梅佳華，王 濤，查麗春，林維川，顏明麗，崔利利，馬云淑*

D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)制備復(fù)方蜘蛛香凝膠貼膏及初步藥效學(xué)考察

梅佳華1, 2，王 濤1，查麗春1，林維川1，顏明麗1，崔利利3，馬云淑1, 2*

1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500 2. 云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省南藥可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500 3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

以劑型改造為出發(fā)點(diǎn)優(yōu)選復(fù)方蜘蛛香凝膠貼膏（Compound Zhizhuxiang Gel Plaster，CZGP）處方，考察單一促滲劑與二元復(fù)合促滲劑的促滲作用，并初步考察CZGP與原處方香果健消片（Xiangguo Jianxiao Tablets，XJT）的鎮(zhèn)痛作用。以初黏力、持黏力、剝離強(qiáng)度和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)優(yōu)化凝膠貼膏處方；選擇3種常用透皮促滲劑氮酮、丙二醇、薄荷醇，以木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、橙皮苷為指標(biāo)，通過干加熱透皮系統(tǒng)評(píng)價(jià)單一促滲劑和二元復(fù)合促滲劑的促滲作用，篩選最優(yōu)促滲劑；通過小鼠（幼鼠）醋酸扭體實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)CZGP與XJT的鎮(zhèn)痛作用。CZGP的最佳處方為酒石酸1.000 g、PVP K90 6.000 g、NP700 11.000 g、甘羥鋁0.800 g、甘油35.000 g、水21.200 g；不同的一元促滲劑及二元促滲劑中，以3%丙二醇促滲作用最好，木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、橙皮苷的滲透速率分別為45.744、49.903、14.898 μg/(cm2·h)，增滲倍數(shù)分別為1.523、1.602、2.636；CZGP對(duì)小鼠（幼鼠）醋酸扭體具有鎮(zhèn)痛作用，且鎮(zhèn)痛率高于XJT。CZGP具有良好的體外經(jīng)皮滲透性及鎮(zhèn)痛作用，為中藥復(fù)方口服制劑改造為經(jīng)皮給藥制劑提供思路。

D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)；復(fù)方蜘蛛香；凝膠貼膏；體外透皮；醋酸扭體實(shí)驗(yàn)；香果健消片；藥效學(xué)；鎮(zhèn)痛；初黏力；持黏力；剝離強(qiáng)度；氮酮；丙二醇；薄荷醇；木香烴內(nèi)酯；去氫木香內(nèi)酯；橙皮苷；干加熱透皮系統(tǒng)

復(fù)方蜘蛛香由蜘蛛香、木香和草果3味中藥組成，來源于國家中藥保護(hù)品種香果健消片（Xiangguo Jianxiao Tablets，XJT）。XJT臨床用于消化不良、胸滿腹脹、氣脹飽悶和食積腹痛，療效顯著?，F(xiàn)代藥理研究表明，蜘蛛香具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛[1-2]、調(diào)節(jié)腸胃功能[3-4]等作用，木香具有鎮(zhèn)痛作用[5]、抗胃潰瘍[6]、改善結(jié)腸炎[7-8]等作用，草果具有抗炎鎮(zhèn)痛[9]、調(diào)節(jié)胃腸道功能[10]等作用，可見復(fù)方蜘蛛香在胃腸道疾病方面具有良好的開發(fā)前景。

凝膠貼膏指原料藥物與適宜的親水性基質(zhì)材料經(jīng)過混勻后，涂布于背襯材料上所制成的貼膏劑[11]。中藥凝膠貼膏在胃腸道疾病、心血管疾病等方面具有廣泛應(yīng)用[12]，能夠克服口服給藥肝臟首關(guān)效應(yīng)、用藥依從性差等缺點(diǎn)。本研究基于“劑型改造”理念和中醫(yī)“內(nèi)病外治”特色療法，將上市藥XJT改造為小兒用復(fù)方蜘蛛香凝膠貼膏（Compound Zhizhuxiang Gel Plaster，CZGP），發(fā)揮經(jīng)皮給藥制劑延長藥物作用時(shí)間、減少給藥次數(shù)、隨時(shí)停止給藥等優(yōu)點(diǎn)，以提高小兒用藥依從性和安全性。

課題組前期進(jìn)行了基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念的復(fù)方蜘蛛香提取工藝研究，本研究在此基礎(chǔ)上，采用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)優(yōu)化凝膠貼膏處方，并考察一元促滲劑和二元復(fù)合促滲劑的促滲作用，同時(shí)初步比較CZGP和XJT的鎮(zhèn)痛作用，探討劑型改造的成效性，也為上市中藥制劑劑型改造提供思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DHC-6TL型干加熱透皮系統(tǒng)，Logan公司；Agilent 1260 Series高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；初黏性測試儀、CZY-25型持黏性測試儀，濟(jì)南三泉中石實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BLD-200N型電子剝離試驗(yàn)機(jī)，濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司；Infinite F50酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司。

