吳明凱　張永豪　姜德文　龍治峰

摘要：目的 運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)篩選出特異性作用于糖尿病雙靶向PTP1B/GSK3β靶點(diǎn)的潛在活性小分子，為降糖藥物的研究與開(kāi)發(fā)提供依據(jù)和思路。方法 以PTP1B和GSK3β配體結(jié)合區(qū)域的晶體機(jī)構(gòu)作為靶點(diǎn)，運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)從小分子Specs和Chemdiv數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選雙靶向PTP1B/GSK3β的小分子復(fù)合物的蛋白結(jié)構(gòu)，刪除晶體水分子，運(yùn)用AutoDockTools以晶體小分子為質(zhì)心定義對(duì)接的活性位點(diǎn)。結(jié)果 經(jīng)過(guò)疊合與PTP1B/GSK3β對(duì)接打分，并進(jìn)一步對(duì)潛在活性分子與PTP1B/GSK3β相互作用模式分析，篩選出22個(gè)小分子與PTP1B/GSK3β均具有較強(qiáng)的結(jié)合親和力，其中小分子8019-7654、E589-4730和E589-4847三個(gè)化合物親和性最優(yōu)。結(jié)論 來(lái)源于Specs和Chemdiv數(shù)據(jù)庫(kù)中的22種小分子化合物具有潛在雙靶向于PTP1B/GSK3β的活性，其中小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847可優(yōu)先選擇開(kāi)展降糖藥物的研究，是潛在的雙靶向于PTP1B/GSK3β活性小分子。

關(guān)鍵詞：PTP1B;GSK3β;分子對(duì)接，糖尿病

糖尿病（DM）是一種由于胰島素缺乏或胰島素功能缺陷所致，以血糖濃度升高為特征的慢性代謝性疾病，其中以2型糖尿?。═2DM）最常見(jiàn)，即人體無(wú)法有效利用胰島素。全球約4.22億人患有糖尿病，每年約150萬(wàn)人死于糖尿病，且糖尿病病例數(shù)和發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。另?yè)?jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）全球糖尿病概覽2021年數(shù)據(jù)顯示，在20歲到79歲的人群中，共有約5.37億糖尿病患者，糖尿病總?cè)藬?shù)預(yù)計(jì)到2030年將增至6.43億（11.3%），到2045年將增至7.83億（12.2%）。其中，中國(guó)糖尿病人數(shù)以及未診斷糖尿病人數(shù)均排名第一，總數(shù)約為2.137億人，糖尿病健康支出排名全球第二，糖尿病防控形勢(shì)嚴(yán)峻，迫切需要有效的干預(yù)策略和政策來(lái)阻止糖尿病人數(shù)的增加。目前，常用的降糖藥有胰島素及其類似物、雙胍類口服降糖藥等，但療效有限，無(wú)法防止胰島β細(xì)胞的壞死和胰島素的抵抗;并且，由于糖尿病患者需要長(zhǎng)期用藥，且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，易導(dǎo)致藥物耐藥性增加。因此，抗糖尿病治療藥物的研究一直是國(guó)際醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)新的藥物有助于緩解當(dāng)前困局。

PTP1B（蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1B）是一種非跨膜蛋白酪氨酸磷酸水解酶，位于胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與蛋白絡(luò)氨酸激酶（PTK）共同維持著絡(luò)氨酸蛋白磷酸化的平衡，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PTP1B是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控因子，能夠阻斷胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致葡萄糖攝取減少和胰島素抵抗，是糖尿病的有效治療靶點(diǎn)。

GSK3β（糖原合成酶激酶3β）參與的AMPK/GLUT4/GSK3β信號(hào)通路與糖尿病息息相關(guān)。GSK-3β在骨骼肌組織和β-胰島細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用，GSK-3β的過(guò)表達(dá)可以阻斷糖原合成酶的活化并增加血糖，通過(guò)抑制GSK3β解除其對(duì)糖原合成酶的阻斷，并促進(jìn)糖原合成，有效降低血糖濃度[1～2]。

