王 靜，姚長(zhǎng)良，張建青，李佳媛，姚 帥，果德安*

基于UPLC-Q-TOF-MS的人參配方顆?；瘜W(xué)成分及指紋圖譜研究

王 靜1, 2，姚長(zhǎng)良2，張建青2，李佳媛2，姚 帥2，果德安1, 2*

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所 中藥標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)國(guó)家工程研究中心，上海 201203

采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS）對(duì)人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分進(jìn)行快速表征，闡明人參配方顆粒的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，并建立指紋圖譜方法對(duì)人參配方顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制。采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在正、負(fù)離子模式下分別采集人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過(guò)MS DIAL軟件輔助解析、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和對(duì)照品比對(duì)等方法快速分析人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分。并采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），乙腈-0.01%磷酸水溶液為流動(dòng)相，建立人參配方顆粒指紋圖譜方法。從人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑中共鑒定出57個(gè)化合物，包括皂苷25個(gè)、氨基酸及其衍生物12個(gè)、堿基及核苷5個(gè)、其他類成分15個(gè)。建立的人參配方顆粒指紋圖譜有8個(gè)共有峰，分別為人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rc、Ro、Rb1、Rb2、Rd。指紋圖譜方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，不同廠家不同批次人參配方顆粒的成分基本相同，僅含量上存在一定差異。該研究基本闡明了人參配方顆粒的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，建立的指紋圖譜方法為人參配方顆粒的質(zhì)量控制提供了方法參考。

人參配方顆粒；指紋圖譜；UPLC-Q-TOF-MS；高效液相色譜；人參皂苷；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rf；人參皂苷Rc

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成，具有便攜、易于貯存和使用等特點(diǎn)，是對(duì)傳統(tǒng)中藥飲片的補(bǔ)充[1-3]。雖然中藥配方顆粒已經(jīng)獲得廣泛的應(yīng)用，但其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究仍然滯后。人參為五加科人參屬植物C. A. Mey.的干燥根及根莖[4]。由于其具有大補(bǔ)元?dú)?、除邪明目和益智安神等功效，是常用的補(bǔ)益要藥[5-6]。目前，對(duì)于人參藥材化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)已有深入研究，主要含有皂苷、糖、揮發(fā)性成分、脂、蛋白質(zhì)及甾醇類等成分[7-11]，其中皂苷類成分研究最多，Zuo等[12]從人參中鑒定了286個(gè)人參皂苷。人參配方顆粒應(yīng)用廣泛，其由人參經(jīng)水提制得，化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)與人參藥材存在明顯差異。但目前人參配方顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)研究鮮有報(bào)道，因此也阻礙了科學(xué)可行的人參配方顆粒質(zhì)量控制方法的構(gòu)建。本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、對(duì)照品比對(duì)和MS DIAL軟件輔助解析等方法快速分析人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分，并建立人參配方顆粒的指紋圖譜方法，從而達(dá)到控制人參配方顆粒質(zhì)量的目的。

1 儀器與材料

Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、Waters Xevo G2-S Q-TOF質(zhì)譜儀（Waters公司，美國(guó)）；P180H型超聲波水浴鍋（德國(guó)埃爾瑪公司）；Quintix 224-1 CN-1型電子天平（賽多利斯北京有限公司）；Agilent 1290型超高效液相色譜儀，配置Agilent G7111B四元泵、Agilent G7129A進(jìn)樣器、Agilent G7115A DAD檢測(cè)器；Milli-Q Integral超純水系統(tǒng)（Millipore公司，Bedford，美國(guó)）。

色譜純乙腈（批號(hào)UCNA1H，Honeywell），分析純甲醇（批號(hào)20210208，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司），質(zhì)譜級(jí)甲酸（批號(hào)UUQBH-JX，梯希愛(ài)上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司），色譜級(jí)磷酸（批號(hào)20200731，色譜級(jí)，Tedia公司）。

