馬玉瑋 潘佐泱 丁義東 張雪杰 戴炎榮 岳云 何生存 賈孟輝

【摘 要】 目的：觀察巴豆霜對大鼠腦缺血再灌注模型ERK5蛋白水平的影響，以期探討巴豆霜對缺血性腦血管疾病的保護機制。方法：將192只SPF級SD雄性大鼠隨機分為假手術組（A組）、巴豆霜高劑量組（B組）、巴豆霜中劑量組（C組）、巴豆霜低劑量組（D組）、尼莫地平組（E組）和模型組（F組），每組36只。除假手術組外，其余5組參照改良的Longa法用線栓阻塞大鼠右側大腦中動脈制備局灶性腦缺血模型，根據取材時間點的不同分為1d、3d、7d組。所有SD大鼠取材前需參照Garcia JH法進行神經功能評分。所有SD大鼠均采取同一時間點灌胃，每天兩次。應用HE染色法，用光學顯微鏡觀察SD大鼠不同時間點CA1區(qū)腦組織病理學形態(tài)的變化;應用RT-PCR法、Western Blot檢測觀察MAPK-ERK通路中ERK5的表達情況。結果：與假手術組相比，各組神經功能評分評分均下降、ERK5的磷酸化水平均升高、 ERK5的mRNA相對表達明顯升高（P<0.01）;與模型組相比，各藥物組神經功能評分均增加、ERK5的磷酸化水平均下降，ERK5mRNA相對表達均下降（P<0.01）;各藥物治療組中，巴豆霜高劑量組神經功能評分優(yōu)于其它組，ERK5的磷酸化水平及ERK5的mRNA相對表達較其它組均降低，且逐漸接近假手術組;觀察各組大鼠神經元的形態(tài)結構。結果表明，模型組SD大鼠與假手術組相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經細胞出現不同程度核固縮、核體不規(guī)則、細胞間隙增大、間質水腫、核與質排列不清;與模型組相比，各藥物治療組能不同程度改善核固縮程度、減少細胞及間質的水腫，使胞膜清晰，形態(tài)改善;各藥物治療組中，以巴豆霜高劑量組對細胞形態(tài)的改善程度最為明顯。結論：巴豆霜可改善大鼠腦缺血再灌注后的神經功能損傷，發(fā)揮促進神經元細胞增殖分化，這可能與其參與調節(jié)MAPK-ERK通路中ERK5 的表達相關。

【關鍵詞】 ?巴豆霜; 腦缺血再灌注;MAPK-ERK;ERK5

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）09-0023-07

Effects of Croton Cream on the Extracellular Signal-regulating Protein

Kinase 5 Pathway in Hippocampus of Focal Cerebral Ischemia Reperfusion Rats

MA Yuwei1，3 PAN Zuoyang1 DING Yidong3 ZHANG Xuejie1 DAI Yanrong1

YUE Yun1 HE Shengcun1 JIAMenghui2，4△

1.Ningxia Medical University， Yinchuan 750004，China;

2. The Second Affiliated Hospital of Ningxia Medical University， Yinchuan 750001，China;

3.Haiyuan County Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhongwei City， Haiyuan 751800，China;

4.Key Laboratory of Ningxia Ethnomedicine Modernization， Ministry of Education，

Ningxia Medical University， Yinchuan 750004，China

Abstract：Objective To observe the effects of Semen Crotonis Pulveratum on ERK5 protein level in rat cerebral ischemia-reperfusion model， in order to explore the protective mechanism of Crotonis cream on ischemic cerebrovascular disease. Methods 192 SPF SD male rats were randomly divided into sham operation group （group A）， croton cream high-dose group （group B）， croton cream medium-dose group （group C）， croton cream low-dose group （group D）， Nimodipine group （group E） and model group （group F）， with 36 rats in each group. Except for the sham operation group， the other 5 groups were divided into 1d， 3d and 7d groups according to the different sampling time points by using the modified Longa method to prepare the focal cerebral ischemia model of the right middle cerebral artery in rats. Garcia JH method was used for neurological function score of all SD rats before sampling. All SD rats were given gavage twice a day at the same time point. HE staining and light microscope were used to observe the changes of brain histomorphology in CA1 region of SD rats at different time points. The expression of ERK5 in MAPK-ERK pathway was detected by RT-PCR and Western Blot.Results Compared with the sham operation group， the neurological function score in all groups was decreased， the phosphorylation level of ERK5 was increased， and the relative expression of ERK5 mRNA was significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， neurological function scores in all drug groups were increased， the phosphorylation level of ERK5 was decreased， and the relative expression of ERK5 mrna was decreased （P<0.01）; Among the drug treatment groups， the neurological function score of croton cream high-dose group was better than other groups， the phosphorylation level of ERK5 and the relative expression of ERK5 mRNA were lower than other groups， and gradually close to the sham group. The morphological structure of neurons in each group was observed. The results showed that compared with the sham operation group， different degrees of nuclear pyknosis， irregular nuclear body， enlarged intercellular space， interstitial edema， and unclear arrangement of nucleus and plasm were observed in the hippocampal CA1 region of SD rats in model group. Compared with the model group， the drug treatment groups could improve the degree of nuclear pyknosis， reduce the edema of cells and stroma， make the cell membrane clear， and improve the morphology. Among all drug treatment groups， croton cream high-dose group had the most obvious improvement on cell morphology.Conclusion? Croton cream can improve the neurological injury after cerebral ischemia-reperfusion in rats， and promote the proliferation and differentiation of neurons， which may be related to its involvement in regulating the expression of ERK5 in mapK-ERK pathway.