反向虛擬篩選是一種對(duì)給定藥物或活性小分子通過(guò)計(jì)算方法找到其潛在藥物靶標(biāo)的技術(shù)。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)雙靶向于PTP1B/GSK3β的小分子抑制劑，從兩個(gè)調(diào)控位點(diǎn)控制糖尿病的發(fā)生和發(fā)展，針對(duì)糖尿病的耐藥具有較好的緩解作用。從PTP1B/GSK3β結(jié)構(gòu)出發(fā)，采用分子對(duì)接方法AutoDock Vina和構(gòu)建PTP1B/GSK3β雙靶標(biāo)，采用分布式架構(gòu)，構(gòu)建了反向虛擬篩選平臺(tái)，對(duì)潛在雙靶向PTP1B/GSK3β小分子化合物進(jìn)行有效性篩選，對(duì)于活性小分子還可以進(jìn)行反向預(yù)測(cè)其潛在作用靶標(biāo)，為活性化合物的后期改造和機(jī)制研究提供研究方向。該方法尤其適用于藥理活性明確，而靶標(biāo)未知的中藥天然活性成分的研究，為開(kāi)發(fā)新型抗糖尿病藥物提供一定的參考和思路。

1方法

1.1 PTP1B和GSK3β受體準(zhǔn)備

查閱文獻(xiàn)，獲得GSK3β（PDB ID：3I4B）和PTP1B（PDB ID：2VEY）與小分子復(fù)合物的蛋白結(jié)構(gòu)，刪除晶體水分子，運(yùn)用AutoDockTools以晶體小分子為質(zhì)心定義對(duì)接的活性位點(diǎn)。

1.2 配體準(zhǔn)備

我們選擇用小分子數(shù)據(jù)庫(kù)是Specs公司和Chemdiv公司的數(shù)據(jù)庫(kù)。其中，Specs數(shù)據(jù)庫(kù)是由荷蘭Specs公司開(kāi)發(fā)的數(shù)據(jù)庫(kù)，Chemdiv數(shù)據(jù)庫(kù)是由美國(guó)Chemdiv公司開(kāi)發(fā)的數(shù)據(jù)庫(kù)，將篩選的小分子進(jìn)行優(yōu)化加氫，并用OpenBabel分子格式轉(zhuǎn)換工具轉(zhuǎn)成pdbqt格式文件。

1.3 分子對(duì)接

運(yùn)用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，每個(gè)配體保留9個(gè)構(gòu)象，提取打分最好的構(gòu)象進(jìn)行分析。小分子化合物與PTP1B/GSK3β雙靶標(biāo)相互作用模式用Pymol軟件可視化處理。

2結(jié)果

2.1 小分子與PTP1B和GSK3β結(jié)合情況

疊合與PTP1B和GSK3β對(duì)接打分靠前的2000個(gè)小分子發(fā)現(xiàn)有22個(gè)小分子是交集（圖1），即這些小分子與PTP1B和GSK3β均有較強(qiáng)的親和力。它們?yōu)?407-0052、3241-0275、8003-5449、8019-7654、E589-4730、E589-4749、和E589-4761等。

2.2 潛在活性分子與PTP1B和GSK3β相互作用模式

考察22個(gè)小分子與PTP1B和GSK3β的對(duì)接打分（圖2）發(fā)現(xiàn)，這些小分子與GSK3β的對(duì)接打分在-7.7 kcal/mol ～ -10.4 kcal/mol之間，與PTP1B的對(duì)接打分在-6.5 kcal/mol ～ -8.2 kcal/mol之間。篩選對(duì)接打分同時(shí)優(yōu)于-8.0 kcal/mol的小分子為：8019-7654、E589-4730和E589-4847。

