01市場(chǎng)背景

從古至今，“一白遮百丑的”觀念始終深入人心。即使社會(huì)對(duì)“美麗女性”的定義會(huì)隨著文化和時(shí)尚的演變而不斷調(diào)整，但唯獨(dú)“膚白”的標(biāo)準(zhǔn)始終屹立不倒。根據(jù)智研咨詢發(fā)布的《2017—2022年中國美白市場(chǎng)監(jiān)測(cè)及前景預(yù)測(cè)報(bào)告》，超過80%的女性有美白需求。

另外根據(jù)美麗修行大數(shù)據(jù)顯示，2021年美白祛斑市場(chǎng)規(guī)模高達(dá)5013億元。因此在美白的道路上，女性尤其是亞洲女性的追求永無止境，并最終為美白活性成分的持續(xù)發(fā)展增加推動(dòng)力。

02開發(fā)思路

開發(fā)一種新型皮膚增白劑的方法有很多。包括：①抑制黑色素生成;②抑制黑色素從黑色素細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)移;③抑制黑素細(xì)胞樹突生長;④抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的促黑色素因子如α-MSH或內(nèi)皮素-1;⑤促進(jìn)黑色素代謝[1，2，3]。在這些策略中，通過抑制酪氨酸酶活性來抑制黑色素的產(chǎn)生是最有效的。因?yàn)槔野彼崦复呋撕谏厣锖铣蛇^程中第一步及速度控制步的反應(yīng)，即由酪氨酸羥基化生成3，4一二羥基苯丙氨酸（多巴）。

羥基芪化合物已被證明是有效的酪氨酸酶抑制劑。白藜蘆醇是一種植物抗毒素，可從毛葉藜蘆（根）、西伯利亞紅松（樹皮）、葡萄等多種植物中提取。而氧化白藜蘆醇是從桑葉中提取的一種活性物質(zhì)也是這類物質(zhì)的主要代表。白藜蘆醇與曲酸具有相同的活性，但其氧化活性是曲酸的32倍[4]。此外，從面包果樹中提取的二苯乙烯衍生物，如高黃綠桑和異戊二烯氧化白藜蘆醇，其效果分別是曲酸的33.3倍和13.1倍[5]。但眾所周知，二苯乙烯極其不穩(wěn)定，兩個(gè)苯環(huán)之間的反式雙鍵在輻射下容易發(fā)生異構(gòu)反應(yīng)，形成相應(yīng)的順式二苯乙烯。后者快速分解，形成環(huán)丁烷二聚體和更多的高分子量光化學(xué)產(chǎn)物。

我們的目標(biāo)是開發(fā)一種具有優(yōu)良美白效果的光穩(wěn)定二苯乙烯衍生物。我們從樟子松（Pinussylvestris）的親脂提取物中發(fā)現(xiàn)3，5-二羥基二苯乙烯和3-0-甲基衍生物，它們是優(yōu)良的酪氨酸酶抑制劑，但光照不穩(wěn)定。因此，我們通過化學(xué)合成對(duì)赤松的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改進(jìn)，以獲得最佳的功效和穩(wěn)定性。最后以二苯基甲烷衍生物4-（1-苯乙基）-1，3-對(duì)苯二酚（SymWhite？377）為靶向成分，進(jìn)行了大量的功效試驗(yàn)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明它是一種高效的皮膚增白劑。

03功效驗(yàn)證

3.1材料

蘑菇酪氨酸酶（EC.1.14.18.1），購自FLUKAChemieGmbH（Buchs，Switzerland）;l-3，4-二羥基苯丙氨酸，購自跨有機(jī)公司（美國新澤西州）;所有細(xì)胞培養(yǎng)液來自cambrex（Verviers，Belgium）;Melanoderm水平el-300-b型，MattekCorporation（Ashland，Ma，USA）;所有其他試劑（分析純）均購自sigma（Taufkirchen，德國）。

3.2酪氨酸酶分析試驗(yàn)

在含50μg/ml蘑菇酪氨酸酶的66.7mM磷酸鹽緩沖液（pH6.8）中進(jìn)行酪氨酸酶反應(yīng)，試驗(yàn)化合物（最終濃度為0.1—1000μg/ml）。反應(yīng)混合物在96孔微孔板上37°C預(yù)培養(yǎng)10min。加入L-3，4-二羥基苯丙氨酸0.1mg/ml（終濃度），在474nm處用分光光度計(jì)測(cè)定所形成的多巴色素。抑制效果用試驗(yàn)樣品與對(duì)照樣品的比值來表示。計(jì)算其IC50值（50%抑制濃度）。

3.3細(xì)胞毒性分析試驗(yàn)