對(duì)照品人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1，批號(hào)3852，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、人參皂苷Re（ginsenoside Re，批號(hào)4147，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、人參皂苷Rf（ginsenoside Rf，批號(hào)3071，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、人參皂苷Rc（ginsenoside Rc，批號(hào)7879，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、人參皂苷Ro（ginsenoside Ro，批號(hào)8689，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、人參皂苷Rd（ginsenoside Rd，批號(hào)8262，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、人參皂苷Rb1（ginsenoside Rb1，批號(hào)2326，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、人參皂苷Rb2（ginsenoside Rb2，批號(hào)9039，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）均購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。

18批人參配方顆粒來(lái)源信息見(jiàn)表1。人參藥材購(gòu)自上海雷允上藥業(yè)有限公司，經(jīng)上海藥物研究所中藥現(xiàn)代化中心姚帥高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為五加科人參屬植物人參C. A. Mey.，符合《中國(guó)藥典》2020版一部人參項(xiàng)的有關(guān)規(guī)定。

表1 18批人參配方顆粒來(lái)源

Table 1 Sources of 18 batches of Ginseng Dispensing Granules

編號(hào)批號(hào)廠家 S1211201001上海萬(wàn)仕誠(chéng)藥業(yè)有限公司 S2211201002上海萬(wàn)仕誠(chéng)藥業(yè)有限公司 S3211201003上海萬(wàn)仕誠(chéng)藥業(yè)有限公司 S41071251廣東一方制藥有限公司 S5A1120551廣東一方制藥有限公司 S6A1120541廣東一方制藥有限公司 S7A1120561廣東一方制藥有限公司 S8A1129571廣東一方制藥有限公司 S9A1105171廣東一方制藥有限公司 S10A1129582廣東一方制藥有限公司 S112006001C華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司 S122103002C華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司 S132005003C華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司 S142005001C華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司 S152005002C華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司 S1621056494江陰天江藥業(yè)有限公司 S1721100641江陰天江藥業(yè)有限公司 S1821060091江陰天江藥業(yè)有限公司

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rc、Ro、Rb1、Rb2、Rd對(duì)照品適量，分別加50%甲醇水制成100 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 人參配方顆粒供試品的制備 取人參配方顆粒適量，研細(xì)，稱取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇水20 mL，超聲處理30 min，14 000 r/min離心，取上清液，即得。

2.2.2 人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑及其供試品的制備 標(biāo)準(zhǔn)湯劑（實(shí)驗(yàn)室自制）：取人參藥材粉末100 g，加10倍量水浸泡30 min，武火加熱沸騰后保持微沸煎煮60 min，經(jīng)150目濾布濾過(guò)，藥渣加8倍量水，保持微沸煎煮30 min，合并濾液，濃縮，凍干，得人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑粉末[3,13]；精密稱取1 g粉末，加50%甲醇水20 mL，超聲處理30 min，14 000 r/min離心，取上清液，即得。

2.3 色譜、質(zhì)譜條件

2.3.1 人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑的成分分析 色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1 min，2% A；1～16 min，2%～30% A；16～25 min，30%～44% A；25～28 min，44%～95% A；28～29 min，95%～100% A；29～32 min，100% A），柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為2 μL；體積流量為0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源采用正、負(fù)離子模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以氮?dú)鉃殪F化氣和錐孔氣，采集方法為fast DDA。正離子模式參數(shù)：毛細(xì)管電壓為2.5 kV，錐孔電壓為40 V，離子源溫度為120 ℃，去溶劑氣溫度450 ℃，錐孔氣體積流量30 L/h，去溶劑氣體積流量600 L/h。負(fù)離子模式參數(shù)：毛細(xì)管電壓為2.0 kV，錐孔電壓為40 V；離子源溫度為120 ℃；去溶劑氣溫度450 ℃，錐孔氣體積流量50 L/h，去溶劑氣體積流量800 L/h。掃描范圍/100～1500，采集時(shí)間0.1 s，當(dāng)基峰離子強(qiáng)度高于10 000時(shí)，觸發(fā)前三強(qiáng)母離子的二級(jí)掃描。碰撞能低質(zhì)量端設(shè)置為10～30 V，高質(zhì)量端設(shè)置為30～50 V。

