張玉如，田旭萍，肖 偉，王永華*

? 藥理與臨床?

基于系統(tǒng)藥理學(xué)研究水飛薊治療肺癌的作用機(jī)制

張玉如1，田旭萍1，肖 偉2*，王永華1*

1. 石河子大學(xué) 新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002 2. 江蘇康緣藥業(yè)有限公司，江蘇 連云港 222000

研究水飛薊對(duì)肺癌的作用及其機(jī)制。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）篩選水飛薊的活性成分，并利用加權(quán)整體相似度法（weighted ensemble similarity，WES）和系統(tǒng)藥物靶向工具（systematic drug targeting，SysDT）模型預(yù)測候選活性成分的靶點(diǎn)；進(jìn)行基因本體論生物學(xué)過程（gene ontology biological process，GO BP）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析揭示靶點(diǎn)所涉及BP以及通路。選取水飛薊主要活性成分水飛薊賓進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，首先驗(yàn)證水飛薊賓對(duì)人肺腺癌H1975細(xì)胞與小鼠肺癌LLC細(xì)胞的體外抑制率；其次用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估水飛薊賓對(duì)腫瘤細(xì)胞系的促凋亡作用；隨后在LLC肺癌動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)抑瘤驗(yàn)證，并檢測瘤內(nèi)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T cell，CD8+T）的浸潤量；最后通過Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。經(jīng)過篩選得到12個(gè)活性成分與355個(gè)靶點(diǎn)，并構(gòu)建了活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。CCK-8檢測結(jié)果顯示水飛薊賓能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖，且呈劑量相關(guān)性；體內(nèi)外流式實(shí)驗(yàn)表明水飛薊賓能通過促進(jìn)瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的浸潤從而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用；水飛薊賓能夠上調(diào)腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織p53蛋白表達(dá)水平（＜0.001），下調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.001）。水飛薊主要通過調(diào)控凋亡相關(guān)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

水飛薊；水飛薊賓；肺癌；系統(tǒng)藥理學(xué)；凋亡；CD8+T細(xì)胞

惡性腫瘤屬于世界性高發(fā)性疾病，不僅影響了人們的生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致患者的直接死亡。在我國，隨著人們的不良生活習(xí)慣增加，癌癥的發(fā)病率和死亡率逐年攀升，并且已經(jīng)逐步成為我國致死率最高的疾病之一。眾多癌癥中“肺癌”是目前世界公認(rèn)的“癌中之王”[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年肺癌仍然是最常見的癌癥，全年新增病例82萬例，占新增人口的17.9%[2]，全球因肺癌死亡人數(shù)為72萬人，占全球死亡人數(shù)18.1%[3]，仍是國內(nèi)致死率最高的癌癥。確診患者中85%的肺癌患者被確診為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），并且超過半數(shù)的患者被確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，存活率普遍偏低[4]。目前臨床常用的治療方式包括手術(shù)、放療、化療以及靶向治療等[5]，這些治療方式有一定的臨床療效，但在消滅癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)對(duì)患者的機(jī)體造成很大的傷害，如5%～20%的肺癌患者接受放療后出現(xiàn)肺損傷的情況，包括急性炎癥（放療后1～3個(gè)月）和慢性纖維化（放療后6～24個(gè)月）[6]；而化療有廣泛的細(xì)胞毒性，將會(huì)導(dǎo)致部分免疫細(xì)胞功能障礙等不良反應(yīng)[7]，這些不良反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致耐受力差的患者喪失性命，此外，高昂的治療費(fèi)用也會(huì)給患者家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，在治療肺癌的研究中，需要探尋新的突破點(diǎn)。

水飛薊(L.) Gaertn.屬菊科，是1年生或2年生草本植物，具有2000多年的用藥歷史[8]，其藥用部位為成熟的果實(shí)，主要化學(xué)成分為黃酮類化合物及延胡索酸，是一種優(yōu)良的護(hù)肝植物。除護(hù)肝作用外，水飛薊還具有很強(qiáng)的抗氧化作用，并且能夠調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路從而抑制炎性介質(zhì)產(chǎn)生[9]。水飛薊素是從水飛薊的種子中提取出的一種黃酮木質(zhì)素類混合物，包括水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧等活性成分[10]，水飛薊賓在水飛薊提取物中含量最高，約占60%～70%[11]，為水飛薊的主要活性成分。研究表明，水飛薊賓具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等藥理作用[12-13]。除此之外，水飛薊賓能夠通過降低表皮鳥氨酸脫羧酶的表達(dá)從而抑制腫瘤的生長[14]，因此，水飛薊除了保肝作用外還有潛在的抗腫瘤作用[15]。

隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中藥被廣泛用于治療各種疾病，但由于中藥具有多種活性成分以及多個(gè)作用靶點(diǎn)，并且不同活性成分與靶點(diǎn)間可能存在不同的對(duì)應(yīng)關(guān)系，需要研究者深入探究。為了明確中藥活性成分與靶點(diǎn)間的作用關(guān)系，一門通過計(jì)算機(jī)技術(shù)輔助的多學(xué)科結(jié)合的新興技術(shù)——系統(tǒng)藥理學(xué)[16]應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）將吸收、分布、代謝和排泄（absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME）建模技術(shù)、靶點(diǎn)預(yù)測及通路/網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)行整合，以闡明中藥復(fù)雜成分與治療靶點(diǎn)及通路之間的關(guān)系[17]。本研究首先通過系統(tǒng)藥理學(xué)方法，從多靶點(diǎn)、多層次揭示水飛薊潛在的抗腫瘤作用機(jī)制，其次通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證水飛薊是否通過增加腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T cell，CD8+T）的浸潤量而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，為水飛薊發(fā)揮抗腫瘤作用提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床抗腫瘤研究提供新思路。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1975與小鼠肺癌細(xì)胞LLC購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠20只，體質(zhì)量18～22 g，5～6周齡，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)NO.110324211102407337。動(dòng)物于溫度（25±1）℃、濕度（55±5）%的SPF級(jí)環(huán)境中，12 h光照/黑暗周期，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2021051101）。

1.3 藥品與試劑

水飛薊賓（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)M17GB148678）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)C27N11Y131954）、分散酶II（批號(hào)D20J11H118950）、透明質(zhì)酸酶（批號(hào)W11M11H109348）購自上海源葉生物有限公司；二甲基亞砜（批號(hào)161031768F）購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)8121510）、RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)8121327）、胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)B1320111）購自上海貝博公司；Qproteome?Q哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑盒（批號(hào)169011710）購自德國Qiagen公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號(hào)082820201207）、DNA酶I（批號(hào)D7073-1）、RIPA強(qiáng)裂解液（批號(hào)P0013B）、紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)C3702）購自江蘇碧云天公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號(hào)0027279）購自美國BD Pharmingen公司；Immun-Star TM WesternC TM化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)102031555）購自美國Bio-Rad公司；膠原酶IV（批號(hào)2049898）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；抗小鼠CD16/32 mAb抗體（批號(hào)20U092008212）、CD45-PE-Cy7抗體（批號(hào)B328900）、CD3e-APC抗體（批號(hào)25G091905112）、CD8a-PE抗體（批號(hào)13326019）購自美國BioLegend公司；p53抗體（批號(hào)00098490）購自美國Proteintech公司；B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體（批號(hào)GR3217999-13d）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)GR217575-65）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)GR231489-7）購自美國Abcam公司。

1.4 儀器

3131型細(xì)胞培養(yǎng)箱、Invitrogen全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國賽默飛世爾科技公司）；primo vert倒置顯微鏡（德國蔡司公司）；TDZ4-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)（中佳科技有限公司）；5418型小型高速離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；AUW120D型電子天平（日本島津公司）；組織勻漿機(jī)（上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司）；Flexstation 3多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；3208025型酶標(biāo)板振蕩器（德國IKA公司）；垂直電泳系統(tǒng)、蛋白質(zhì)小型轉(zhuǎn)印槽、多功能凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；NovoCyte 3130型流式細(xì)胞儀（ACEA Biosciences公司）；柜式冰箱（海爾股份有限公司）；超純水儀（默克密理博公司）。

2 方法

2.1 系統(tǒng)藥理學(xué)

2.1.1 水飛薊分子數(shù)據(jù)庫的建立以及靶點(diǎn)預(yù)測 首先以“水飛薊”“有效成分”等為主題詞進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集水飛薊的化學(xué)成分并構(gòu)建分子集合，然后，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的ADME系統(tǒng)計(jì)算候選分子的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）[18]≥30%以及類藥性（drug-likeness，DL）[19]≥0.18作為閾值，篩選水飛薊的潛在候選活性成分。