1.2 藥品與試劑

聚丙烯酸鈉NP700、甘油、酒石酸、聚乙烯吡咯烷酮K90（PVP K90）、氮酮、丙二醇、薄荷醇購自上海麥克林生化科技有限公司；對(duì)照品木香烴內(nèi)酯（批號(hào)111524-201911）、去氫木香內(nèi)酯（批號(hào)111524-201911）、橙皮苷（批號(hào)110721-201818），質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇，色譜純，購自默克有限公司；丁桂兒臍貼，批號(hào)20201110，購自亞寶藥業(yè)有限公司；XJT，批號(hào)200704，購自云河藥業(yè)有限公司；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）試劑盒購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；復(fù)方蜘蛛香浸膏，自制[13]。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g；家兔，雌雄各半，體質(zhì)量3.0～3.2 kg；昆明種小鼠，雄性，3周齡，體質(zhì)量15～17 g，均購自斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循云南中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 CZGP的制備

將1.000 g酒石酸溶解于21.200 g蒸餾水中，再加入6.000 g PVP K90，放置過夜，使PVP K90充分溶脹作為A相；將0.800 g甘羥鋁加入35.000 g甘油中，攪拌均勻，加入11.000 g NP700后攪拌10 min作為B相，將9.000 g復(fù)方蜘蛛香浸膏[13]加入B相，攪拌，再將A相緩慢加入到B相中攪拌均勻，涂布，于50 ℃干燥箱中干燥1 h，取出后，蓋上防黏層，即得CZGP。

2.2 CZGP評(píng)價(jià)方法的建立

查閱文獻(xiàn)評(píng)價(jià)方法[14]，選擇初黏力、持黏力、剝離強(qiáng)度和感官評(píng)分為指標(biāo)，總分為100分，其中初黏力、持黏力、剝離強(qiáng)度各20分，感官評(píng)分40分，包括透布程度、均勻性、皮膚追隨性、涂展性、反復(fù)粘貼性及膜殘留量各8分。

2.2.1 初黏力、持黏力、剝離強(qiáng)度的測定 參照《中國藥典》2020年版第四部0952黏附力測定法一、二、三法進(jìn)行測定[15]。初黏力根據(jù)黏住的最大鋼球球號(hào)進(jìn)行評(píng)分，持黏力根據(jù)凝膠貼膏脫落時(shí)間進(jìn)行評(píng)分，剝離強(qiáng)度根據(jù)儀器讀數(shù)進(jìn)行評(píng)分。

得分＝(測得值/最大值)×20

2.2.2 感官評(píng)分 查閱文獻(xiàn)評(píng)價(jià)方法[16-17]，以透布程度、均勻性、皮膚追隨性、涂展性、反復(fù)粘貼性與膜殘留量多指標(biāo)綜合評(píng)分為感官評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官指標(biāo)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

Table 1 Scoring standard of sensory index

指標(biāo)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 透布程度根據(jù)膏體透過背襯材料的程度分為8個(gè)等級(jí)：1～8分 均勻性根據(jù)膏體分散均勻程度分為8個(gè)等級(jí)：1～8分 皮膚追隨性將凝膠貼膏貼敷于手腕，用力甩動(dòng)10次，根據(jù)是否能夠緊密貼于手腕的程度分為8個(gè)等級(jí)：1～8分 涂展性根據(jù)是否易于涂布分為8個(gè)等級(jí)：1～8分 反復(fù)粘貼性及膜殘留量將凝膠貼膏反復(fù)粘貼于手背部，重復(fù)3次，根據(jù)膏體在手背處殘留的程度分為8個(gè)等級(jí)：1～8分

2.3 CZGP處方優(yōu)化

2.3.1 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì) 單因素考察確定了最佳輔料種類及用量范圍，并確定復(fù)方蜘蛛香浸膏用量為9 g。采用Design-Expert軟件進(jìn)行D-最優(yōu)混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定輔料總量為75 g（10貼），以透布程度（1）、均勻性（2）、皮膚追隨性（3）、涂展性（4）、反復(fù)粘貼性及膜殘留量（5）、初黏力（6）、持黏力（7）、剝離強(qiáng)度（8）評(píng)分為指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2、3。

表2 D-最優(yōu)混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table 2 Design of D-optimal mixture experiment

因素基質(zhì)種類最高用量/g最低用量/g A酒石酸1.4001.000 BPVPK905.0004.000 CNP70013.00011.000 D甘羥鋁0.8000.200 E甘油41.00037.000 F水26.00020.000

2.3.2 模型擬合 采用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合得到方程＝326.80 A＋39.79 B＋72.77 C＋10.76 D＋38.15 E＋56.88 F，＝0.023 3＜0.05，模型具有顯著性，失擬項(xiàng)不顯著，說明模型準(zhǔn)確可靠。

