明顯增多，與體外實驗中對HepG2細胞調(diào)控作用一致。

與模型組比較：**P＜0.01

表1 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對小鼠皮下移植瘤模型瘤質(zhì)量和脾臟指數(shù)的影響(, n = 5)

Table 1 Effect of Xuedansu Tablets combined with doxorubicin on tumor weight and spleen index of subcutaneous tumor mice model (, n = 5)

組別劑量/(mg·kg?1)瘤質(zhì)量/g脾臟指數(shù) 模型—1.959±0.4967.832±0.180 雪膽素片5001.569±0.3146.596±0.169 阿霉素30.965±0.354*4.321±0.039* 雪膽素片＋阿霉素500＋30.366±0.249**5.429±0.049

與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01model group

3.9 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對小鼠皮下移植瘤模型心肌毒性的影響

如圖8所示，模型組和雪膽素片（500 mg/kg）組小鼠心肌細胞未見明顯病理變化；阿霉素（3 mg/kg）組小鼠心肌細胞壞死及空泡樣變化明顯；阿霉素與雪膽素片聯(lián)合使用后，小鼠心肌細胞壞死及空泡樣變化有顯著改善，表明雪膽素片與阿霉素聯(lián)合使用后能夠減輕阿霉素的心肌毒性。

4 討論

雪膽素片是由葫蘆科雪膽屬植物提取的“雪膽素”制成的口服片劑，雪膽素主要成分為雪膽甲素和雪膽乙素，以雪膽甲素為主[18]，是葫蘆素類化合物的一種。雪膽素對胃癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤均有抑制作用[19-28]。目前文獻報道的關于雪膽素抗腫瘤作用機制主要有：抑制細胞增殖和侵襲能力；阻滯細胞周期在G2/M期；誘導細胞凋亡；干擾表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路[19,26]；破壞肌動蛋白細胞骨架等[20,27]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，雪膽甲素還可以通過保護免疫系統(tǒng)和調(diào)節(jié)免疫功能抑制二甲基苯蒽誘導的小鼠乳腺腫瘤[21]；通過抑制Aurora A、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）以及Cofilin等信號通路多靶點協(xié)同抑制人肺癌細胞系NCI-H460和A549增殖并促進細胞凋亡[22]；通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）通路激活，從而抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖及其遷移能力[23]。同時，研究發(fā)現(xiàn)葫蘆素類化合物不僅在單獨用藥時表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性[24]，而且在藥物聯(lián)用方面也表現(xiàn)出一定優(yōu)勢，如葫蘆素B與吉西他濱等聯(lián)用治療胰腺癌等腫瘤，低劑量的葫蘆素E加強順鉑對乳腺癌細胞的抑制作用等[29]。盡管雪膽素在腫瘤治療中表現(xiàn)出一定的潛力，但是對于雪膽素及雪膽素片對腫瘤的治療缺乏系統(tǒng)的體內(nèi)外研究，對于其是否能作為化療輔助藥物從而減少化療藥物的使用劑量和不良反應尚未有報道。本研究發(fā)現(xiàn)雪膽素片可以抑制HepG2細胞活力，與阿霉素聯(lián)用有效抑制細胞集落的形成；細胞凋亡和周期結(jié)果顯示，聯(lián)用時低質(zhì)量濃度雪膽素片阻滯細胞周期，高質(zhì)量濃度時導致凋亡，提示雪膽素片聯(lián)合阿霉素能夠提高抗腫瘤效果。

圖7 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對小鼠皮下移植瘤模型腫瘤組織CRT和HMGB1蛋白表達的影響