本研究采用的是本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的靶點(diǎn)預(yù)測工具：加權(quán)系綜相似度模型[20]（weighted ensemble similarity，WES）和系統(tǒng)藥物靶向工具（systematic drug targeting，SysDT）[21]來預(yù)測水飛薊活性成分的直接與間接靶點(diǎn)用于后續(xù)分析。

2.1.2 基因本體論生物學(xué)過程（gene ontology biological process，GO BP）富集分析 為了進(jìn)一步研究水飛薊的活性成分的潛在作用機(jī)制，利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）[22]對(duì)活性成分的靶點(diǎn)進(jìn)行GO BP與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，以＜0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為了研究活性成分-靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系以及靶點(diǎn)的功能對(duì)潛在的生物通路的調(diào)控作用，分別將篩選出的活性成分與靶點(diǎn)或靶點(diǎn)與通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件[23]并構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，在網(wǎng)絡(luò)圖中，活性成分、靶點(diǎn)、通路由節(jié)點(diǎn)表示，2個(gè)節(jié)點(diǎn)間相互作用由邊表示，相連的邊越多則表明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

2.2 水飛薊抗腫瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

水飛薊賓作為《中國藥典》2020年版中水飛薊的指標(biāo)成分，也是水飛薊的主要活性成分。因此，本研究選取水飛薊賓進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，來評(píng)估系統(tǒng)藥理學(xué)預(yù)測的可靠性與準(zhǔn)確性。

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H1975細(xì)胞和LLC細(xì)胞分別用10%胎牛血清的RPMI 1640和DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 細(xì)胞增殖檢測 將處于對(duì)數(shù)生長期的H1975和LLC細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度（5、10、20、50、80、100、150、200 μmol/L）的水飛薊賓培養(yǎng)48 h，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，空白組不接種細(xì)胞；加入CCK-8試劑，避光孵育1～4 h，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（）值，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。

細(xì)胞抑制率＝(對(duì)照－給藥)/(對(duì)照－空白)

2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析水飛薊賓對(duì)H1975細(xì)胞的凋亡作用 將處于對(duì)數(shù)生長期的H1975細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板，加入不同濃度（20、50、100 μmol/L）的水飛薊賓處理24 h，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，使其重懸在100 μL的結(jié)合緩沖液中，加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V和PI，冰上避光孵育10 min，上機(jī)檢測，使用FlowjoV10軟件分析細(xì)胞凋亡率。

2.2.4 Western blotting檢測水飛薊賓對(duì)H1975細(xì)胞p53和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 將H1975細(xì)胞以1×106接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待其貼壁后，加入不同濃度（20、50、100 μmol/L）水飛薊賓處理24 h，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，加入裂解液裂解15 min，13 800 r/min離心15 min，取上清；按BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，95 ℃加熱10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉2～3 h；分別加入p53、Bcl-2和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1.0～1.5 h；使用化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)信號(hào)進(jìn)行可視化，并用ChemiDoc? XRS+成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶分析。

2.2.5 動(dòng)物抑瘤實(shí)驗(yàn) 將LLC細(xì)胞重懸于PBS中，并以5×105個(gè)接種于小鼠左上肢腋下皮下（第0天），將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、5-Fu（15 mg/kg）組和水飛薊賓（5 mg/kg）組，每組6只。接種后第3天開始給藥，對(duì)照組ip生理鹽水，5-Fu組和水飛薊賓組ig相應(yīng)藥物，當(dāng)腫瘤達(dá)到5 mm時(shí)，每2天測量1次腫瘤體積，當(dāng)腫瘤直徑大于20 mm時(shí)判定小鼠死亡，接種后第20天對(duì)小鼠進(jìn)行取材，稱定質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