為了考察小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847與PTP1B和GSK3β的相互作用，我們進(jìn)一步分析了它們之間的作用模式（圖3）。小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847與PTP1B的對(duì)接打分分別為-8.2 kcal/mol、-8.1 kcal/mol和-8.2 kcal/mol。在PTP1B體系中，8019-7654與PTP1B的Ile62、Arg141、Val135和Try134形成6個(gè)氫鍵;E589-4830與PTP1B的Ile62、Val135、Asn64和Lys85形成5個(gè)氫鍵;E589-4847與PTP1B的Ile62、Gln185和Lys85形成4個(gè)氫鍵。小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847與GSK3β的對(duì)接打分分別為-9.0 kcal/mol、-8.5 kcal/mol和-8.8 kcal/mol。在GSK3β體系中，8019-7654與GSK3β的Tyr46、Asp181、Phe182、Gln266和Arg221形成7個(gè)氫鍵;E589-4830與GSK3β的Asp48、Asp181、Ser216、Gln262和Arg221形成7個(gè)氫鍵;E589-4847與GSK3β的Asp48、Gly259、Asp181、Gln262和Arg221形成5個(gè)氫鍵。

3討論

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847具有較好的潛在雙靶向于PTP1B和GSK3β受體。其中化合物8019-7654親和力最強(qiáng)，雙靶向于PTP1B/GSK3β受體對(duì)接打分為：-8.2 kcal/mol和-9.0kcal/mol。與PTP1B/GSK3β雙靶標(biāo)相互作用模式分析發(fā)現(xiàn)，與PTP1B的Ile62、Arg141、Val135和Try134形成6個(gè)氫鍵，與GSK3β的Tyr46、Asp181、Phe182、Gln266和Arg221形成7個(gè)氫鍵，均體現(xiàn)出較強(qiáng)的氫鍵親和力?；衔顴589-4730親和力次之，雙靶向于PTP1B/GSK3β受體對(duì)接打分為：-8.1 kcal/mol和-8.5kcal/mol。與PTP1B/GSK3β雙靶標(biāo)相互作用模式分析發(fā)現(xiàn)，與PTP1B的Ile62、Val135、Asn64和Lys85形成5個(gè)氫鍵，與GSK3β的Asp48、Asp181、Ser216、Gln262和Arg221形成7個(gè)氫鍵，均體現(xiàn)出較強(qiáng)的氫鍵親和力?；衔顴589-4847親和力較前兩者相當(dāng)，雙靶向于PTP1B/GSK3β受體對(duì)接打分為：-8.2 kcal/mol和-8.8kcal/mol。與PTP1B/GSK3β雙靶標(biāo)相互作用模式分析發(fā)現(xiàn)，與PTP1B的Ile62、Gln185和Lys85形成4個(gè)氫鍵，與GSK3β的Asp48、Gly259、Asp181、Gln262和Arg221形成5個(gè)氫鍵，氫鍵親和力較前兩者弱一些。可見(jiàn)以上三個(gè)小分子化合物具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

分子對(duì)接模擬配體小分子物質(zhì)與受體生物大分子物質(zhì)相互作用的技術(shù)方法，實(shí)質(zhì)就是配體與受體相互作用，包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華作用分子識(shí)別的過(guò)程。小分子配體與大分子蛋白受體之間通過(guò)能量匹配和幾何匹配，達(dá)到相互識(shí)別，用來(lái)模擬小分子和蛋白之間的相互作用，使我們可以通過(guò)模擬小分子在靶蛋白結(jié)合位點(diǎn)的行為來(lái)闡述基礎(chǔ)生理過(guò)程，并通過(guò)計(jì)算預(yù)測(cè)兩者間的結(jié)合模式和親和力。

4結(jié)論

綜合分析，運(yùn)用分子對(duì)接Autodock軟件從Specs和Chemdiv數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到小分子化合物8019-7654、E589-4730和E589-4847與PTP1B/GSK3β具有較好的結(jié)合親和力，體現(xiàn)出一定的有效抑制性，提示這三個(gè)小分子是潛在的雙靶向PTP1B和GSK3β抑制劑，可優(yōu)先選擇開(kāi)展降糖藥物的研究，是潛在的雙靶向于PTP1B/GSK3β活性小分子化合物。

參考文獻(xiàn)

[1] 李超.海洋天然產(chǎn)物BDDPM靶向調(diào)控PTP1B的降糖作用及機(jī)制研究[D].北京：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)（中國(guó)科學(xué)院海洋研究所），2019.