2.3.2 人參配方顆粒指紋圖譜 色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.01%磷酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min，20%～24% B；20～33 min，24%～28% B；33～60 min，28%～36% B），柱溫為35 ℃，進(jìn)樣體積為2 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；體積流量為0.3 mL/min。

2.4 數(shù)據(jù)處理

首先，將采集的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)MSconvert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換，后將轉(zhuǎn)換格式后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MS DIAL軟件中進(jìn)行解卷積、峰提取、代謝物鑒定。并結(jié)合高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)提供的準(zhǔn)分子離子及二級(jí)碎片信息，使用Masslynx軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果

3.1 人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究

采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)獲得人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，其在正、負(fù)離子模式下的基峰離子流圖見(jiàn)圖1。通過(guò)數(shù)據(jù)解析共鑒定57個(gè)化合物，包括皂苷25個(gè)、氨基酸及其衍生物12個(gè)、堿基及核苷5個(gè)、其他類成分15個(gè)，鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

A-正離子模式 B-負(fù)離子模式

表2 人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑成分鑒定

Table 2 Composition identification of Ginseng Dispensing Granules standard decoction

序號(hào)tR/min質(zhì)量數(shù)（m/z）分子式加和離子誤差(×10?6)碎片離子化合物名稱參考文獻(xiàn) 10.79175.120 5C6H14N4O2M＋H1.0175.120 5, 158.093 0, 130.097 5, 116.071 7, 70.067 2精氨酸14-15 20.80337.171 8C12H24N4O7M＋H?0.5337.171 8, 175.120 9, 158.093 2精氨酸葡萄糖苷16 30.83499.225 0C18H34N4O12M＋H?0.1499.225 0, 337.169 2, 175.120 7, 158.093 6精氨酸葡萄二糖苷16 40.86195.047 7C6H12O7M－H?2.8195.049 6, 177.036 7, 147.026 8, 129.013 1, 99.001 5, 74.998 9, 59.003 2葡萄糖酸17 50.86209.028 0C6H10O8M－H?1.7209.027 7, 191.017 4, 133.010 0, 129.015 4, 85.020 8, 71.004 4, 57.023 3葡萄糖二酸18 60.95191.057 7C7H12O6M－H2.1191.057 7, 127.039 1, 85.030 2奎寧酸19-20 70.96341.106 9C12H22O11M－H?1.5341.107 3, 179.053 0, 119.028 9, 89.016 3, 71.000 40, 59.003 4蔗糖19 80.98503.160 3C18H32O16M－H?0.9503.158 7, 341.102 2, 221.063 9, 179.052 3, 119.027 6, 89.016 3棉子糖17,20 91.03133.009 6C4H6O5M－H?4.1133.009 3, 115.004 3, 71.014 6蘋果酸14,20 100.92116.069 5C5H9NO2M＋H?1.7116.070 8, 70.064 6脯氨酸18,21 111.19266.122 