腫瘤體積＝長×寬2×0.5

2.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞 取各組小鼠腫瘤組織，剪碎至泥狀置于皿中，每個(gè)皿中加入2～3 mL消化液（1 mL HBSS緩沖液中含有1 μL的DNA酶I、20 μL的10%膠原酶IV、5 μL的10%透明質(zhì)酸酶和10 μL的5%分散酶），于37 ℃消化30 min，每10分鐘搖晃混勻1次，用4～6 mL培養(yǎng)基終止消化，過70 μm濾網(wǎng)并研磨組織，離心。加入5～8 mL紅細(xì)胞裂解液裂解5～10 min，加入30 mL PBS終止裂解，過40 μm濾網(wǎng)，離心后清洗1～2遍至無血色，重懸并計(jì)數(shù)，使100 μL細(xì)胞懸液中含有1×106個(gè)細(xì)胞，加入1 μL抗小鼠CD16/32抗體，冰上孵育10 min，用PBS洗2遍，用100 μL的PBS重懸，用CD45-PE-Cy7、CD3e-APC、CD8a-PE抗體標(biāo)記，室溫孵育30 min，用PBS洗3遍后，用500 μL PBS重懸，上機(jī)檢測。

2.2.7 Western blotting檢測水飛薊賓對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織p53和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 取各組小鼠腫瘤組織200～300 mg，加入磁珠與1 mL PBS進(jìn)行組織勻漿，1500 r/min離心5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液勻漿，于冰上裂解10～15 min，離心后棄上清，用PBS洗滌至無血色并盡量去除上清，加入RIPA強(qiáng)裂解液-磷酸酶抑制劑-蛋白酶抑制劑（100∶10∶1），冰上震蕩15 min，13 800 r/min離心15 min，取上清；按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備蛋白樣品，并進(jìn)行Western blotting分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)均采用檢驗(yàn)或方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)藥理學(xué)

3.1.1 水飛薊分子庫的構(gòu)建及有效成分的篩選及活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 首先，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出水飛薊活性成分34個(gè)，根據(jù)ADME進(jìn)行篩選，以O(shè)B≥30%以及DL≥0.18作為篩選條件，從34個(gè)活性成分中篩選得到11個(gè)潛在的活性成分；為了使結(jié)果更加全面，同時(shí)也能彌補(bǔ)理論篩選的不足，將藥動(dòng)學(xué)特性低但具有經(jīng)典藥理活性且含量較高的水飛薊賓保留下來作為有效成分[24]。最后，12個(gè)成分作為有效活性成分集合（表1）。研究發(fā)現(xiàn)，二氫槲皮素（MOL5，OB＝60.5%，DL＝0.27）又稱紫杉葉素，可以通過OCT4基因抑制肺癌干細(xì)胞的增殖與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[25]。槲皮素（MOL1，OB＝46.4%，DL＝0.28）在120 μmol/L時(shí)，能夠明顯促進(jìn)人急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞（MOLT-4）、淋巴瘤細(xì)胞（Raji）、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞（CT-26）、人前列腺癌細(xì)胞（LNCaP）等癌細(xì)胞的凋亡[26]。在前列腺癌中，水飛薊寧（MOL9，OB＝59.7%，DL＝0.76）在60 μmol/L時(shí)能夠促使前列腺癌細(xì)胞阻滯于G1期，即水飛薊寧能夠通過對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行周期阻滯從而發(fā)揮抗腫瘤作用[27]。上述研究結(jié)果均表明水飛薊具有抑制腫瘤生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并且為系統(tǒng)藥理學(xué)方法預(yù)測的有效性和合理性提供了數(shù)據(jù)支撐。

表1 水飛薊活性成分

Table 1 Active ingredients of S. marianum

MOL ID活性成分類別OB/%DL MOL1槲皮素黃酮類46.40.28 MOL2豆甾醇甾醇類43.80.76 MOL3膽固醇甾醇類37.90.68 MOL4花生四烯酸不飽和脂肪酸類45.60.20 MOL5二氫槲皮素黃酮類60.50.27 MOL6生育酚脂溶性維生素32.30.69 MOL7禾本甾醇甾醇類44.20.75 MOL8水飛薊賓黃酮類木質(zhì)素0.90.93 MOL9水飛薊寧黃酮類木質(zhì)素59.70.76 MOL10水飛薊素黃酮類木質(zhì)素81.80.80 MOL11水飛薊蘭君黃酮類木質(zhì)素64.10.94 MOL12異水飛薊素黃酮類木質(zhì)素30.30.40