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 模型預(yù)測最優(yōu)處方為酒石酸1.000 g、PVP K90 6.000 g、NP700 11.000 g、甘羥鋁0.800 g、甘油35.000 g、水21.200 g，綜合評(píng)分為76.3。結(jié)果（表4）可見，最優(yōu)處方綜合評(píng)分與預(yù)測值接近，表明D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)具有良好的預(yù)測性。

2.4 皮膚刺激性考察

根據(jù)《中藥、天然藥物局部刺激性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，選取健康家兔8只，雌雄各半，給藥前24 h褪去脊柱兩側(cè)的兔毛。隨機(jī)分為完整皮膚組和破損皮膚組，采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法進(jìn)行皮膚刺激性試驗(yàn)。在2組動(dòng)物的左側(cè)敷貼CZGP，右側(cè)敷貼空白凝膠貼膏，醫(yī)用膠布固定。給藥24 h后除去凝膠貼膏，在1、24、48、72 h觀察給藥部位皮膚反應(yīng)，根據(jù)指導(dǎo)原則評(píng)分細(xì)則：“無紅斑”0分，“無水腫”0分，“無刺激性”0～0.49分。結(jié)果8只家兔均未出現(xiàn)紅斑及水腫，總評(píng)分為0分，表明CZGP無刺激性。

2.5 木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量測定方法的建立

2.5.1 色譜條件 色譜柱Zorbax Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（70∶30）；檢測波長225 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL[18]。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為18.27、17.68 mg/mL的儲(chǔ)備液，分別精密吸取儲(chǔ)備液2.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，即得對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取CZGP 6 h透皮接收液，即為供試品溶液。

2.5.4 陰性樣品溶液的制備 取空白凝膠貼膏6 h透皮接收液，即為陰性樣品溶液。

2.5.5 專屬性考察 分別將對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯與其他組分色譜峰均達(dá)到基線分離，陰性樣品溶液無干擾（圖1）。

2.5.6 線性關(guān)系考察 精密稱取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品適量，分別配制成系列對(duì)照品溶液，按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程為木香烴內(nèi)酯＝4.414 2－18.973，2＝0.999 8，線性范圍1.90～609.00 μg/mL；去氫木香內(nèi)酯＝2.920 6－11.737，2＝0.999 8，線性范圍1.84～589.00 μg/mL。

表3 D-最優(yōu)混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 3 Design and results of D-optimal mixture experiment

試驗(yàn)號(hào)基質(zhì)用量/g評(píng)分 ABCDEFY1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8Y總 11.4006.00013.0000.20034.40020.0007234318.80.712.951.3 21.0004.00011.0000.20032.80026.0007462518.812.35.060.1 31.0004.00011.5290.80035.00022.6717667618.88.25.564.4 41.1205.25912.4040.20032.39323.6257432318.80.67.846.1 51.1664.00013.0000.80033.02523.0107544418.118.910.171.1 61.1654.90011.0000.58833.35623.9917657418.816.35.369.4 71.1975.93511.5180.80031.13424.4177531018.80.816.652.1 81.4006.00011.2080.80033.78521.8077262519.40.814.456.6 91.0005.46011.0000.20035.00022.3407777819.43.720.079.1 101.4005.57312.0720.53932.75622.6607363518.81.615.359.6 111.4004.87513.0000.80034.92520.0007332318.81.513.051.3 121.0004.00012.1850.20033.92023.6957656519.413.74.967.0 131.4004.00011.0000.80031.80026.0007777518.820.03.675.3 141.4006.00011.0000.80035.00020.8007464620.01.310.458.7 151.1906.00012.2370.57335.00020.0007474720.00.813.363.1 161.1906.00012.2370.57335.00020.0007676719.41.114.167.6 171.1654.90011.0000.58833.35623.9917233518.80.86.746.3 181.4004.66412.7620.80031.39123.983723425.63.84.031.5 191.1654.90011.0000.58833.35623.9917867419.43.16.561.0 201.0004.33713.0000.36635.00021.2967777718.89.09.472.2 211.0006.00011.0000.35131.25525.3947787818.86.613.375.7 221.0006.00013.0000.80033.35320.8477776818.81.614.469.7 231.0004.66212.3330.67331.00025.333735525.06.19.142.1 241.4004.78311.7730.65634.92021.468767635.01.910.546.4 251.4005.57312.0720.53932.75622.660755435.01.314.044.3 261.4005.40011.0000.20031.00026.000734348.81.16.737.5 271.4004.00011.5090.32735.00022.764767675.09.34.752.0 281.1205.25912.4040.20032.39323.6257676618.83.46.961.1 291.4004.00013.0000.21031.30825.083733245.010.83.938.7 301.2756.00013.0000.56831.00023.1577554718.81.714.062.4 311.0004.00012.0500.32732.76824.855765765.07.75.949.7

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 4 Verification experiment results

實(shí)驗(yàn)號(hào)評(píng)分偏差/% Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8Y總 17777818.81.62076.40.1 27877818.81.72077.41.5 37877718.82.72077.51.6

