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        不均一性核糖核蛋白F抑制流感病毒復制機理探究

        2022-05-30 10:48:04馬慧玲任俊錚趙夢嬌姜波薛瑞雪王敏汪洋陳靜
        畜牧獸醫(yī)科學 2022年1期

        馬慧玲 任俊錚 趙夢嬌 姜波 薛瑞雪 王敏 汪洋 陳靜

        摘要:流感病毒在宿主細胞核內(nèi)復制時會存在大量的病毒RNA,在這個過程中細胞核內(nèi)會存在相關的蛋白來參與流感病毒復制。為了探討不均一性核糖蛋白F(hnRNP)抑制流感病毒復制的機理,研究在細胞內(nèi)過表達hnRNP F蛋白,結果出現(xiàn)流感病毒復制被抑制的現(xiàn)象,免疫共沉淀和間接免疫熒光試驗進一步證實了hnRNP F通過與流感病毒RNA結合抑制核酸出核,發(fā)揮抑制流感病毒復制作用。說明hnRNP F蛋白可能通過與流感病毒的RNA結合而阻止核酸出核來發(fā)揮抑制流感病毒的作用。

        關鍵詞:免疫共沉淀;hnRNP F蛋白;RNA;流感病毒

        中圖分類號:S852.65文獻標識碼:Bdoi:10.3969/j.issn.2096-3637.2022.01.003

        Heterogeneous Ribonucleoprotein F Inhibit Replication of Influenza Virus and Study of Molecular Mechanism

        MA Huiling 1,REN Junzheng2,ZHAO Mengjiao3,JIANG Bo4,XUE Ruixue1,WANG Min1,WANG Yang1,CHEN Jing1

        (l.Shandong Provincial Center for Animal Control and Prevention,Jinan 250100,China;2.College of Life Science,Shandong Agricultural University,Tai'an 271000,China;3.Yantai Centre for Animal Control and Prevention,Yantai Shandong 264003,China;4.Rongcheng City Li Island Animal Husbandry and Veterinary Station,Weihai Shandong 264300,China)

        Abstract:Influenza virus is an RNA virus that replicates in the nucleus. During the replication process,a lot of virus RNA exists in the nucleus. In the process of influenza virus replication,there will be numbers of host proteins in the nucleus involved in virus replication. This study found that overexpressed hnRNP F protein in cells could inhibit the replication of influenza virus. Further,co-immunoprecipitation and indirect immunofluorescenc e assay demonstrated that hnRNP F could inhibit replication of influenza virus by interacting with influenza virus RNA to inhibit virus RNA out of nucleus.

        Keywords:co-immunoprecipitation,hnRNP F protein,RNA;influenza virus

        0引言

        流感病毒(Influenza virus)屬于正黏病毒科流感病毒屬,病毒結構由內(nèi)而外分為核芯、基質(zhì)蛋白和囊膜3個部分,基因組包含8個分節(jié)段的單股負鏈RNA(ss- RNA)。流感病毒的基因組RNA(vRNA)與核蛋白(NP)結合,并與RNA聚合酶復合體纏繞成致密的核糖核蛋白復合體(RNPs),以異源三聚復合體的形式存在于感染宿主的細胞核內(nèi),主要參與病毒RNA的合成[1-2]。流感病毒感染的宿主范圍十分廣泛,包括其他哺乳動物、禽類、鳥類等。

        不均一性核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)是細胞核內(nèi)的一類RNA結合蛋白,包括約30個高豐度表達的成員[3-5],這類蛋白可與新合成的不均一性RNAs(hnRNAs/pre-mRNAs)的內(nèi)含子區(qū)域結合來協(xié)助完成內(nèi)含子的剪切,并在mRNA從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)的過程中結合mRNA來穩(wěn)定mRNA結構[6-8]。在該蛋白家族中,有研究證明核內(nèi)蛋白hnRNP K、hnRNP A2/B1均能夠參與流感病毒的復制過程[9-10],而hnRNP F蛋白是hnRNPs家族蛋白中一員,在細胞核內(nèi)含量豐富,參與mRNA前體的剪切、加工和運輸?shù)裙δ躘11-12]。目前,尚未見有流感病毒與hnRNP F相互作用研究的相關報道。本研究通過免疫共沉淀試驗和激光共聚焦試驗研究了hnRNP F蛋白對流感病毒的作用,以期為抗流感病毒藥物研發(fā)提供思路。

        1材料

        毒株A/WSN/1933(H1N1)、293T細胞系、犬腎上皮細胞系MDCK和人肺癌細胞系A549,由本試驗室保存;兔抗β-actin、Flag、hnRNP F多抗和鼠抗A型流感病毒NP、M1、M2、PB1、PB2、PA多抗,均購自Thermo Fisher公司;FITC標記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗兔IgG,均購自Invitrogen公司。