接著通過WES和SysDT模型的計(jì)算共獲得12個(gè)成分的941個(gè)靶點(diǎn)，將這些靶點(diǎn)映射至比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（comparative toxicogenomics database，CTD）數(shù)據(jù)庫中，篩選出474個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，其中355個(gè)與癌癥相關(guān)的靶點(diǎn)。為了使結(jié)果更加一目了然，構(gòu)建了可視化的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖1）來進(jìn)一步揭示活性化合物的靶點(diǎn)協(xié)同治療作用。從圖中可以發(fā)現(xiàn)許多靶點(diǎn)是臨床上用于癌癥檢測與診斷的指標(biāo)。例如，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在食管癌、乳腺癌等不同形式的癌癥中高表達(dá)，并且其表達(dá)與癌癥的不良預(yù)后呈正相關(guān)[28]。TP53作為抑癌基因，在正常細(xì)胞中低表達(dá)，而在惡性腫瘤中高表達(dá)，受多種應(yīng)激源刺激而激活，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖和衰老、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞死亡基因的表達(dá)[29]。除了上述2個(gè)癌癥相關(guān)靶點(diǎn)，水飛薊活性成分的很多靶點(diǎn)也是其他腫瘤相關(guān)的靶基因。因此，通過預(yù)測靶點(diǎn)分析，可以發(fā)現(xiàn)水飛薊具有潛在的抗腫瘤作用。

3.1.2 GO BP富集分析 BP分析可以揭示候選靶點(diǎn)與生物學(xué)功能之間的關(guān)系，進(jìn)一步分析靶點(diǎn)間潛在的互作關(guān)系。因此，為了探究水飛薊靶點(diǎn)與肺癌之間的關(guān)聯(lián)性，將所得的候選靶點(diǎn)映射到DAVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了GO富集分析（＜0.01）。從圖2可以看到，獲得了14個(gè)與癌癥密切相關(guān)的BP，其中凋亡過程、正向調(diào)節(jié)凋亡過程以及細(xì)胞增殖的負(fù)向調(diào)控等過程得到顯著富集；而負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與正向調(diào)節(jié)凋亡表明該藥物在抑制癌細(xì)胞增殖的同時(shí)也能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，2個(gè)生物學(xué)過程形成了良好的協(xié)同作用。通過活性成分靶點(diǎn)的GO分析，發(fā)現(xiàn)水飛薊可能是通過參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡過程從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖1 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖2 靶點(diǎn)的GO BP富集分析

3.1.3 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò) 為了探尋靶點(diǎn)和肺癌治療相關(guān)通路間的互作關(guān)系，對(duì)水飛薊的靶點(diǎn)進(jìn)行了KEGG通路富集分析，將其關(guān)鍵靶點(diǎn)映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中，篩選出13條相關(guān)通路，并構(gòu)建了可視化的靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖3），通路包括癌癥相關(guān)通路、非小細(xì)胞肺癌相關(guān)通路、小細(xì)胞肺癌通路、病毒致癌性相關(guān)通路、癌癥中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)通路、凋亡相關(guān)通路、p53信號(hào)通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路等。富集結(jié)果再次表明水飛薊具有潛在的抗腫瘤作用，并且從圖中可以看到，p53、Bcl-2、EGFR、生長因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor bound protein 2，GRB2）等絕大多數(shù)靶點(diǎn)處于非小細(xì)胞肺癌的通路中，其可能是治療肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。上述靶點(diǎn)所映射到的通路有p53信號(hào)通路、凋亡通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路等，這些通路可能是水飛薊發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵通路。推測水飛薊可能通過影響細(xì)胞的凋亡通路，從而達(dá)到抗腫瘤作用。目前已有研究指出，姜黃素[30]、木犀草素[31]、川楝素[32]等能夠通過介導(dǎo)p53的變化誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Bcl-2家族蛋白在腫瘤細(xì)胞凋亡和腫瘤形成中發(fā)揮重要作用[33]，作為重要的凋亡調(diào)控因子，主要通過控制線粒體的完整性調(diào)控凋亡，并且在包括肺癌的多種癌癥中高表達(dá)[34]。因此，推測水飛薊可能是通過調(diào)節(jié)p53和Bcl-2的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖3 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 水飛薊賓對(duì)H1975和LLC細(xì)胞存活率的影響 如圖4所示，水飛薊賓對(duì)H1975和LLC細(xì)胞的抑制作用均呈劑量相關(guān)性，即水飛薊賓在體外能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，水飛薊賓對(duì)H1975細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值為62.58 μmol/L，對(duì)LLC細(xì)胞的IC50值為61.44 μmol/L。