6C10H19NO7M＋H?1.4248.113 6, 230.103 6, 194.085 5, 98.058 6γ-氨基丁酸葡萄糖苷17 121.37136.064 0C5H5N5M＋H1.7136.062 5, 119.035 1腺嘌呤19-20 131.49123.057 3C6H6N2OM＋H1.5123.057 4, 96.044 2, 80.050 2煙酰胺18,22 141.62191.018 1C6H8O7M－H?1.1191.015 7, 173.008 5, 129.016 4, 111.002 0, 87.000 3, 57.022 0檸檬酸18,20 15a1.62274.092 0C11H15NO7M＋H?0.7238.070 7, 192.066 7, 130.049 3, 97.029 7脯氨酸戊糖苷 161.71130.050 9C5H7NO3M＋H0.5130.049 6, 84.046 7L-焦谷氨酸15,19 172.11182.081 7C9H11NO3M＋H0.0165.057 5, 136.078 3, 123.046 7酪氨酸15,21 182.17113.035 7C4H4N2O2M＋H0.6113.036 2, 96.007 3, 70.065 6尿嘧啶19-20 192.30132.102 1C6H13NO2M＋H?0.486.097 9亮氨酸15,21 20a2.55294.155 9C12H23NO7M＋H0.6276.147 2, 230.138 0, 144.102 3, 86.101 7異亮氨酸果糖苷 212.90268.104 8C10H13N5O4M＋H0.2268.105 4, 136.063 5腺苷16,22 22a3.15252.109 2C10H13N5O3M＋H?0.5252.109 2, 136.063 5蟲(chóng)草素 233.22284.099 1C10H13N5O5M＋H?0.4225.127 6, 152.058 9, 135.031 4, 110.035 4鳥(niǎo)苷20-21 243.99166.086 8C9H11NO2M＋H0.0120.083 4, 103.057 6苯丙氨酸14,15 255.31382.098 9C14H17N5O8M－H?1.0266.087 8, 206.068 5, 115.006 5琥珀酰腺苷17 265.32127.041 2C6H6O3M＋H1.7127.039 9, 109.034 6麥芽酚17 276.14205.098 2C11H12N2O2M＋H0.5188.071 2, 159.094 0, 118.065 0色氨酸14-15 289.39337.092 7C16H18O8M－H0.4191.056 3, 173.044 293.352香豆?？鼘幩?2 2910.67163.041 1C9H8O3M－H1.6163.036 7, 119.050 7對(duì)香豆酸17,20 30c14.051 007.540 0C48H82O19M＋HCOO?3.1961.534 7, 799.479 7, 637.433 1PPT-3Glc 31s14.40977.529 4C47H80O18M＋HCOO?2.7931.524 9, 799.484 1, 637.430 6三七皂苷R1 32s15.07845.489 3C42H72O14M＋HCOO?0.6845.489 3, 799.486 6, 637.434 5, 475.381 5人參皂苷Rg1 33s15.12991.549 4C48H82O18M＋HCOO1.6945.541 5, 783.490 1, 637.430 3, 475.380 8, 119.028 4人參皂苷Re 3415.89885.482 2C45H74O17M－H?2.6841.494 6, 781.471 9, 619.421 0, 475.381 0丙二酰人參皂苷Rg119,23 3516.371 031.542 7C51H84O21M－H1.6987.550 2, 945.539 6, 927.529 4, 637.428 7丙二酰人參皂苷Re19,23 36s18.80845.489 3C42H72O14M＋HCOO?0.6799.481 5, 637.431 0, 475.380 2人參皂苷Rf 3719.47815.478 6C41H70O13M＋HCOO?0.7769.470 6, 637.431 0, 475.377 2, 161.042 3三七皂苷R219,23 38s20.14829.492 4C42H72O13M＋HCOO?2.5783.487 5, 637.429 9, 475.378 0, 161.041 4人參皂苷Rg2 39s20.241 153.603 0C54H92O23M＋HCOO2.41 107.588 6, 945.537 9, 783.486 3, 179.051 9人參皂苷Rb1