圖8 雪膽素片聯(lián)合阿霉素對小鼠皮下移植瘤模型心肌毒性的影響

在阿霉素等化療藥物誘導ICD激發(fā)機體免疫系統(tǒng)抗腫瘤的過程中，DAMPs的表達起到了至關重要的作用，DAMPs通過與免疫細胞上的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）結(jié)合增強機體抗腫瘤免疫反應[30]。CRT、HMGB1、ATP是細胞免疫原性死亡的3種關鍵DAMPs。腫瘤細胞免疫原性死亡釋放的CRT，能夠被抗原呈遞細胞識別[31]，可作為一種“eat me”信號被DC細胞吞噬[32]。HMGB1能夠與DC細胞表面的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）結(jié)合，激活促炎細胞因子的產(chǎn)生，阻止DC吞噬的腫瘤抗原降解[33]。細胞外ATP被視為凋亡細胞釋放的一種“find me”的信號，既可以作為歸巢信號，也可以作為NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NOD-like receptors family pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥體的激活劑，快速募集DC細胞到腫瘤組織[34]。通過藥物聯(lián)用增強化療藥物的ICD已成為未來腫瘤研究的重要課題之一，然而雪膽素是否能夠通過與阿霉素聯(lián)用增強免疫原性死亡提高抗腫瘤活性尚未有報道。本研究中雪膽素片與阿霉素聯(lián)合處理后CRT在細胞膜表面的暴露程度與HMGB1向外分泌的程度遠高于阿霉素單用組，胞外ATP濃度也顯著增加。免疫組化結(jié)果顯示小鼠腫瘤組織內(nèi)CRT與HMGB1蛋白表達上調(diào)，提示雪膽素片與阿霉素聯(lián)合使用增強細胞ICD。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)雪膽素片與阿霉素聯(lián)用能夠促進細胞凋亡，阻滯細胞周期，以及誘導CRT與HMGB1的表達；同時增強抗腫瘤活性，提高小鼠皮下移植瘤模型脾臟指數(shù)，延長小鼠生存時間，減弱阿霉素對小鼠的心肌毒性，上調(diào)腫瘤組織內(nèi)CRT與HMGB1蛋白表達，其機制可能與促進細胞ICD有關。后續(xù)研究將聚焦于雪膽素片與阿霉素聯(lián)合使用誘導HepG2細胞的ICD過程，及其對DC細胞吞噬作用和T淋巴細胞活化程度的影響。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Anti-hepatocellular carcinoma effect of combination of Xuedansu Tablets with doxorubicin on enhancing immunogenic cell death

WANG Sen1, 2, DAI Ting-ting3, ZHONG Rong-ling2, XIA Zhi2, LUO Li-xia1, 2, NING Qing2, SONG Jie1, 2, XIE Lin1, 4

1. The Third Clinical Medical College, Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Drug Release System, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, China 3. Department of oncology, General Hospital of Easter Theater Command, Nanjing 210002, China 4. Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China

To study the synergistic effect of Xuedansu Tablets (雪膽素片) combined with doxorubicin against liver cancer, and the regulation of cell immunogenic death-related proteins expressions.The main components of Xuedansu Tablets were analyzed by high performance liquid chromatography; Effect of Xuedansu Tablets combined with doxorubicin on survival rate of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells was investigated by MTT method; Effect of Xuedansu Tablets combined with doxorubicin on colony formation of HepG2 cells was detected by plate cloning; Flow cytometry was used to analyze the effect of Xuedansu Tablets combined with doxorubicin on apoptosis rate and cell cycle of HepG2 cells; Immunofluorescence was used to detect expressions of calreticulin (CRT) and high mobility protein 1 (HMGB1) which are key indicators of immunogenic cell death; Intracellular and extracellular adenosine triphosphate (ATP) concentrations were detected by ELISA. H22tumor-bearing mice model was established to observeantitumor effect of Xuedansu Tablets combined with doxorubicin; CRT and HMGB1 expressions of tumor tissue in mice were detected by immunohistochemistry; Hematoxylin-eosin (HE) staining method was used to observe the effect of Xuedansu Tablets combined with doxorubicin on myocardial toxicity in mice.Xuedansu Tablets combined with doxorubicin had concentration-dependent cytotoxic and pro-apoptotic effects on HepG2 cells, which could promote the extracellular exposure of CRT, secretion of HMGB1 into extracellular, and increase in extracellular concentration of ATP; Xuedansu Tablets combined with doxorubicin inhibited the growth of subcutaneous transplanted tumors in H22-cell mice, improved immunity, prolonged their survival, increased the number of cells expressing CRT and HMGB1 proteins in subcutaneous tumor tissues of mice.Anti-hepatocellular carcinoma effect of Xuedansu Tablets combined with doxorubicin may be related to the regulation of immunogenic death-related proteins expressions.

Xuedansu Tablets; doxorubicin; immunogenic cell death; calreticulin; high mobility protein 1; adenosine triphosphate

R285.5

A

0253 - 2670(2022)11 - 3367 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.012

2022-02-15

國家自然科學基金資助項目（81873055）；全國中醫(yī)藥創(chuàng)新骨干人才培訓項目（19ZYCXGG-2）

王 森，碩士研究生，研究方向為中藥學。E-mail: lookforward163@163.com

謝 林，主任醫(yī)師，主要從事脊柱退行性疾病研究。E-mail: wtcm66@126.com

宋 捷，副研究員，主要從事中藥藥理抗腫瘤研究。E-mail: songjie_pharmacy@163.com

[責任編輯 李亞楠]