何錫忠　李嘉皓　林鷙　趙本進　朱永軍　彭麗英

摘? 要：為比較國產(chǎn)與進口達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）培養(yǎng)豬睪丸（swine testis，ST）貼壁細胞和培養(yǎng)豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）、豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）和豬傳染性胃腸炎病毒 （transmissible gastroenteritis virus，TGEV）的效果，本試驗采用國產(chǎn)與進口DMEM培養(yǎng)同批ST細胞，連續(xù)傳代10代，并分別接種培養(yǎng)PPV、PRV和TGEV。結(jié)果顯示，用國產(chǎn)DMEM培養(yǎng)ST細胞72 h后，連續(xù)10代細胞的密度均達到1.25×10⁶個/mL以上，細胞增殖達5倍以上，與進口DMEM培養(yǎng)結(jié)果相似，兩者無顯著差異（P>0.05）;兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)同一病毒的滴度相近，兩者無顯著差異（P>0.05）。試驗表明，國產(chǎn)DMEM能達到進口培養(yǎng)基的培養(yǎng)水平，為國產(chǎn)DMEM替代進口DMEM來大規(guī)模培養(yǎng)PRV、PPV和TGEV等提供了科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞：ST細胞;國產(chǎn)與進口DMEM;培養(yǎng)

中圖分類號：S852 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2022）04-0030-04

病毒是專性寄生物，自身無完整的酶系統(tǒng)，不能進行獨立的物質(zhì)代謝，必須在活的宿主細胞內(nèi)才能進行生長、復制和增殖。自20世紀40年代末首次發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒在體外非神經(jīng)組織上生長復制以來，細胞培養(yǎng)已成為培養(yǎng)病毒的主要方法[1]。培養(yǎng)基是維持宿主細胞生存和生長所需的基本溶液，國產(chǎn)與進口都屬于合成達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM），是按人和動物體內(nèi)細胞所需成分模擬合成、配方恒定的一種較理想的培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)促進了組織培養(yǎng)的發(fā)展，減少了生物個體差異的影響[2]。目前培養(yǎng)豬睪丸（swine testis，ST）細胞的DMEM主要依賴進口，價格昂貴，而且受限因素很多。近幾年，國產(chǎn)DMEM發(fā)展迅速。本研究對國產(chǎn)和進口DMEM培養(yǎng)ST細胞的效果進行比較，并對豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）、豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）和豬傳染性胃腸炎病毒 （transmissible gastroenteritis virus，TGEV）在國產(chǎn)和進口培養(yǎng)基培養(yǎng)的ST細胞中敏感性進行分析，以期為國產(chǎn)DMEM大規(guī)模培養(yǎng)病毒等提供科學依據(jù)。

1? 試驗材料

1.1 細胞和病毒毒株

ST細胞株購自湖南豐暉生物科技有限公司。PRVsx-gE、PPV和TGEV毒株由上海市農(nóng)業(yè)科學院動物疾病診斷檢測中心保存。

1.2 試劑及耗材

進口DMEM、新生牛血清、胰酶購自GIBCO公司，國產(chǎn)DMEM由上海源培生物科技股份有限公司提供。

1.3 主要儀器

CO₂培養(yǎng)箱購自Thermo公司;Retiga 2000R高敏感度冷熒光數(shù)碼顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

2? 試驗方法

2.1 ST貼壁細胞培養(yǎng)

取形成致密單層的適量T-75方瓶ST細 胞，用含0.2%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的PBS清洗3次，加入 0.25%胰酶消化片刻，傾去胰酶，分別用含10%新生牛血清的國產(chǎn)與進口DMEM制備成細胞懸液，將細胞初始接種密度統(tǒng)一為0.25×10⁶個/mL，每組重復做4瓶，37 ℃培養(yǎng)72 h。

2.2 ST貼壁細胞連續(xù)傳代

細胞培養(yǎng)成致密單層后，按照“2.1 ST貼壁細胞培養(yǎng)”中的方法消化ST貼壁細胞，分別用含10%新生牛血清的國產(chǎn)與進口DMEM制備成細胞懸液，將細胞初始接種密度調(diào)整為0.25×10⁶個/mL，每組重復做3瓶，取其平均數(shù)，37 ℃培養(yǎng)72 h后傳代，連續(xù)傳10代。觀察不同DMEM對細胞連續(xù)傳代的影響。

2.3 病毒培養(yǎng)試驗

分別取國產(chǎn)與進口DMEM培養(yǎng)的致密單層的適量T-75方瓶ST細胞，按照“2.1 ST貼壁細胞培養(yǎng)”中的方法消化ST貼壁細胞，分別用含10%新生牛血清的國產(chǎn)與進口DMEM制備成細胞懸液，按1∶4接種傳代，37 ℃培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基后加入適量PBS洗滌3次，分別接種培養(yǎng)PPV、PRV和TGEV，具體操作如下：