圖4 水飛薊賓對(duì)H1975細(xì)胞 (A) 和LLC細(xì)胞(B) 存活率的影響

3.2.2 凋亡模塊驗(yàn)證 凋亡又名細(xì)胞程序性死亡，是細(xì)胞正常發(fā)育、應(yīng)激和形態(tài)改變過程中調(diào)控死亡的主要途徑[35]。該途徑不僅可以清除體內(nèi)多余的細(xì)胞，也能及時(shí)發(fā)現(xiàn)突變細(xì)胞防止其進(jìn)一步癌變，進(jìn)而確保機(jī)體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的平衡與質(zhì)量的穩(wěn)定[36]。細(xì)胞凋亡也是癌癥治療的關(guān)鍵過程，受許多基因如抑癌基因p53、抗凋亡基因Bcl-2的調(diào)控[37]。故推測水飛薊賓可能是通過促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。結(jié)合前期系統(tǒng)藥理學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測與富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Bcl-2、p53等靶點(diǎn)以及凋亡過程、凋亡通路等凋亡相關(guān)的靶點(diǎn)、BP及通路得到了顯著富集。因此，為了探究水飛薊賓是否促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，采用Annexin V/PI雙染對(duì)H1975細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析（圖5-A），對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為0，20、50、100 μmol/L的水飛薊賓組細(xì)胞凋亡率分別為4.24%、10.2%和25.4%，表明水飛薊賓能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，且呈劑量相關(guān)性。如圖5-B所示，與對(duì)照組比較，各給藥組細(xì)胞p53蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.001），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.001），表明水飛薊賓能夠通過調(diào)控p53和Bcl-2的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，與前期預(yù)測結(jié)果一致，也表明系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的準(zhǔn)確性與可靠性。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001，下圖同

3.2.3 水飛薊體內(nèi)抗腫瘤作用 研究顯示，CD8+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮極大的作用，當(dāng)T細(xì)胞被激活后，能夠識(shí)別位于I類組織相容性復(fù)合體上的腫瘤相關(guān)抗原[38]，主要通過2種方式誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡：一種是通過分泌一些細(xì)胞因子（如穿孔素和顆粒酶）而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡；另一種則通過死亡配體（如Fas配體或TNF相關(guān)凋亡配體）與死亡受體的結(jié)合而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[39]。另外有研究表明，腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的浸潤量與患者預(yù)后有著密不可分的關(guān)系，浸潤量越高，預(yù)后效果越好[40]。為了探究水飛薊賓的體內(nèi)抗腫瘤作用，使用C57BL/6小鼠進(jìn)行了LLC異種移植實(shí)驗(yàn)，給藥20 d后，腫瘤體積（圖6-A）和腫瘤質(zhì)量（圖6-B）顯著降低，表明水飛薊賓具有明顯的抗腫瘤作用。如圖6-C所示，與對(duì)照組比較，各給藥組腫瘤組織p53和Bcl-2蛋白表達(dá)變化與體外實(shí)驗(yàn)中變化趨勢(shì)一致。如圖6-D所示，水飛薊賓組腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的浸潤量（9.78%）高于對(duì)照組腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的浸潤量（5.27%）。綜上所述，水飛薊賓能夠通過增加腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的浸潤量從而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖6 水飛薊素對(duì)荷瘤小鼠腫瘤體積 (A)、腫瘤質(zhì)量 (B) 以及腫瘤組織p53、Bcl-2蛋白表達(dá)(C) 和CD8+ T細(xì)胞含量(D) 的影響(, n = 2)

4 討論

近年來，肺癌已逐漸變成全球癌癥相關(guān)死亡的最常見原因，占全球所有癌癥死亡人數(shù)的18.4%[41]。由于癌癥的復(fù)雜性及難治性，使得中藥在發(fā)揮抗腫瘤作用的方面受到了廣泛的關(guān)注與研究，高效低毒的特性使之極具研究與開發(fā)的潛力。