Key words：Croton Cream; Cerebral Ischemia Reperfusion; MAPK-ERK; ERK5

急性缺血性腦卒中是各種原因導致的腦組織血液供應障礙，并由此產生缺血缺氧性壞死，進而出現神經功能障礙的一組臨床綜合征[1]。本病是常見的卒中類型，約占全部卒中的60%～80%。其年發(fā)病率為109.7/10萬～217/10萬，致殘率高達75%，死亡率為116/10萬～141.8/10[2]。在我國致殘病因中位居榜首，且男性發(fā)病率高于女性，給患者的家庭帶來了巨大的經濟壓力。然而該疾病的病因和發(fā)病機制較為復雜，現代醫(yī)學對其針對性的治療手段有所欠缺。因此，積極尋求防治缺血性腦卒中的有效療法和藥物，無疑具有深遠的社會意義。

目前，現代醫(yī)學對缺血性腦血管病的治療，主要包括內服藥物和外科手術治療，如擴容、抗凝、血液稀釋、血管介入等系列療法，其中改善腦局部血液循環(huán)和神經保護是近年來的研究熱點[3]。盡管這些方法在臨床中取得了一定的成效，但由于自身所存在的局限性，療效終究未能令人滿意，如治療周期長、出血風險高、副作用多、治療花費大等。因此積極尋求一種低廉、有效、安全、副作用少的治療方法，已成為當今社會亟需解決的重點問題。有研究[4-5]表明，失苔刺知丸及各拆方巴豆霜組均可改善大鼠腦缺血再灌注后的神經功能損傷，這可能與其參與調節(jié)MAPK-ERK通路中ERK5 的表達相關。本研究通過對ERK5的檢測，探討巴豆霜的相關的神經保護策略。

巴豆為大戟科植物巴豆的干燥成熟果實，其味辛、性熱，有大毒，外用治療惡瘡疥癬、疣痣[6]。其主要含有脂肪油（ 40%～60% ）、生物堿、蛋白質（約18% ）、萜類等成分[7]?，F代研究[8]表明，巴豆油具有強烈刺激性，吸收后能與腸液作用生成巴豆酸，引起劇烈的瀉下作用;查閱歷代文獻可以發(fā)現，自漢代《神農本草經》收錄以來，已經創(chuàng)造和總結了諸多合理巴豆炮制方法和經驗，如：制霜、熬、煨、炮等方法去毒，應用麥麩、大麥、面、米等輔料減毒增效，而現代巴豆的炮制主要是取仁生用和制霜2種[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本實驗SD大鼠的使用按寧夏醫(yī)科大學動物倫理委員會批準的程序進行， 選取體重220～250 g的大鼠飼養(yǎng)在裝有空調房間的聚丙烯籠中，保持溫度在（22±0.5）℃，光/暗周期12 h/12 h，并用標準實驗室飼料和水隨時飼養(yǎng)。

1.1.2 藥品與主要試劑 巴豆霜由寧夏銀川市第一人民醫(yī)院藥劑科提供;實驗中所用西藥尼莫地平片（nimodipine tablets）規(guī)格為：30 mg×20片，國藥準字H20003010。水合氯醛（分析純）、無水乙醇（分析純，北京化學試劑公司）、二甲苯、蘇木精水溶液、伊紅染色液、0.9%氯化鈉注射液、蒸餾水、磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液等由寧夏醫(yī)科大學實驗室提供;ERK5 抗體、Phospho- ERK5 antibody （Affinity，AF3318）、山羊抗兔（bioeasy，BE0101）、Actin（easybio，BEO021）。