2.5.7 精密度考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得木香烴內(nèi)酯RSD為0.18%，去氫木香內(nèi)酯RSD為0.20%，表明儀器精密度良好。

2.5.8 穩(wěn)定性考察 取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣分析，測得木香烴內(nèi)酯RSD為0.42%，去氫木香內(nèi)酯RSD為0.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 混合對(duì)照品溶液(A)、供試品溶液(B) 和陰性樣品溶液(C) 的HPLC圖

2.5.9 重復(fù)性考察 精密量取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液，平行操作6份，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測得木香烴內(nèi)酯RSD為0.14%，去氫木香內(nèi)酯RSD為0.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.10 加樣回收率考察 精密量取已測定的供試品溶液9份，分別加入樣品含量50%、100%、150%對(duì)照品溶液各3份，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測得木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為103.71%、102.75%，RSD分別為0.77%、0.35%，符合要求。

2.6 橙皮苷含量測定方法的建立

2.6.1 色譜條件 色譜柱Zorbax Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（26∶74）；檢測波長283 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL[18]。

2.6.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度18.27 mg/mL的儲(chǔ)備液，精密吸取儲(chǔ)備液2.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，即得對(duì)照品溶液。

2.6.3 供試品溶液和陰性樣品溶液的制備 同“2.5.3”“2.5.4”項(xiàng)下制備方法。

2.6.4 專屬性考察 分別將對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，橙皮苷與其他組分色譜峰均達(dá)到基線分離，陰性樣品溶液無干擾（圖2）。

圖2 對(duì)照品溶液(A)、供試品溶液(B) 和陰性樣品溶液(C)的HPLC圖

2.6.5 線性關(guān)系考察 精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量配制系列對(duì)照品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程＝2.755 5＋0.006 2，2＝0.999 5，線性范圍為1.320～42.225 μg/mL。

2.6.6 精密度考察 精密吸取橙皮苷對(duì)照品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得橙皮苷RSD為0.50%，表明儀器精密度良好。

2.6.7 穩(wěn)定性考察 取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣分析，測得橙皮苷RSD為1.47%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.8 重復(fù)性考察 精密量取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液，平行操作6份，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測得橙皮苷RSD為2.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.9 加樣回收率考察 精密量取已測定的供試品溶液9份，分別加入樣品含量50%、100%、150%對(duì)照品溶液各3份，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測得橙皮苷平均加樣回收率為100.19%，RSD為0.96%，符合要求。

2.7 體外透皮實(shí)驗(yàn)

2.7.1 離體皮膚的準(zhǔn)備 SD大鼠，雄性，脫頸椎處死后，立即剪下腹部皮膚，分離皮下組織及脂肪，用生理鹽水沖洗干凈，選用無破損皮膚保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7.2 透皮實(shí)驗(yàn) 取大鼠皮膚并解凍，固定在干加熱自動(dòng)透皮系統(tǒng)一端，使皮膚表層面向供給室，放置適合大小CZGP，接收室內(nèi)注滿30%乙醇生理鹽水，使與真皮層密切接觸，恒溫于（32.0±0.5）℃，600 r/min磁力攪拌，分別在1、2、4、6、8、10、12、24 h將接收液全部取出，并補(bǔ)滿原溶液體積。接收液測定木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯和橙皮苷含量，比較氮酮、丙二醇、薄荷醇單一促滲劑和二元復(fù)合促滲劑的促滲作用。計(jì)算單位面積累積滲透量（）、滲透速率（）、增滲倍數(shù)（ER），繪制-曲線，結(jié)果見圖3和表5～7。

ER＝s/o[20]

為接收液體積，C為第個(gè)取樣點(diǎn)測定的藥物質(zhì)量濃度，為擴(kuò)散池滲透面積，s為加入促滲劑后穩(wěn)態(tài)透皮速率，o為未加透皮促滲劑的穩(wěn)態(tài)透皮速率

結(jié)果表明，3%丙二醇對(duì)木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯促滲作用最好，24 h累積滲透量24、滲透速率ss和增滲倍數(shù)ER均為最高。1%氮酮＋1%薄荷醇對(duì)橙皮苷的促滲作用最好，3%丙二醇次之。綜合3種成分選擇3%丙二醇作為促滲劑。

2.8 醋酸扭體實(shí)驗(yàn)

將40只昆明種小鼠（幼鼠）隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為模型組、丁桂兒臍貼組、XJT組、CZGP組。模型組給予空白凝膠貼膏，陽性對(duì)照組給予丁桂兒臍貼，XJT組ig 0.56 mg/g XJT（木香烴內(nèi)酯13.35 mg/片、去氫木香內(nèi)酯12.44 mg/片、橙皮苷0.42 mg/片），凝膠貼膏組給予2 cm×2 cm CZGP（木香烴內(nèi)酯2.56 mg/貼、去氫木香內(nèi)酯3.77 mg/貼、橙皮苷11.53 mg/貼），臍部給藥，醫(yī)用膠布固定，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥2 h后，ip 0.7%冰醋酸10 mL/kg，觀察小鼠潛伏期及15 min內(nèi)扭體次數(shù)，并計(jì)算鎮(zhèn)痛率，檢測小鼠血清中PGE2水平，結(jié)果見表8。