續(xù)表1

序號(hào)tR/min質(zhì)量數(shù)（m/z）分子式加和離子誤差(×10?6)碎片離子化合物名稱參考文獻(xiàn) 40a20.40329.232 3C18H34O5M－H?0.5329.231 9, 229.142 0, 211.133 7, 171.099 9, 139.107 8,99.072 29,10,13-TriHOME 4120.531 193.598C50H98O31M－H?3.71 149.602 9, 1 107.588 0, 945.542 2丙二酰人參皂苷 Rb119,23 42s20.801 123.594 0C53H90O22M＋HCOO4.01 077.583 5, 783.493 3, 621.433 1人參皂苷Rc 43s20.94955.487 1C48H76O19M－H?3.2955.487 5, 793.431 8, 569.382 1, 455.351 5人參皂苷Ro 4421.161 163.586 5C49H96O30M－H?4.51 119.592 7, 1 077.580 2, 1 059.568 6, 945.542 5,765.487 1丙二酰人參皂苷Rc19,23 45s21.321 123.587 0C53H90O22M＋HCOO?3.01 077.580 8, 783.480 7, 621.435 7人參皂苷Rb2 46s21.491 123.587 0C53H90O22M＋HCOO?3.01 077.580 1, 783.481 0, 621.434 3人參皂苷Rb3 4721.641 163.586 0C49H96O30M－H?4.51 119.592 7, 1 077.580 2, 1 059.568 6丙二酰人參皂苷Rb219,23 4821.801 163.586 3C49H96O30M－H?4.51 119.592 7, 1 077.580 2, 1 059.568 6丙二酰人參皂苷Rb319,23 49s22.55991.549 4C48H82O18M＋HCOO1.6945.544 1, 783.488 3, 621.433 3, 161.041 3人參皂苷 Rd 50c22.64793.435 9C42H66O14M－H?1.5793.437 8, 631.383 2OA-Glc-GlurA 5122.901 031.543 3C51H84O21M－H1.6987.550 2, 945.539 6, 927.529 4, 637.428 7丙二酰人參皂苷Rd19,23 52c26.59793.435 9C42H66O14M－H?1.5793.436 5, 731.439 7, 631.390 4, 569.382 7, 455.351 5OA-Glc-GlurA 5326.74261.184 5C17H24O2M＋H?1.0261.184 3, 105.034 4人參環(huán)氧炔醇24 54s26.96829.496 3C42H72O13M＋HCOO1.4783.489 1, 621.434 3, 459.380 0, 161.041 4人參皂苷Rg3 55c27.50631.382 9C36H56O9M－H?1.7631.382 4, 555.364 1, 455.347 5OA-Glur A 5628.00811.479 6C42H70O12M＋HCOO?4.8765.477 7, 603.429 7, 161.042 3人參皂苷Rg512,25 5728.25279.232 0C18H30O2M＋H?0.4201.052 1, 95.085 3, 81.068 8亞麻酸19

s-用對(duì)照品比對(duì) a-與MS DIAL數(shù)據(jù)庫(kù)中二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行比較鑒定 c-根據(jù)裂解規(guī)律進(jìn)行推斷

s-refers to compounds identified by comparing with reference standard a-refers to compounds identified by comparing with MS/MS data obtained from MS DIAL c-refers to compouds characterized according to fragmentation rules