1.1.3 儀器 電子天平（Sartorius公司，德國）、移液槍（Eppendorf公司，法國）、-80℃低溫冰箱（青島海爾）、聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Milipore，美國）、醫(yī)用X射線膠片（柯達公司，美國）、組織切片機（RM 2235，德國LEICA公司）、高速離心機（Eppendorf公司，德國）、轉移脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造公司），電泳儀（北京六一儀器廠）、凝膠玻璃板、固定夾、垂直電泳槽、轉移槽（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及用藥 分組：將192只SD雄性大鼠進行隨機分組，平均每組12只，共16組，分別為：假手術組（A組）12只，巴豆霜高劑量組（B組）12只，巴豆霜中劑量組（C組）12只，巴豆霜低劑量組（D組），尼莫地平組（E組）各12只，模型組（F組）12只，而后5組實驗組又依據取樣時間點的不同分為1 d、3 d、7 d組。用藥：所有雄性SD大鼠統(tǒng)一時間點灌胃，2次/d（早晚各1次）。假手術組（A組）不分時間，總共灌胃7 d，而后5組依照1 d、3 d、7 d 3個時間點進行灌胃。其中假手術組（A組）和模型組（F組）稱重后給予生理鹽水灌胃1 mL/100 g;巴豆霜高劑量組（B組）、巴豆霜中劑量組（C組）、巴豆霜低劑量組（D組）、尼莫地平組（E組）各組依各組用藥進行灌胃，灌胃劑量為1 mL/100 g，具體灌胃劑量則根據SD雄性大鼠每日稱重而定。

1.2.2 大鼠腦缺血再灌注模型制備 以改良的Longa法[10]行大鼠大腦中動脈阻斷（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后缺血再灌注損傷模型的制備。

1.2.3 模型納入標準 用MCAO 模型SD大鼠缺血2 h后進行再灌注，根據大鼠神經功能表現分別對應下表中的評分項標準，而1分、2分、3分的視為模型成功，將其納入實驗，其余則為模型失敗，將其剔除。

1.2.4 神經功能缺損評分 SD大鼠進行取材之前，根據Garcia JH[11]神經功能評分表進行相應評分，每組SD大鼠的評分為六項測試的加和。除假手術組外，大鼠神經功能評分加和超過15分的予以剔除。而其他組神經功能評分控制在3～18分之間，評分越高，神經功能恢復程度越好，反之則越差。

1.2.5 取材及標本制備 取材分別于術后1 d、3 d、7 d進行。10%水合氯醛按0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，隨機選取每組大鼠中的12只，麻醉后迅速打開已放置在冰袋上的大鼠的胸腔，使其心臟充分暴露，找準心尖，插管并快速用0.9%生理鹽水沖洗灌注，當看到流出液顏色變清澈，肝臟血色退去，換4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌流固定，至肝臟變硬時，大腦內固定成功，迅速斷頭取出新鮮全腦組織，固定在4%多聚甲醛固定液中，然后做腦部冠狀切片，用于HE染色、免疫熒光檢測。每組其余大鼠于各時間點麻醉后處死，于冰上快速斷頭取出新鮮腦組織并迅速剝離海馬組織，剝出的海馬組織立即裝入凍存管放置于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot和PCR的檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。本次實驗數據使用兩因素多水平的析因設計資料的方差分析。數據需滿足隨機、正態(tài)、方差齊性，若數據滿足總體方差齊性，兩因素間無交互作用，則用雙向方差分析法，有交互作用時用完全隨機設計的方差分析法。若不滿足，則對數據進行轉換使總體方差齊，再進行上述分析方法的選擇。在進行組間多重比較時，使用SNK-q檢驗方法進行組間全面的兩兩比較。結果則以均數加減標準差（x±s）表示，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組SD大鼠Garcia JH評分比較 本研究采用Garcia JH評分量表對大鼠神經功能進行評估。結果顯示，與假手術組相比，模型組和各藥物治療組的神經功能評分明顯降低，最小值出現在I/R模型組。隨著巴豆霜濃度的增加，神經功能評分逐漸升高。尼莫地平組得分略高于巴豆霜低劑量組，低于巴豆霜中劑量組和高劑量組。除假手術組外，所有組的神經功能評分均隨時間的延長而增加（表1）。