鎮(zhèn)痛率＝(模型組平均扭體次數(shù)－給藥組平均扭體次數(shù))/模型組平均扭體次數(shù)

與模型組相比，各給藥組均顯著延長潛伏期，減少扭體次數(shù)（＜0.05），凝膠貼膏組與XJT組扭體次數(shù)無顯著性差異；各給藥組血清中PGE2含量相較于模型組顯著降低（＜0.05），推測其鎮(zhèn)痛作用可能與抑制體內(nèi)促炎因子PGE2的釋放有關(guān)。

表5 不同促滲劑木香烴內(nèi)酯體外Q-t模型擬合方程(,n = 4)

Table 5 Fitting equation of cumulative penetration models of costunolide with different penetration enhancers in vitro (, n = 4)

促滲劑擬合方程R2滲透速率/(μg·cm?2·h?1)ERQ24/(μg?cm?2) 對(duì)照Q＝30.032 t＋41.6470.990 930.032-469.87±45.95 1%氮酮Q＝32.084 t＋32.0670.995 532.0841.068512.25±13.77 3%氮酮Q＝30.210 t＋30.9730.995 930.2101.006487.09±20.58 5%氮酮Q＝28.506 t＋32.4700.995 328.5060.949456.73±25.95 2%丙二醇Q＝42.107 t＋55.7680.986 242.1071.402680.68±27.04** 3%丙二醇Q＝45.744 t＋46.3570.989 945.7441.523731.48±29.46** 5%丙二醇Q＝42.487 t＋56.7070.990 542.4871.415679.33±37.55** 1%薄荷醇Q＝45.047 t＋44.2170.992 045.0471.486723.63±23.79** 3%薄荷醇Q＝37.387 t＋33.5920.993 837.3871.245593.60±14.32** 5%薄荷醇Q＝32.127 t＋37.3030.994 632.1271.070533.30±26.86** 1%氮酮＋3%丙二醇Q＝39.543 t＋34.6220.995 039.5431.317626.07±22.53** 1%薄荷醇＋3%丙二醇Q＝44.648 t＋42.7890.991 544.6481.487699.32±17.89** 1%氮酮＋1%薄荷醇Q＝44.883 t＋33.3220.994 744.8831.495714.71±21.96**

與對(duì)照組比較：**＜0.01，下表同

**< 0.01control group, same as below

表6 不同促滲劑去氫木香內(nèi)酯體外Q-t模型擬合方程(,n = 4)

Table 6 Fitting equation of cumulative penetration models of dehydrocostus lactone with different penetration enhancers in vitro (, n = 4)

促滲劑擬合方程R2滲透速率/(μg·cm?2·h?1)ERQ24/(μg·cm?2) 對(duì)照Q＝31.150 t＋40.1040.991 531.150-486.12±60.02 1%氮酮Q＝32.084 t＋32.0670.995 532.0841.030513.11±16.67 3%氮酮Q＝30.050 t＋28.6630.996 330.0500.965488.28±23.05 5%氮酮Q＝28.261 t＋32.5890.995 028.2610.907457.20±23.72 2%丙二醇Q＝47.617 t＋56.1870.986 947.6171.529762.78±29.80** 3%丙二醇Q＝49.903 t＋44.0140.990 149.9031.602814.78±29.36** 5%丙二醇Q＝46.931 t＋54.3120.991 446.9311.507746.90±42.48** 1%薄荷醇Q＝49.766 t＋42.5420.992 849.7661.600802.86±28.46** 3%薄荷醇Q＝39.100 t＋30.4810.994 139.1001.255624.85±20.97** 5%薄荷醇Q＝33.003 t＋35.0100.994 933.0031.060558.71±37.87** 1%氮酮＋3%丙二醇Q＝41.190 t＋30.7260.995 441.1901.322648.40±27.66** 1%薄荷醇＋3%丙二醇Q＝47.907 t＋40.3760.991 247.9071.538755.87±27.17** 1%氮酮＋1%薄荷醇Q＝48.900 t＋32.3110.994 148.9001.570779.30±36.19**

3 討論

3.1 處方評(píng)價(jià)及優(yōu)化

凝膠貼膏具有載藥量大、皮膚相容性好、改善角質(zhì)層水化作用等優(yōu)勢，制備工藝簡單，但因藥物不同會(huì)導(dǎo)致凝膠貼膏黏性和涂布性發(fā)生變化，因此沒有成熟工藝供不同性質(zhì)的藥物使用。同時(shí)凝膠貼膏基質(zhì)種類多，理化性質(zhì)不同，加入順序?qū)Τ尚托院屯坎夹砸埠荜P(guān)鍵。故通過查閱文獻(xiàn)[21-24]，從多種制備方法中優(yōu)選出最佳工藝，并通過單因素考察確定基質(zhì)種類和用量范圍。