3.1.1 皂苷類 皂苷類成分是人參的主要藥效成分之一，是由苷元和1個(gè)或幾個(gè)糖組成，人參中人參皂苷大部分為原人參三醇（PPT）和原人參二醇（PPD）型，含有少量的齊墩果酸（OA）型皂苷[12,25]。通常在負(fù)離子模式下具有較好的響應(yīng)，形成豐富的[M－H]?或[M＋HCOO]?離子，母離子中的糖苷鍵斷裂產(chǎn)生一系列脫糖碎片和苷元離子。本研究共鑒定和推測(cè)出25個(gè)皂苷類化合物，包括PPT型9個(gè)（30～38），PPD型11個(gè)（39、41、42、44～49、51、54），OA型4個(gè)（43、50、52、55），其他型1個(gè)（56）。以化合物32為例，在負(fù)離子模式下，產(chǎn)生加和離子峰/845.489 3 [M＋HCOO]?，根據(jù)其元素組成推導(dǎo)其分子式為C42H72O14。母離子碎裂產(chǎn)生[M－H]?準(zhǔn)分子離子峰/799.486 6，隨后相繼丟失六碳糖產(chǎn)生/637.434 5 [M－H－Glc]?與PPT苷元離子/475.381 5 [M－H－2Glc]?。根據(jù)以上質(zhì)譜碎片信息以及與對(duì)照品比對(duì)，32鑒定為PPT型人參皂苷Rg1?；衔?4負(fù)離子模式下，產(chǎn)生加和離子峰/829.496 3 [M＋HCOO]?，根據(jù)其元素組成推導(dǎo)其分子式為C42H72O13。母離子碎裂產(chǎn)生[M－H]?準(zhǔn)分子離子峰/783.489 1，隨后相繼丟失六碳糖產(chǎn)生/621.434 3 [M－H－Glc]?與PPD苷元離子/459.380 0 [M－H－Glc－Glc]?。根據(jù)以上質(zhì)譜碎片信息，54鑒定為PPD型人參皂苷Rg3?；衔?3在負(fù)離子模式下，產(chǎn)生[M－H]?準(zhǔn)分子離子峰/955.487 1；母離子碎裂產(chǎn)生/793.431 8[M－H－Glc]?、569.382 1 [M－H－Glc－Glc－CO2－H2O]?與苷元離子455.351 5 [M－H－Glc－Glc－GlurA]?。根據(jù)以上質(zhì)譜碎片信息以及與對(duì)照品比對(duì)，43鑒定為OA型人參皂苷Ro?；衔?6在負(fù)離子模式下，產(chǎn)生[M＋HCOO]?加和離子峰/811.479 6，母離子碎裂產(chǎn)生/765.477 7 [M－H]?準(zhǔn)分子離子峰、隨后丟失六碳糖產(chǎn)生/603.429 7 [M－H－Glc]?。根據(jù)以上質(zhì)譜碎片信息結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[12]，56鑒定為人參皂苷Rg5。

3.1.2 氨基酸及其衍生物 在人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑中共鑒定出12個(gè)氨基酸及其衍生物（1～3、10、11、15～17、19、20、24、27）。在正離子模式下，化合物27產(chǎn)生/205.098 2 [M＋H]+的準(zhǔn)分子離子峰，對(duì)應(yīng)分子式C11H12N2O2；其主要的二級(jí)碎片有/188.071 2 [M＋H－NH3]+、159.094 0 [M＋H－HCOOH]+、118.065 0 [M＋H－C3H5NO2]+，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)匹配及其碎片信息并參考文獻(xiàn)[14,15]，27鑒定為色氨酸?；衔?在正離子模式下產(chǎn)生499.225 0 [M＋H]+的準(zhǔn)分子離子峰，對(duì)應(yīng)的分子式為C18H34N4O12。其主要的二級(jí)碎片有/337.172 3 [M＋H－Glc]+、175.121 2 [M＋H－Glc－Glc]+、158.091 4 [M＋H－Glc－Glc－NH3]+，其中/175.120 7的碎片表明結(jié)構(gòu)中含有精氨酸，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)匹配及碎片信息并參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[16]，推測(cè)3為精氨酸葡萄二糖苷。

3.1.3 堿基及核苷 在人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑中共鑒定出5個(gè)堿基及核苷類成分（12、18、21、23、25）?；衔?1在正離子模式下產(chǎn)生/268.104 8 [M＋H]+的準(zhǔn)分子離子峰，對(duì)應(yīng)分子式C10H11N5O4；其主要的二級(jí)碎片離子/136.063 5分子組成與腺嘌呤堿基一致。因此，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)匹配和二級(jí)碎片并參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[16,22]，21鑒定為腺苷。

3.1.4 其他類 在人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)湯劑中共鑒定出15個(gè)其他類成分（4～9、13、14、22、26、28、29、40、53、57）。其中，化合物7在負(fù)離子模式下產(chǎn)生/341.106 9 [M－H]?的準(zhǔn)分子離子峰，對(duì)應(yīng)分子式C12H22O11。其主要的二級(jí)碎片離子/179.053 0 [M－H－Glc]?、119.028 9 [M－H－Glc－C2H4O2]?、59.003 4 [M－H－Glc－C4H8O4]??；谏鲜鏊槠畔ⅲY(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)匹配并參考文獻(xiàn)[19]，7鑒定為蔗糖?；衔?4在負(fù)離子模式下產(chǎn)生/191.018 1 [M－H]?的準(zhǔn)分子離子峰，對(duì)應(yīng)分子式C6H8O7。其主要的二級(jí)碎片離子/173.008 5 [M－H－H2O]?、/129.016 4 [M－H－H2O－CO2]?、/111.002 0 [M－H－2H2O－CO2]?、/87.000 3 [M－H－2H2O－2CO2]??；谏鲜鏊槠畔?，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)匹配并參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[18,20]，14鑒定為檸檬酸。