2.2 HE染色法觀察各組大鼠腦組織缺血側病理形態(tài)學改變 經HE染色，觀察各組大鼠神經元的形態(tài)結構。結果表明，與假手術組（A組）相比，模型組神經元（F組）松散排列、無序、模糊，細胞核和細胞質之間的界限不清楚。給予巴豆霜后，神經細胞損傷大大緩解，壞死和凋亡細胞的數量減少，特別是高劑量巴豆霜組（SCP）。尼莫地平組與模型組相比，尼莫地平也能明顯改善大鼠的組織損傷情況。并且，經高、中劑量組的巴豆霜治療后，神經細胞損傷逐漸減輕或維持穩(wěn)定。如圖1所示。

2.3 蛋白質印跡法測腦缺血再灌注大鼠腦組織海馬區(qū)ERK5表達結果 結果顯示，這些蛋白的磷酸化水平在造模后的大鼠缺血腦組織中與假手術組相比均上調;然而，使用巴豆霜和尼莫地平藥物后，這些相關蛋白水平與假手術組相比明顯降低。同時，在同一處理時間下，通路相關蛋白表達在不同濃度SCP組之間也有明顯差異，隨著SCP濃度度的增加，ERK5、p-ERK5表達水平逐漸下調，并逐漸接近假手術組;尼莫地平組與巴豆霜的低劑量組之間的蛋白表達在1 d和3 d有明顯差異，但在7 d無差異;尼莫地平與巴豆霜的高、中劑量組之間均有差異。在同一組內，ERK5和p-ERK5的濃度隨著時間的推移呈上調趨勢。如圖2所示和見表2。

2.4 腦缺血再灌注大鼠腦組織海馬區(qū)ERK5 的mRNA相對量結果 經PCR檢測MAPK信號通路相關蛋白的mRNA，包括ERK5和p-ERK5的mRNA水平。結果顯示，這些蛋白的mRNA表達水平在造模后的大鼠缺血腦組織中與假手術組相比均上調（如圖3、4所示）;然而，使用巴豆霜和尼莫地平藥物后，這些相關蛋白的mRNA表達水平與假手術組相比明顯降低。同時，在同一處理時間下，通路相關蛋白的mRNA相對表達量在巴豆霜不同濃度組之間也有明顯差異，隨著巴豆霜濃度度的增加，ERK5的mRNA表達水平逐漸下調，并逐漸接近假手術組;尼莫地平組與巴豆霜低劑量組之間的蛋白表達在1 d和3 d有明顯差異，但在7 d無差異;尼莫地平與巴豆霜的高、中劑量組之間均有差異。在同一組內，ERK5 mRNA隨著時間的推移呈上調趨勢。見表3。

3 討論

巴豆治療腦病歷史悠久，源遠流長，早在東漢時期，就有巴豆霜治療腦病的記載。《本草》云：“巴豆，破癥瘕、結聚、堅積、留飲、痰癖?！盵12]宋代唐慎微《證類本草》云：“治中風，巴豆七枚，去皮研爛。涂兩手心，以暖水一盞，安向手心，須臾即便正，洗去藥，并頻抽掣中指。”[13]清代汪昂《本草備要》曰：“巴豆油作紙拈燃火后吹息，或熏鼻，或刺喉，能行惡涎惡血，治中風中惡……一切急病。”[14]由此可以發(fā)現，歷代醫(yī)家在治療腦卒中方面，擅用巴豆霜，并取得了良好的療效。而對寧夏少數民族醫(yī)藥的文獻檢索發(fā)現，凡是治療腦病的方劑中都含有巴豆霜，經統(tǒng)計，寧夏少數民族經典方[15]中“眾風門”“雜證門”現存460首方劑中，含巴豆霜的方劑就有73首，占比15.87%，所載“巴豆丸”“失荅剌知丸”“扎里奴思方”“又扎里奴思方”等可用于治療腦卒中口眼歪斜、半身不遂。目前，導師及其團隊對“失荅剌知丸”在腦系疾病的臨床防治和實驗研究方面取得了一定的成果，失荅剌知丸有著消痰利水、化積散結、芳香開竅、啟閉通絡的功效。在臨床方面，失荅剌知丸可以改善缺血性中風恢復期患者神經功能缺損癥狀，如失眠、便秘、癡呆、吞咽功能障礙等[16-20]。對腔隙性腦梗死患者認知功能障礙發(fā)揮有效作用[21]，并且在對椎-基底動脈供血不足的治療中效果顯著[22]。在實驗方面，探討了失荅剌知丸對大鼠腦缺血再灌注后的神經功能損傷、神經細胞凋亡，均具有改善作用，這可能與其參與調節(jié) MAPK-ERK通路中ERK1/2及ERK5的表達相關[23-25]。