將3T3小鼠纖維瘤細(xì)胞或B16v小鼠黑色素瘤細(xì)胞以1x104細(xì)胞/孔（3T3）和2x104細(xì)胞/孔（B16v）的密度接種在96孔微孔板中。然后，在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（3T3）或RPMI培養(yǎng)基（b16v）中，37℃和5%C02孵育24h，去除培養(yǎng)基，立即配制待測(cè)復(fù)方溶液和十二醇硫酸鈉溶液（陽性標(biāo)準(zhǔn)品），在新鮮培養(yǎng)基（5%胎牛血清）中溶解，加入微孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)8h。然后去除培養(yǎng)基，用MTT（3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯四唑溴化銨）培養(yǎng)細(xì)胞2h。用異丙醇提取染料后，在570nm處測(cè)定其吸光度（a），并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞活性：活性（%）=（一個(gè)試驗(yàn)物質(zhì)/一個(gè)對(duì)照樣品）X100%。

3.4對(duì)B16v細(xì)胞的色度分析試驗(yàn)

將B16v小鼠黑色素瘤細(xì)胞以5X10細(xì)胞/孔的密度接種于96孔微孔板中。再添加10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2孵育24h，再加入待測(cè)復(fù)合物溶液（溶劑：細(xì)胞培養(yǎng)液）和10nMα-MSH，培養(yǎng)96h。同樣數(shù)量的培養(yǎng)基也被用于控制。用NaOH提取細(xì)胞中的黑色素后，在400nm處測(cè)量吸光度（a），計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。黑色素合成抑制率計(jì)算公式如下：色素沉積抑制率（%）=100-[（試驗(yàn)品A/對(duì)照品）X100%]。

3.5在染色3D表皮模型上的分析試驗(yàn)

MelanoDermtmmel-300-b模型（皮膚類型IV，0.6cm2）在制造商提供的37°C和5%CO2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將4-（1-苯乙基）-1，3-對(duì)苯二酚溶于磷酸鹽緩沖液中，分別作用于模型表面（25μL/模型，2個(gè)表皮模型），得到0.01%或0.1%的溶液。對(duì)照組用純磷酸鹽緩沖液處理。試驗(yàn)化合物每天一次涂抹表皮模型，每隔一天更換培養(yǎng)基。待培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間后，用手術(shù)刀將表皮模型從插入物中分離，用Soluene溶劑（30min，60°C）提取，在400nm處測(cè)量上清液的吸光度，并與人工合成黑色素的吸光度進(jìn)行定量分析黑色素含量。

為了測(cè)定細(xì)胞毒性，將表皮模型按上述方法分別培養(yǎng)在有或無試驗(yàn)化合物的情況下。14d，3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四苯唑（MTT）處理3D表皮模型3h，異丙醇提取染料，570nm處測(cè)定吸光度。

3.6體內(nèi)法試驗(yàn)

在非輻照皮膚上進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)：在12名亞洲受試者（皮膚類型為III）的背部每天處理2次（面積：12.5cm2），持續(xù)28天。測(cè)試階段不允許紫外線照射。在第0天和第28天，通過視覺評(píng)分和色度計(jì)（L*值，MinoltaCR-300色度計(jì)，大阪，日本）評(píng)估皮膚顏色的變化。

3.7穩(wěn)定性測(cè)試

將含有0.05%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的水溶液在不同溫度（5°C，室溫，40°C）和pH5.0-9.0條件下培養(yǎng)12周，采用HPLC（HP1100，AgilentTechnologies，waldbronn，Germany）進(jìn)行定量分析。

光穩(wěn)定性試驗(yàn)中，將相應(yīng)組分溶解于甘油中，配制成1%的溶液，分散在12片（20μL/片）上。4張玻片分別在陽光模擬器下照射2h和4h。另取4張作為對(duì)照。樣品經(jīng)輻照后提取，用高效液相色譜法定量。計(jì)算光降解率相對(duì)于對(duì)照物質(zhì)（=100%）。

在色牢度測(cè)試中，制備含0.5%4-（1-苯乙基）-1，3-醌，含或不含0.5%二苯甲酮-3和0.1%EDTABD的油/水型標(biāo)準(zhǔn)洗劑（pH5.4），用紫外線300WsuntestCPS（Heraeus，Hanau，Germany）燈泡照射24小時(shí)，然后用色度計(jì)分析樣品相對(duì)于安慰劑的顏色變化。褪色等級(jí)用輻照前后的值△b*表示。

04結(jié)果與討論

在樟子松的乙醇提取物中，除了主要成分松香酸（一種常見于針葉樹中的二萜）外，我們還發(fā)現(xiàn)了二苯乙烯衍生物3，5-二羥基二苯乙烯（赤霉素）和赤霉素-3-0-甲基醚（見圖1）。這兩種二苯乙烯衍生物可以用制備液相色譜法進(jìn)行分離。但是，我們觀察到赤霉素在紫外線照射下迅速分解（見表1）。

為了獲得更穩(wěn)定的增白靶點(diǎn)，我們通過雙鍵加氫制備了相應(yīng)的二氫化衍生物。這些化合物二氫chisin和二氫chisin-3-o-甲基醚也是松木[6]中微量的天然成分。光穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，與赤霉素相比，二氫赤霉素具有較高的光穩(wěn)定性（見表1）。