常用優(yōu)化方法包括正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、響應(yīng)面法和D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)等。正交設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，忽略了各因素之間的交互作用，而凝膠貼膏各基質(zhì)之間的作用，影響交聯(lián)速度和膏體內(nèi)聚力等；均勻設(shè)計(jì)法因?qū)嶒?yàn)次數(shù)大幅減少，準(zhǔn)確性和預(yù)測性均較差；響應(yīng)面法采用多元二次方程回歸來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過模型擬合來尋找最優(yōu)工藝或處方；D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)固定各基質(zhì)總量不變，預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確性高，更適合凝膠貼膏的處方優(yōu)化。因此本實(shí)驗(yàn)選擇D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化凝膠貼膏處方。

表7 不同促滲劑橙皮苷體外Q-t模型擬合方程(,n = 4)

Table 7 Fitting equation of cumulative penetration models of hesperidin with different penetration enhancers in vitro(, n = 4)

促滲劑擬合方程R2滲透速率/(μg·cm?2·h?1)ERQ24/(μg·cm?2) 對(duì)照Q＝5.652 t＋2.6650.996 05.652-103.71±38.51 1%氮酮Q＝12.803 t＋5.1640.993 212.8032.265233.19±18.68** 3%氮酮Q＝10.822 t＋4.9540.996 310.8221.915212.64±28.69** 5%氮酮Q＝10.416 t＋1.5960.998 910.4161.843217.87±40.74** 2%丙二醇Q＝14.824 t＋3.6630.994 714.8242.623256.19±22.65** 3%丙二醇Q＝14.898 t＋5.3870.990 914.8982.636263.45±32.06** 5%丙二醇Q＝11.696 t＋5.7120.995 111.6962.069240.26±25.19** 1%薄荷醇Q＝12.663 t＋0.5360.995 712.6632.240234.11±8.75** 3%薄荷醇Q＝13.576 t＋0.5650.993 813.5762.402248.81±18.19** 5%薄荷醇Q＝12.016 t＋4.0100.996 512.0162.126246.72±34.34** 1%氮酮＋3%丙二醇Q＝14.585 t＋1.2760.993 514.5852.581255.70±35.69** 1%薄荷醇＋3%丙二醇Q＝13.800 t＋6.3580.992 513.8002.442247.27±37.46** 1%氮酮＋1%薄荷醇Q＝17.744 t－0.0560.994 417.7443.139317.76±28.42**

表8 CZGP對(duì)小鼠醋酸扭體的影響(,n = 10)

Table 8 Effect of CZGP on acetic acid writhing in mice(, n = 10)

組別潛伏期/s扭體次數(shù)/次鎮(zhèn)痛率/%PGE2/(pg?mL?1) 模型132±16c83±10a-397.100±8.035a 丁桂兒臍貼242±37b55±17b37.20211.400±5.187c XJT385±162a40±10c54.19262.200±8.742b CZGP257±62b39±4c57.75259.700±8.006b

不同小寫字母表示彼此之間具有顯著性差異（＜0.05）

different lowercase letters indicate significant differences between them (< 0.05)

3.2 體外透皮研究

CZGP是由中藥復(fù)方提取物制成，成分多樣復(fù)雜，選擇合理的質(zhì)量指標(biāo)至關(guān)重要。復(fù)方蜘蛛香中蜘蛛香為君藥，消食健胃、理氣止痛，木香為臣藥，加強(qiáng)蜘蛛香理氣止痛、消食之功效，草果既作佐藥，又作使藥，助君藥、臣藥理氣止痛之功效，并制約其苦寒之性；且君藥中橙皮苷含量與鎮(zhèn)痛作用成正相關(guān)[25]，臣藥中木香烴內(nèi)酯與去氫木香內(nèi)酯為指標(biāo)性成分，因此選擇木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯和橙皮苷作為指標(biāo)成分。

經(jīng)皮滲透速率是凝膠貼膏的關(guān)鍵問題，滲透速率直接影響其藥效，因此，選擇合理有效的促滲劑非常重要。氮酮、丙二醇和薄荷醇是常用的促滲劑，本實(shí)驗(yàn)選取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、橙皮苷3種主要成分，能夠較全面的反映全方整體促滲效果。木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯相對(duì)分子質(zhì)量較小，脂溶性強(qiáng)，具有一定的透皮效果，透皮速率分別為30.032、31.151 μg/(cm2·h)，當(dāng)加入3%丙二醇時(shí)促滲作用最強(qiáng)，增滲倍數(shù)分別為1.523、1.602。橙皮苷相對(duì)分子質(zhì)量較大，透皮速率為5.652 μg/(cm2·h)，促滲作用較強(qiáng)的分別是1%氮酮＋1%薄荷醇和3%丙二醇，綜合3種成分選擇3%丙二醇作為促滲劑。