為了進一步證實巴豆霜在防治腦病發(fā)揮的作用，筆者將失荅剌知丸進行了拆方研究，其中拆方研究發(fā)現以巴豆霜加三藥（柴胡、黑訶子、蘆薈）組療效最好，因此考慮該組藥可能是失荅剌知丸中能有效改善腦缺血再灌注損傷的主要藥物組成，在對比各拆方組的方藥發(fā)現，各拆方組中均含有巴豆霜，且巴豆霜單味藥能夠減輕大鼠腦缺血再灌注后的神經功能的損傷程度。因此，筆者提出如下假說，巴豆霜可能是失荅剌知丸的君藥，并且巴豆霜可能在腦保護機制中發(fā)揮著重要作用。為進一步證實失荅剌知丸發(fā)揮腦保護作用的是巴豆霜，筆者在拆方研究的基礎上將巴豆霜單味藥拿出研究，研究的目的就是找到巴豆霜在改善腦缺血再灌注損傷方面是否具有明顯效果，為進一步簡化方藥組成以及進一步提純藥物的有效成份，改變中藥制劑劑型做準備。

ERK是MAPK家族中重要的成員之一，它正常狀態(tài)下處在靜止的胞質里，但激活后移動至胞核，從而發(fā)揮其作用。當大腦發(fā)生缺血或缺氧后，廣泛存在于中樞神經系統(tǒng)中的ERK蛋白，在神經元中被激活進而參與細胞的各種應急反應，調節(jié)細胞的凋亡、增殖和分化等一系列生理活動。MAPK信號通路被細胞外應激激活物激活后，其發(fā)揮作用遵循MAPKs的三級酶促級聯(lián)反應，Ras/Raf/ERK級聯(lián)是調控細胞增殖、細胞周期和凋亡的重要通路[26]。簡而言之，Ras引導并激活蛋白激酶Raf，而后者可以通過促進ERK的磷酸化程度調控機體的生物化學反應[27]。

ERK5是1995年被Zhou等[28]和Lee等[29]首次克隆并測定的，其位于細胞質和細胞核中，分子量為115000，因其分子量較大，故也稱大MAPK通路[30]。當MAPK信號通路被細胞外應激激活物激活后，MAPK以三級激酶級聯(lián)酶促反應的方式將信號轉導至家族其他信號通路，ERK5作為MAPK中獨特的激酶，ERK5的活化形式為pERK5，活化后的ERK5進入細胞核通過磷酸化發(fā)揮抗凋亡的作用[31]。同時也對細胞的生存、增殖、分化等有重要的調節(jié)作用。腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，毛成遠等[32]使用三七皂苷Rg1對血管性癡呆大鼠模型進行干預，發(fā)現三七皂苷Rg1能抑制海馬神經元凋亡，改善海馬組織炎癥和氧化損傷，從而提高VD大鼠認知功能，其機制可能與MEK5/ERK5信號通路激活有關。聶葵葵等[33]持續(xù)觀察了大鼠腦缺血與腦出血轉變時其腦組織ERK5的活化表達程度，結果證實：大鼠腦缺血與腦出血的轉化能夠誘發(fā)相應蛋白的磷酸化表達，進而在腦缺血及出血轉變歷程中發(fā)揮積極作用，從而進一步證實了ERK5對神經細胞的保護作用。

本實驗結果表明，通過HE的檢測，發(fā)現巴豆霜能夠修復缺血性腦卒中神經細胞的形態(tài)結構，改善腦缺血損傷引起的神經功能缺損。這提示，巴豆霜對再灌注損傷大鼠的腦缺血損傷有明顯的神經保護作用，這種神經保護作用可能與實驗性缺血后大鼠認知功能的改善有關[34]。通過免疫印跡和PCR結果分析顯示，模型組和各藥物干預組中ERK5蛋白的磷酸化表達和mRNA的增殖在1～3 d內上升較為明顯，而在3～7 d內逐漸趨于平穩(wěn)，這說明細胞的增殖和修復是有閾值的，如果達到閾值后，細胞將進入相對緩慢的修復和增殖過程。但是經藥物組治療后發(fā)現，p-ERK5的水平呈下降趨勢，且隨時間的推移，逐漸接近假手術組的表達水平;其中巴豆霜高劑量組表達水平下降最為明顯。腦缺血后大鼠ERK5通路被激活，參與損傷后神經元細胞的修復和增殖，從而發(fā)揮神經保護作用?；谶@些發(fā)現，可以得出結論，巴豆霜可改善腦缺血再灌注中細胞的受損情況，增強細胞的增殖活動，從而發(fā)揮腦保護作用。

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（收稿日期：2021-09-06 編輯：陶希睿）