3.2 人參配方顆粒指紋圖譜的建立

3.2.1 色譜條件優(yōu)化 分別以乙腈-0.01%磷酸水溶液、乙腈-0.02%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫試驗(yàn)，流動(dòng)相為乙腈- 0.01%磷酸水溶液時(shí)，色譜峰分離較佳，因此選定的流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸。同時(shí)，考察了25、30、35、40 ℃不同柱溫對(duì)分離的影響，色譜峰分離受柱溫影響較大，溫度越高，分離度越佳。由于40 ℃條件較為極端，因此選擇條件較溫和、分離度較佳的35 ℃。并通過(guò)梯度優(yōu)化，確定最佳的洗脫梯度為0～20 min，20%～24%乙腈；20～33 min，24%～28%乙腈；33～60 min，28%～36%乙腈。

3.2.2 精密度試驗(yàn) 取樣品S1作為供試品，精密稱取1份樣品，按供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和其相對(duì)峰面積無(wú)明顯變化，以2號(hào)峰人參皂苷Re為參照峰，其RSD均小于2.0%，表明儀器穩(wěn)定，精密度良好。

3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取精密度試驗(yàn)中同一批作為供試品，精密稱取6份樣品，按供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和其相對(duì)峰面積無(wú)明顯變化，以2號(hào)峰人參皂苷Re為參照峰，其RSD均小于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取精密度試驗(yàn)中同一批樣品作為供試品，按“2.2”項(xiàng)方法制備成供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、15、18、24 h進(jìn)樣分析。以2號(hào)峰人參皂苷Re為參照峰，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和其相對(duì)峰面積RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 將18批人參配方顆粒按“2.2”項(xiàng)方法制成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)指紋圖譜的色譜條件對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以S1號(hào)樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜進(jìn)行全譜峰匹配，以平均值法生成對(duì)照?qǐng)D譜（圖2）并計(jì)算相似度。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了8 個(gè)共有峰：1號(hào)峰為人參皂苷Rg1，2號(hào)峰為人參皂苷Re，3號(hào)峰為人參皂苷Rf，4號(hào)峰為人參皂苷Rb1，5號(hào)峰為人參皂苷Ro，6號(hào)峰人參皂苷Rc，7號(hào)峰為人參皂苷Rb2，8號(hào)峰為人參皂苷Rd。18批人參配方顆粒樣品的指紋疊加圖譜，見(jiàn)圖3，各批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.917、0.917、0.927、0.983、0.994、0.994、0.997、0.997、0.993、0.989、0.989、0.993、0.990、0.972、0.989、0.994、0.992、0.984，樣品相似度均大于0.900。

1-人參皂苷Rg1 2-人參皂苷Re 3-人參皂苷Rf 4-人參皂苷Rb1 5-人參皂苷Ro 6-人參皂苷Rc 7-人參皂苷Rb2 8-人參皂苷Rd

圖3 不同廠家18批人參配方顆粒指紋圖譜

4 討論

目前，人參化學(xué)研究多集中于藥材中皂苷成分，人參配方顆粒的研究多集中于其藥效作用，而人參配方顆粒中的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確[26-29]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將液相色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜的高分辨率、高靈敏度以及能提供化合物的元素組成及離子碎片信息等特點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，可用于化合物的快速鑒定，目前已被廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分鑒定和指紋圖譜研究[30-32]。本研究運(yùn)用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)，采用正、負(fù)離子2種模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、對(duì)照品比對(duì)和MS DIAL軟件輔助解析等方法快速分析人參配方顆粒中的化學(xué)成分，共鑒定出57個(gè)化合物，包括皂苷25個(gè)、氨基酸及其衍生物12個(gè)、堿基及核苷5個(gè)、其他類成分15個(gè)，為后續(xù)人參配方顆粒的質(zhì)量控制與藥效研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)信息。