此外透皮接收液中3種成分的含量測定選擇《中國藥典》2020年版中2種方法并進(jìn)行調(diào)整。實(shí)驗(yàn)摸索同時(shí)測定透皮接收液中3種成分的方法過程中，選擇不同波長進(jìn)行測定，當(dāng)在215 nm時(shí)能夠同時(shí)檢測到3種成分，但方法重復(fù)性不好，且因?yàn)椴ㄩL太小導(dǎo)致基線無法平衡，故選擇兩種方法進(jìn)行3種成分的含量測定。

3.3 初步藥效學(xué)研究

本實(shí)驗(yàn)中丁桂兒臍貼、XJT、CZGP的鎮(zhèn)痛率分別為37.20%、54.19%、57.75%，可見凝膠貼膏鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于陽性藥與XJT。疼痛的發(fā)生發(fā)展與炎性反應(yīng)有密切關(guān)系，當(dāng)機(jī)體組織受到有害物質(zhì)刺激形成損傷時(shí)，組織細(xì)胞釋放炎性因子，通過細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路導(dǎo)致PGE2等疼痛介質(zhì)釋放，從而發(fā)動(dòng)和傳遞痛覺信號(hào)[26]，各給藥組血清中PGE2水平均顯著少于模型組，推測其鎮(zhèn)痛作用可能與抑制體內(nèi)PGE2的釋放有關(guān)。CZGP與XJT在幼鼠均表現(xiàn)出較好的鎮(zhèn)痛作用，可見劑型改造表現(xiàn)出一定的成效，關(guān)于CZGP與XJT的其他作用還需進(jìn)一步研究。

志謝：LOGAN公司提供DHC-6TL型干加熱透皮系統(tǒng)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Sah S P, Mathela C S, Chopra K. Elucidation of possible mechanism of analgesic action ofDC chemotype (patchouli alcohol) in experimental animal models [J]., 2010, 48(3): 289-293.

[2] Li Y S, Zhang J, Tian G H,. Kirenol, darutoside and hesperidin contribute to the anti-inflammatory and analgesic activities ofMakino by inhibiting COX-2 expression and inflammatory cell infiltration [J]., 2021, 268: 113547.

[3] Wang Y, Shi D Q, Jiang N,. A new acylated iridoid and other chemical constituents fromand their biological activities [J]., 2021, doi: 10.1080/14786419.2021.1961255.

[4] Zhang B, Wang Y, Jiang C M,.Jones inhibits Rotavirus-induced diarrhea via phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway [J]., 2021, 31(8): 1115-1122.

[5] Jo H G, Lee G Y, Baek C Y,. Analgesic and anti- inflammatory effects ofroot extracts on acetic acid-induced writhing in mice and monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis in rats [J]., 2020, 10(1): E42.

[6] Zheng H, Chen Y L, Zhang J Z,. Evaluation of protective effects of costunolide and dehydrocostuslactone on ethanol-induced gastric ulcer in mice based on multi- pathway regulation [J]., 2016, 250: 68-77.

[7] Lv Q, Xing Y, Dong D,. Costunolide ameliorates colitis via specific inhibition of HIF1α/glycolysis- mediated Th17 differentiation [J]., 2021, 97: 107688.

[8] Xie F, Zhang H, Zheng C,. Costunolide improved dextran sulfate sodium-induced acute ulcerative colitis in mice through NF-κB, STAT1/3, and Akt signaling pathways [J]., 2020, 84: 106567.

[9] Lee K Y, Kim S H, Sung S H,. Inhibitory constituents of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in BV2 microglia isolated from Amomum tsao-ko [J]., 2008, 74(8): 867-869.

[10] 楊小方. 草果揮發(fā)油提取工藝及藥理作用的研究 [D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[11] 李真真, 萬玲娟, 王繼龍, 等. 溫度與時(shí)間對(duì)祖師麻后交聯(lián)凝膠貼膏流變學(xué)特性影響研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(13): 3457-3464.

[12] 朱敏豐, 朱瑤, 朱潔, 等. 中藥凝膠貼膏的臨床應(yīng)用研究概況 [J]. 海峽藥學(xué), 2021, 33(2): 113-116.

[13] 梅佳華, 崔利利, 郝佳旭, 等. 基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念的復(fù)方蜘蛛香醇提工藝研究 [J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2022, 42(8): 774-780.

[14] 張瑩瑩, 劉偉, 周文杰, 等. 少腹逐瘀凝膠貼膏劑基質(zhì)處方優(yōu)化及體外透皮特性研究 [J]. 中草藥, 2018, 49(18): 4284-4292.

[15] 中國藥典 [S]. 四部. 2020: 143-144.

[16] 許潤春, 賀亞男, 裴瑾, 等. 川烏-花椒揮發(fā)油凝膠貼膏的成型工藝及配伍增效機(jī)制研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(6): 1517-1529.