本研究通過建立水飛薊活性成分-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)相應(yīng)的生物功能和通路網(wǎng)絡(luò)探討水飛薊治療肺癌的作用機(jī)制。首先，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了含有34個(gè)活性成分的水飛薊分子數(shù)據(jù)庫，從數(shù)據(jù)庫中通過OB、DL 2個(gè)參數(shù)進(jìn)一步篩選得到12個(gè)活性成分，并構(gòu)建了活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖；接著通過WES與SysDT模型預(yù)測得到12個(gè)活性成分與癌癥相關(guān)的355個(gè)靶點(diǎn)，并通過GO BP與KEGG通路富集分析得到14個(gè)BP條目與13條相關(guān)通路，其中正向調(diào)控凋亡過程、p53信號(hào)通路、凋亡通路、Ｔ細(xì)胞受體信號(hào)通路說明水飛薊可能是通過激活CD8+T細(xì)胞并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。研究表明，CD8+T細(xì)胞抗腫瘤的主要作用機(jī)制是通過穿孔素/顆粒酶介導(dǎo)的死亡受體結(jié)合的殺傷和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[42]。

整合實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中，水飛薊賓能夠抑制肺癌細(xì)胞H1975與LLC的增殖作用，并且能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用，同時(shí)也能夠上調(diào)抑癌基因p53的表達(dá)，并且抑制Bcl-2的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，水飛薊賓能增加荷瘤小鼠腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞浸潤量，并且腫瘤組織p53與Bcl-2表達(dá)的變化與細(xì)胞水平一致，這表明水飛薊賓是通過激活T細(xì)胞并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤作用[1]。

綜上所述，本研究提供了一種基于系統(tǒng)藥理學(xué)從分子、網(wǎng)絡(luò)、通路等層面的來分析水飛薊治療肺癌的新方法，也解析了中藥的多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同治療肺癌的機(jī)制，并進(jìn)行了數(shù)據(jù)可視化分析，使得中藥的復(fù)雜成分變得更加清晰明了。本研究表明水飛薊賓主要通過促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，證實(shí)了通過系統(tǒng)藥理學(xué)所分析的相關(guān)靶點(diǎn)與通路的可靠性，并為深入探討其作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，故今后可從凋亡途徑入手，去探尋新的抗腫瘤藥物或靶點(diǎn)從而更好地協(xié)助臨床治療。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanisms ofon lung cancer based on system-pharmacology dissection

ZHANG Yu-ru1, TIAN Xu-ping1, XIAO Wei2, WANG Yong-hua1

1. Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resource and Utilization, Ministry of Education, Shihezi University, Shihezi 832002, China 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222000, China

To study the effect and mechanism ofon lung cancer.Candidate active ingredients ofwere screened out by traditional Chinese medicine systems pharmacology (TCMSP), targets were baited through weighted ensemble similarity (WES) and systematic drug targeting (SysDT) models; Gene ontology biological process (GOBP) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathways of obtained targets were then top enriched. Silybin, the main active compound of, was selected to testandexperiments. Firstly, inhibitory rate of silybin on human lung adenocarcinoma cell (H1975) and mouse lung cancer cell (LLC)was verified; Secondly, apoptosis of silybin was evaluated by flow cytometry; Tumor inhibitionwas validated in non-small cell lung cancer mouse model, infiltration of cytotoxic T cell (CD8+T) cells in tumor was detected; Finally, expressions of apoptosis-related proteins in tumor cells and tissues were verified by Western blotting.Twelve candidate active compounds and 355 targets were obtained, and compound-target network was constructed. The results of CCK-8 showed that silybin inhibited lung cancer cells in a dose-dependent manner, the data of flow cytometryandshowed that silybin could promote the apoptosis of cancer cells by promoting the infiltration of CD8+T cells in tumor cells; Silybin up-regulated p53 protein expression level in tumor cells and tumor tissues (< 0.001), and down-regulated B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) protein expression level (< 0.05, 0.001).mainly exerts anti-tumor effects through regulating apoptosis-related pathways.

(L.) Gaertn.; silybin; lung cancer; systemic pharmacology; apoptosis; CD8+T cells

R285.5

A

0253 - 2670(2022)11 - 3357 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.011

2022-02-15

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（U1603285）

張玉如，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。E-mail: 641556987@qq.com

王永華，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療腫瘤的基礎(chǔ)研究。E-mail: dcpwyh@163.com

肖 偉，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，中國工程院院士，研究方向?yàn)橹兴幩幚砼c臨床。E-mail: xw_kanion@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]