任倪輝，郭志佳，王 鑫，王成鋼，張文頡，田首元

心肌缺血再灌注損傷是指心肌經(jīng)過缺血應(yīng)激后，恢復(fù)血供反而出現(xiàn)比缺血更嚴重損傷的病理生理過程，是心臟直視停跳體外循環(huán)手術(shù)的最大并發(fā)癥，也一直是臨床麻醉心肌保護方面亟待解決的難題。缺血再灌注損傷機制有多種途徑，其中過度激活自噬，觸發(fā)程序性細胞死亡是損傷近年來關(guān)注的重要機制。吸入麻醉藥七氟醚通過麻醉藥預(yù)處理(anesthetic preconditioning, APC)作用，可以顯著防治心肌缺血再灌注損傷，其機制主要通過磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路介導(dǎo)。七氟醚是否參與抑制心肌自噬作用成為國內(nèi)外最新研究熱點。本研究從雷帕霉素(mTOR)角度提出PI3K/Akt作用的下游蛋白經(jīng)mTOR介導(dǎo)調(diào)節(jié)自噬的假說，并使用PI3K抑制劑來觀察mTOR的活性變化及自噬水平變化，探討七氟醚對小鼠心肌缺血再灌注損傷保護是否通過調(diào)節(jié)自噬水平產(chǎn)生作用，為其作為防治心肌缺血再灌注損傷的一線用藥提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 6～8周齡成年雄性C57BL/6J小鼠24只，由北京西揚養(yǎng)殖中心提供，體重(25±3)g，隨機分4組(=6)：假手術(shù)組，只開胸不結(jié)扎；缺血再灌注組(1%戊巴比妥鈉麻醉手術(shù))；七氟醚組和七氟醚+LY294002組，2%七氟醚麻醉手術(shù)；七氟醚+LY294002組，術(shù)前一周每日腹腔注射1次1 ml的設(shè)計劑量的LY294002(PI3K阻斷劑，9901，CST，美國)，將0.3 mg/kg的LY294002溶于生理鹽水中；其余3組注射1 ml生理鹽水。所有實驗方案符合山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理要求。

1.2 模型制備 用2%七氟醚吸入(或1%戊巴比妥鈉)麻醉動物后氣管插管機械通氣。沿劍突至左腋窩將皮膚剪開，鈍性分離胸大肌、胸小肌，用血管鉗從第4～5肋間心尖搏動最強處插入胸腔，撐開肋間隙將心臟擠出，在顯微鏡下用7-0絲線，于肺動脈根部下方2 mm用活結(jié)結(jié)扎左前降支(LAD)45 min，將心臟送回胸腔，左室遠端蒼白且心電圖Ⅱ?qū)T段抬高示缺血成功，活結(jié)線頭留在胸腔外，荷包縫合皮膚，45 min后再次麻醉后松活結(jié)，心肌恢復(fù)血供、ST段回落>1/2提升再灌注成功。關(guān)胸待動物蘇醒，自由活動24 h后，采集血液和心肌標本進行分析。

1.3 心肌損傷標志物 實驗結(jié)束后，頸總動脈取新鮮血液4 ml，新鮮血液1500 g離心15 min，分離出血漿，置-20 ℃冰箱保存批量待測。使用全自動生化儀(7600，Hitchi，日本)自動檢測肌酸激酶-MB(CK-MB)和心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI)水平。

1.4 自噬標記物及信號通路蛋白 Western blot檢測方法，心肌組織冰上稱重，液氮下研磨，加入RIPA與PMSF混合裂解液，冰上靜置提取總蛋白，離心收集上清液，BCA法行定量分析、標記分裝。LSD、DTT處理樣本、95 ℃變性處理，-80 ℃保存待測?，F(xiàn)配10%硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，按順序上樣，80 mV垂直電泳至marker完全分離。三明治法將凝膠蛋白質(zhì)在100 V電壓下轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜。5%脫脂奶粉封閉1 h。以下抗體均來自美國CST公司(稀釋比例1∶1000)，包括微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3 LC3(2775)，自噬相關(guān)蛋白1 Beclin1(3738)，PI3K(4257)，p-PI3K(Tyr458/Tyr199，4228)，Akt(4691)，p-Akt(ser473，4060)，mTOR(2972S)，p-mTOR(ser2448，2971S)；內(nèi)參蛋白為甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH(BM3896，1∶5000，武漢)；二抗(BA1054，1∶5000，武漢)。TBST洗膜5 min×3次，一抗4 ℃滾動孵育過夜，TBST洗膜后再次5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜5 min×3次，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次。配置AB顯影液(Thermo，美國)，均勻浸泡硝基纖維素膜，避光孵育1 min?；瘜W(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(ChemiDoc XRS+，bio-rad，美國)曝光拍照，Image-lab軟件量化分析條帶灰度。

2 結(jié) 果

2.1 心肌損傷標志物 與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組、七氟醚組和七氟醚+LY294002組的血漿CK-MB和cTnI水平增高(<0.05)；與缺血再灌注組相比，七氟醚組和七氟醚+LY294002組血漿CK-MB和cTnI水平降低(<0.05)；與七氟醚組相比，七氟醚+LY294002組血漿CK-MB和cTnI水平降低(<0.05，表1)。