[17] 黃洋揚(yáng), 鄭昊圳, 王圣鑫, 等. 復(fù)方活血凝膠貼膏劑基質(zhì)處方及制備工藝的研究 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2020, 31(2): 241-245.

[18] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 63-64, 199-200.

[19] 張衛(wèi)華, 胡杰, 吳珍珍, 等. 不同促滲劑對(duì)馬錢子堿囊泡凝膠體外滲透性能的影響 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2015, 21(7): 14-16.

[20] 曾令軍, 莊珊珊, 黃愛文, 等. 不同促滲劑對(duì)鹽酸氨酮戊酸原位凝膠體外透皮吸收的影響 [J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2017, 37(12): 1167-1170.

[21] 肖宇碩. 復(fù)方吳茱萸水凝膠貼劑的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 [D]. 武漢: 湖北中醫(yī)藥大學(xué), 2019.

[22] 章燁雯. 小兒退熱凝膠貼膏的制備工藝與評(píng)價(jià)研究 [D]. 北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2016.

[23] 萬玲娟, 周廣芬, 王繼龍, 等. 載藥量對(duì)后交聯(lián)祖師麻凝膠貼膏劑流變學(xué)及體外經(jīng)皮滲透特性的影響 [J]. 中草藥, 2021, 52(19): 5873-5878.

[24] 李艷. 痛風(fēng)清凝膠貼膏的研制及其體外經(jīng)皮滲透研究 [D]. 昆明: 云南中醫(yī)學(xué)院, 2018.

[25] 張順然. 不同產(chǎn)地蜘蛛香鎮(zhèn)痛組分對(duì)比研究 [D]. 貴陽: 貴州大學(xué), 2019.

[26] 吳麗, 王麗麗, 費(fèi)文婷, 等. 芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷對(duì)小鼠疼痛模型的鎮(zhèn)痛作用及對(duì)β-EP、PGE2的影響 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2018, 33(3): 915-918.

Pharmaceutical research of Compound Zhizhuxiang Gel Plaster by D-optimal mixture design

MEI Jia-hua1, 2, WANG Tao1, ZHA Li-chun1, LIN Wei-chuan1, YAN Ming-li1, CUI Li-li3, MA Yun-shu1, 2

1. Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China 2. Key Laboratory of External Drug Delivery System and Preparation Technology of University, Yunnan Key Laboratory of Dai and Yi Medicine, Yunnan Key Laboratory of Southern Medicinal Resource, Kunming 650500, China 3. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To optimize of the best prescription of Compound Zhizhuxiang Gel Plaster (復(fù)方蜘蛛香凝膠貼膏, CZGP) based on dosage form transformation, and investigated the penetration promotion effects of single and binary compound penetration enhancers, and the analgesic effects of gel plaster and Xiangguo Jianxiao Tablets (香果健消片, XJT).Using initial adhesion, adhesion holiding, peeling strength and sensory score as evaluation indexes, the optimal prescription was optimized by D-optimal mixture design. Three commonly used transdermal enhancers, azone, propylene glycol and menthol, were selected. With costunolide, dehydrocostus lactone and hesperidin as indicators, the permeation promotion effects of single and binary compound enhancers were evaluated by dry heating transdermal system and screened the best penetration enhancers. The analgesic effect of CZGP and XJT was preliminarily evaluated by acetic acid writhing experiment in mice (young mice).The best prescription of CZGP was tartaric acid 1.000 g, PVPK90 6.000 g, NP700 11.000 g, aluminum glycolate 0.800 g, glycerin 35.000 g and water 21.200 g; 3% propylene glycol is the best one for different monobasic and binary penetration enhancers, and the penetration rates of costunolide, dehydrocostus lactone and hesperidin were 45.744, 49.903 and 14.898 μg/(cm2·h), and the enhancement ratios were 1.523, 1.602 and 2.636, respectively. CZGP had analgesic effect on acetic acid writhing in mice (young mice), and the analgesic rate was better than XJT.CZGP has good transdermal permeability and analgesic effect, which provides ideas for transforming compound oral preparations of traditional Chinese medicine into transdermal preparations.

D-optimal mixture design; Compound Zhizhuxiang; gel paste;transdermal; acetic acid twisting experiment; Xiangguo Jianxiao Tablets; pharmacodynamics; analgesia; initial adhesion force; the adhesion force; peel strength; azone; propylene glycol; menthol; costunolide; dehydroxylinolactone; hesperidin; dry heating through skin system

R283.6

A

0253 - 2670(2022)11 - 3329 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.008

2021-12-26

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82174065）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82060723）；云南省科技廳-云南中醫(yī)學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)項(xiàng)目（2018FF001）；云南省科學(xué)技術(shù)院重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目（202002AA100007）

梅佳華（1996—），男，山西長治人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)。Tel: 13546167274 E-mail: Highwaydo@163.com

馬云淑，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥新劑型與新技術(shù)的研究。E-mail: yunshuma2@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]