2.3.1 ST細胞接種PPV

取洗滌好的ST細胞各3瓶，每瓶按1%接種PPV工作種毒，37 ℃恒溫箱內(nèi)吸附1.5 h，向瓶內(nèi)分別加入國產(chǎn)或者進口DMEM的細胞維持液（含1%～2%的犢牛血清）至10 mL，使維持液中毒種含量為0.1%，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)96 h。觀察到50%以上的細胞出現(xiàn)明顯病變時收獲，反復凍融3次后測定滴度。

2.3.2 ST細胞接種PRV

取洗滌好的ST細胞各3瓶，每瓶按1%接種PRV工作種毒，37 ℃恒溫箱內(nèi)吸附1 h，向瓶內(nèi)分別加入國產(chǎn)或者進口DMEM的細胞維持液（含1%～2%的犢牛血清）至10 mL，使維持液中毒種含量為0.1%，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。觀察到70%以上細胞出現(xiàn)拉絲變長、拉網(wǎng)脫落現(xiàn)象時收獲，反復凍融3次后測定滴度。

2.3.3 ST細胞接種TGEV

操作同上，觀察到70%以上細胞呈顆粒狀、拉網(wǎng)脫落現(xiàn)象，液相的透明度渾濁（但不是污染的云煙狀）時收獲，反復凍融3次后測定滴度。

2.4 細胞密度和TCID50測定

用含0.2% EDTA的PBS清洗3次，加入0.25%胰酶消化片刻，傾去胰酶，用DMEM制備成細胞懸液，取樣后用含10 g/L結(jié)晶紫的檸檬酸溶液染色，用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞。TCID50測定按照常規(guī)方法測定。

3? 結(jié)果與分析

3.1 ST貼壁細胞培養(yǎng)情況

由表1可知，用國產(chǎn)與進口DMEM培養(yǎng)ST細胞，72 h后細胞均增殖到1.25×10⁶個/mL以上，增加了5倍多，兩者無顯著差異（P>0.05），表明國產(chǎn)DMEM適合用于ST貼壁細胞培養(yǎng)。

3.2 ST細胞連續(xù)傳代情況

結(jié)果（表2）顯示，用國產(chǎn)DMEM靜止培養(yǎng)72 h，第1代～第10代細胞密度均達到1.25×10⁶個/mL以上，與進口DMEM相似，兩者無顯著差異（P>0.05），表? 明國產(chǎn)DMEM也可以連續(xù)傳代培養(yǎng)ST細胞。

3.3 PPV、PRV和TGEV在ST細胞中的增殖

如表3所示，兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)同一病毒的滴度相近，兩者無顯著差異（P>0.05），初步表明PPV、PRV和TGEV在用國產(chǎn)DMEM培養(yǎng)的ST細胞中能正常增殖。

4? 結(jié)論與討論

為了評價國產(chǎn)DMEM的質(zhì)量，以進口DMEM為對照，比較兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)ST細胞的生長狀態(tài)和幾種病毒在ST細胞中增殖的一致性。本試驗結(jié)果表明，國產(chǎn)DMEM培養(yǎng)ST細胞的生長狀態(tài)與進口DMEM相似，用國產(chǎn)DMEM培養(yǎng)ST細胞來增殖PPV、PRV和TGEV，均能到達毒價標準。

李建平等[3]比較了國產(chǎn)與進口DMEM培養(yǎng)CHO-C28細胞的培養(yǎng)上清中HBsAg表達水平，發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)培養(yǎng)基略好于進口培養(yǎng)基，二者純化圖譜和抗原電泳圖譜一致。

用原來過濾系統(tǒng)除菌過濾培養(yǎng)基，進口培養(yǎng)基通透性優(yōu)于國產(chǎn)，可能是添加的營養(yǎng)成分不同所致;更換過濾系統(tǒng)后二者通透性基本一致。

綜上所述，通過利用國產(chǎn)DMEM培養(yǎng)ST細胞及應用于PRV、PPV和TGEV的增殖培養(yǎng)，國產(chǎn)DMEM達到了進口培養(yǎng)基水平，可用于規(guī)?；a(chǎn)。

參考文獻

[1] 張振興，姜平.實用獸醫(yī)生物制品技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1996.

[2] 張元興，易小萍，張立，等.動物細胞培養(yǎng)工程? ? ?[M].北京：化學工業(yè)出版社，2007.

[3] 李建平，周長，軍王宇，等.國產(chǎn)與進口DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO-C28細胞效果比較[J].中國生物制品學雜志，2007，20（3）：219-222.