        2方法

        2.1引物設計

        根據(jù)GenBank中登錄的hnRNP F序列及流感病毒參考株的PA序列,分別設計擴增引物。

        2.2真核表達質(zhì)粒的構建與鑒定

        提取A549細胞總RNA,用Oligo(dT)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以其為模板,利用設計的擴增引物擴增hnRNP F基因,克隆至pCMV-N-Flag中構建真核表達重組質(zhì)粒pCMV-N-Flag-hnRNP F。

        2.3hnRNP F表達上調(diào)對流感病毒復制影響的檢測

        將pCMV-N-Flag-hnRNP F、pCMV-N-Flag質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞。以MOI 0.01的A/WSN/1933感染過表達后的細胞,利用Western blot檢測NP、M1、M2和β-Actin蛋白的表達水平。收集的上清分別感染MDCK細胞統(tǒng)計蝕斑數(shù)量。

        2.4利用激光共聚焦顯微鏡觀察流感病毒感染對hnRNP F定位的影響

        于鋪有A549細胞的激光共聚焦小皿中以MOI 0.1 的A/WSN/1933感染細胞,在感染24 h后用4%多聚甲醛固定。以兔抗hnRNP F(1:500),鼠抗NP單抗(1:500)作為一抗4 ℃孵育過夜,Alexa Fluor-594結合的羊抗鼠IgG(1:500)、Alexa Fluor-488結合的羊抗兔IgG(1:500)為二抗孵育1 h,染核試劑DAPI 5 min。在激光共聚焦顯微鏡下觀察流感病毒感染對hnRNP F蛋白細胞內(nèi)定位的影響。

        2.5利用免疫共沉淀試驗檢測hnRNP F與流感病毒RNA 相互作用

        分別將pCMV-N-Flag-hnRNP F質(zhì)粒和pCMV-N-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞,24h后接種MOI 0.1 A/WSN/1933,感染后30 h,用RIPA裂解液(弱)4 ℃條件下裂解10~20 min,收集細胞裂解液,離心獲得上清,加入磁珠,4 ℃搖床過夜。將磁珠分為2部分:一部分利用Western blot檢測hnRNP F蛋白的表達水平;另一部分提取RNA。RNA提取后再分為2部分,一部分用Oligo (dT)引物進行反轉(zhuǎn)錄,用WSN-PA-F1/R1引物檢測病毒mRNA水平,另一部分用Uni 12引物進行反轉(zhuǎn)錄,用WSN-PA-F/R引物檢測病毒vRNA水平。

        3結果與分析

        3.1hnRNP F蛋白對流感病毒復制的影響

        利用Western blot檢測hnRNP F過表達對流感病毒蛋白表達量影響,結果顯示在感染病毒8小時時,過表達hnRNP F蛋白組的病毒M2蛋白量低于對照組;感染14 h 后,過表達hnRNP F蛋白組病毒的NP、M1和M2蛋白含量都明顯低于對照組(見圖1 )。不同感染時間段病毒上清進行蝕斑滴定,結果顯示,感染后14 h和21 h過表達hnRNP F蛋白組病毒效價與對照組相比分別下降2.3倍和6.3倍(見圖2 )。表明上調(diào)hnRNP F的表達能抑制流感病毒復制,所以hnRNP F表達對流感病毒的復制發(fā)揮負調(diào)控作用。

        3.2流感病毒感染對hnRNP F蛋白定位的影響

        在未感染的細胞內(nèi),hnRNP F蛋白定位于細胞核內(nèi)。在病毒感染的細胞內(nèi),當流感病毒出細胞核hnRNP F蛋白也定位于細胞核內(nèi)。表明流感病毒的感染沒有影響hnRNP F蛋白的定位。

        4討論與結論

        目前已有諸多文獻關于宿主蛋白與流感病毒相互作用的報道。而且關于hnRNP家族蛋白與流感病毒相互作用研究中,已有研究表明核內(nèi)蛋白hnRNP K能夠與流感病毒NS1蛋白相互作用而參與流感病毒復制過程[9];核內(nèi)蛋白hnRNP A2/B1能與流感病毒NP蛋白相互作用影響病毒復制[10]。

        研究首先通過上調(diào)hnRNP F表達后,發(fā)現(xiàn)該蛋白可顯著抑制流感病毒復制。研究發(fā)現(xiàn),核蛋白ANP32能夠增強流感病毒聚合酶活性,促進流感病毒復制。而hnRNP F蛋白屬于細胞核內(nèi)的一種RNA結合蛋白,流感病毒的基因片段(vRNA和mRNA)需要在細胞核內(nèi)合成后出核來發(fā)揮不同功能。本研究通過免疫共沉淀試驗發(fā)現(xiàn)hnRNP F蛋白能夠與流感病毒核酸發(fā)生相互作用,而激光共聚焦試驗顯示流感病毒感染并未影響hnRNP F蛋白的定位,說明hnRNP F蛋白可能通過與流感病毒的RNA結合而阻止核酸出核來發(fā)揮抑制流感病毒的作用,該推測也需要進一步的試驗證實。而且hnRNP F蛋白抑制流感病毒功能位點還有待于進一步研究,這將為抗流感病毒藥物研發(fā)提供思路。

        參考文獻

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