2.2 心肌自噬標志物 與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組、七氟醚組和七氟醚+LY294002組的心肌自噬標志蛋白LC3和Beclin1水平均增高(<0.05)；與缺血再灌注組相比，七氟醚組和七氟醚+LY294002組的LC3和Beclin1水平均降低(<0.05)；與七氟醚組相比，七氟醚+LY294002組的LC3和Beclin1水平均增高(<0.05，表1)。

2.3 信號通路蛋白 與假手術(shù)組相比，七氟醚組的PI3K、Akt、mTOR總蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而缺血再灌注組PI3K、Akt水平增高(<0.05)，且mTOR蛋白水平降低(<0.05)，七氟醚+LY294002組PI3K水平增高(<0.05)，且Akt、mTOR蛋白水平降低(<0.05)。磷酸化PI3K、Akt、mTOR與總蛋白比值結(jié)果：與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組、七氟醚組和七氟醚+LY294002組的磷酸化PI3K、Akt、mTOR與總蛋白比值降低(<0.05)。與缺血再灌注組相比，七氟醚組的磷酸化PI3K、Akt、mTOR蛋白與總蛋白比值升高(<0.05)。與七氟醚組相比，七氟醚+LY294002組的磷酸化PI3K、Akt、mTOR蛋白與總蛋白比值均降低(<0.05，表1)。

表1 不同處理下小鼠血漿心肌指標的比較

3 討 論

自噬是心肌缺血再灌注損傷致心肌細胞死亡的主要途徑之一，也是受損的細胞器及蛋白質(zhì)經(jīng)溶酶體降解，產(chǎn)物循環(huán)利用產(chǎn)生能量維持細胞活動的一種細胞生物學(xué)行為。因此，自噬是一把雙刃劍，可以維系細胞新陳代謝的物質(zhì)平衡，系統(tǒng)過度激活也會造成細胞不可逆損傷過程。缺血再灌注引發(fā)心肌細胞過度自噬，加重了伴隨梗死的細胞不可逆損傷。LC3和Beclin1作為自噬的標志蛋白，可以客觀衡量自噬發(fā)生的水平。缺血再灌注七氟醚的藥物預(yù)處理ICP作用經(jīng)典信號通路是PI3K/Akt。藥物預(yù)處理ICP作用通過經(jīng)典PI3K/Akt通路，調(diào)控下游細胞生長、增殖、存活、凋亡等多種細胞行為，調(diào)節(jié)缺血再灌注心肌細胞糖原合成和葡萄糖轉(zhuǎn)化功能需求，從而實現(xiàn)心肌保護作用。大量研究表明，PI3K/Akt通路是細胞生長和存活的主要調(diào)節(jié)蛋白，也是心肌細胞缺血再灌注損傷的主要途徑之一，通過Akt蛋白調(diào)節(jié)下游多個信號通路實現(xiàn)其生物效應(yīng)。

麻醉藥物七氟醚通過PI3K/Akt通路介導(dǎo)對心肌缺血再灌注損傷保護，而對自噬的影響研究尚不充分。本實驗通過檢測自噬標志蛋白LC3和beclin1證明，七氟醚顯著抑制了缺血再灌注引發(fā)的心肌過度自噬；使用特定的 PI3K 抑制劑LY294002，發(fā)現(xiàn)可以部分消除這種保護作用。有證據(jù)表明，Akt可以直接磷酸化mTOR蛋白，從而啟動由mTOR介導(dǎo)的代謝相關(guān)效應(yīng)。mTOR是哺乳動物誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。mTOR是ATP感受器，其活性參與自噬體形成及成熟過程。能量缺乏時，細胞磷酸化mTOR活性水平增加，mTOR復(fù)合體形成障礙，可以負反饋調(diào)節(jié)自噬，減少細胞缺血再灌注損傷，增強心功能。因此，mTOR蛋白可以作為樞紐蛋白，橋接七氟醚的ICP作用和缺血再灌注的自噬過程。

本研究結(jié)果表明，在缺血再灌注條件下，心肌PI3K/Akt/mTOR信號通路的蛋白磷酸化水平受到顯著抑制，而七氟醚顯著提高了該通路磷酸化活性，且與缺血再灌注心肌損傷即自噬水平變化一致，說明七氟醚確實可以激活PI3K/Akt通路，且大幅逆轉(zhuǎn)由缺血再灌注引發(fā)的通路活性抑制，從而實現(xiàn)對缺血再灌注心肌的保護作用。其中對自噬水平的調(diào)節(jié)作為缺血再灌注心肌保護作用的一個重要組成部分。此外，進一步使用PI3K抑制劑結(jié)果提示，抑制PI3K可以一定程度上降低p-mTOR的磷酸化水平，證明了PI3K/Akt通路的確與mTOR蛋白之間存在上下游的作用關(guān)系。抑制該信號通路，可以顯著增加缺血再灌注心肌損傷程度及自噬水平，即一定程度上消除了七氟醚對缺血再灌注心肌的保護作用。

綜上，七氟醚可能通過上調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化活性水平，抑制了缺血再灌注誘導(dǎo)的過度自噬，從而為七氟醚心肌保護機制提供更多研究證據(jù)。深入對PI3K/Akt/mTOR通路進行蛋白質(zhì)及代謝組學(xué)的研究將是本課題組未來研究方向。