中藥配方顆粒由于失去了原有飲片所具有的形態(tài)學(xué)指紋，需要建立完善可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以控制藥品的安全性、穩(wěn)定性、有效性[33]。指紋圖譜能夠較為全面地反映中藥整體的質(zhì)量信息，因此可被用于對(duì)中藥配方顆粒的質(zhì)量控制[34-37]?；诖耍狙芯拷⒘巳藚⑴浞筋w粒指紋圖譜，在進(jìn)行指紋圖譜條件建立的過(guò)程中，本研究對(duì)不同流動(dòng)相體系、柱溫、洗脫梯度等色譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，從而獲得峰形較好、色譜峰分離度較佳的指紋圖譜條件。并應(yīng)用于不同廠家的人參配方顆粒質(zhì)量控制中。不同廠家不同批次的成分基本相同，僅含量上存在一定差異，可能與原藥材的來(lái)源不同或輔料加入量有關(guān)；本研究仍存在配方顆粒樣品批次過(guò)少，代表性不夠等問(wèn)題。與現(xiàn)有人參配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)[38]相比，本方法分析時(shí)間較短，色譜峰分離情況更佳，可以應(yīng)用于提升人參配方顆粒質(zhì)量控制水平。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on chemical components and chromatographic fingerprints of Ginseng Dispensing Granules based on UPLC-Q-TOF-MS

WANG Jing1, 2, YAO Chang-liang2, ZHANG Jian-qing2, LI Jia-yuan2, YAO Shuai2, GUO De-an1, 2

1. School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. National Engineering Research Center of TCM Standardization Technology, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China

Ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) was adopted to rapidly characterize the chemical constituents from standard decoction of Ginseng Dispensing Granules, elucidate the chemical basis of Ginseng Dispensing Granules, and establish an HPLC fingerprint for their quality control.An ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) column was used for the gradient elution with acetonitrile (A)-0.1% formic acid (B) as the mobile phases, and the data was collected in positive and negative modes. The chemical constituents of Ginseng Dispensing Granules were analyzed and identified by MS DIAL software, comparing with reference standards and searching database. The HPLC fingerprint was established on an ACQUITY UPLC HSS T3 column (2.1 mm×150 mm, 1.8 μm) with acetonitrile ?0.01% phosphoric acid as the mobile phases.A total of 57 compounds, including 25 saponins, 12 amino acids and their derivatives, five bases and nucleosides, together with 15 other compounds, were identified in the standard decoction of Ginseng Dispensing Granules. The HPLC fingerprint of Ginseng Dispensing Granules was established with eight common peaks, respectively ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rf, ginsenoside Rc, ginsenoside Ro, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, and ginsenosede Rd. And the precision, stability and reproducibility of the HPLC fingerprint were acceptable. The components in different batches of Ginseng Dispensing Granules from different manufacturers were basically similar, and only slight differences existed in contents.The results of this study clarified the chemical substance basis of Ginseng Dispensing Granules, and the established HPLC fingerprint provided a method reference for the quality control of Ginseng Dispensing Granules.

Ginseng Dispensing Granules; fingerprint; UPLC-Q-TOF-MS; HPLC; ginsenoside; ginsenoside Rg1; ginsenoside Re; ginsenoside Rf; ginsenoside Rc

R284.1

A

0253 - 2670(2022)11 - 3286 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.003

2022-02-15

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（82130111）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82003938）

王 靜，女，碩士研究生。E-mail: jingwang0105@163.com

果德安，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥化學(xué)與現(xiàn)代質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: (021)50271516 E-mail: daguo@simm.ac.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]