4.1酪氨酸酶抑制

采用曲酸、對(duì)苯二酚和β-熊果苷混合，對(duì)松二苯乙烯和二氫二苯乙烯的類似物進(jìn)行蘑菇酪氨酸酶抑制試驗(yàn)。赤霉素-3-O-甲基醚和二氫赤霉素-3-O-甲基醚均不活躍，說明3-OH在酪氨酸酶抑制中起主要作用。這些結(jié)果與ohguchietal.（2003A）[7]的檢驗(yàn)相關(guān)，ohguchietal.（2003A）[7]發(fā)現(xiàn)與雷公藤素相比，雷公藤素-3，5-二甲醚對(duì)蘑菇酪氨酸酶沒有抑制作用。有趣的是，二氫赤霉素對(duì)酪氨酸酶的抑制效果優(yōu)于赤霉素（50%抑制濃度的IC50值為39.4μM和166.7μm），接近曲酸（IC50值為11.05μm）（見表2）。這一發(fā)現(xiàn)是ohguchi等人（2003A，b）的報(bào)告中沒有預(yù)料到的[7，8]。他們的觀點(diǎn)是二苯乙烯雙鍵加氫后，其酪氨酸酶抑制活性明顯降低。

遺憾的是，合成的二氫赤霉素采收率太低，不能用于進(jìn)一步的開發(fā)。因此，我們合成了一些結(jié)構(gòu)與二氫赤霉素非常接近的化合物，并對(duì)其進(jìn)行了蘑菇酪氨酸酶抑制試驗(yàn)。4-芐基-1，3-對(duì)苯二酚的活性與曲酸相近（IC50分別為14.25μM和11.05μM），證實(shí)了二氫二苯乙烯能有效抑制酪氨酸酶活性的結(jié)論。2-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚對(duì)酪氨酸酶的抑制活性較弱（IC50值為258.93μM），這可能與間苯二酚基團(tuán)的空間位阻有關(guān)。出人意料的是，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚（IC50值為0.50μM）的活性甚至強(qiáng)于4-芐基-1，3-對(duì)苯二酚，是所有測(cè)試化合物中抑制效果最好的。對(duì)苯二酚和β-熊果苷在蘑菇酪氨酸酶抑制試驗(yàn)中表現(xiàn)出很弱的活性。這與之前發(fā)表的論文[9.10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

此外，4-（1-苯乙基）-1，3-對(duì)苯二酚也具有較強(qiáng)的抗光降解性。在非常嚴(yán)格的條件下（1%的甘油溶液涂在載玻片上，以40W/m2輻照4h，見表1），降解率僅為5%。將含5%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的乙醇溶液置于玻璃容器中，用300W紫外燈照射24h（對(duì)應(yīng)的輻射強(qiáng)度約為18W/m2）。經(jīng)HPLC和GCMS分析（未顯示），確認(rèn)未發(fā)生降解。此外，如圖2，4-（1-苯乙基）-1，3-對(duì)苯二酚在最大40°C和pH5.0—9.0條件下可以穩(wěn)定6個(gè)月。

然而，即使是酚類化合物的輕微降解也可能導(dǎo)致成品化妝品配方中的變色。因此，我們比較了在不添加任何穩(wěn)定劑、pH5.4的情況下，添加0.5%二苯甲酮-3和同時(shí)添加0.5%二苯甲酮-3和0.1%EDTABD的油/水標(biāo)準(zhǔn)配方的穩(wěn)定性。如圖3所示，在不添加任何穩(wěn)定劑的公式1中，出現(xiàn)淺米色變色（△b*值：7.9）。二苯甲酮-3（配方2）明顯減輕了變色情況（△b*值：1.8）。繼續(xù)加入EDTABD（配方3）后，進(jìn)一步得到了最佳的結(jié)果，在這種條件下△b*值僅為0.9。相對(duì)于白色安慰劑的這一細(xì)微的顏色差別，不再是肉眼可察覺的。

基于其優(yōu)異的酪氨酸酶抑制活性和穩(wěn)定性，利用體外法和體內(nèi)法對(duì)（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的功效做進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

4.2細(xì)胞美白功效

接下來，我們研究了4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚降低B16v黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量的能力。用4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚培養(yǎng)96h后，細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有黑色素。在所有研究的化合物中，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚對(duì)黑色素合成的抑制作用最強(qiáng)，IC50值分別為67μM和440μM（見表3）。4-芐基-1，3-對(duì)苯二酚也表現(xiàn)出良好的細(xì)胞美白活性（IC50值=5.08μM）。赤霉素的活性僅與β-熊果苷相當(dāng)，而二氫紅素不活躍。我們還測(cè)試了市場(chǎng)上的一系列其他產(chǎn)品，如鎂、維生素C、磷酸、肌酐、二酸和甘草（數(shù)據(jù)未列）。然而，在我們的細(xì)胞測(cè)試中，這些產(chǎn)品都沒有顯示出美白活性。

4.3對(duì)染色3D表皮模型的美白功效

B16v黑色素瘤細(xì)胞是一種小鼠細(xì)胞。因此，在研究活性物質(zhì)對(duì)人體皮膚黑素生成的影響時(shí)，只是一個(gè)人工模型。此外，角化細(xì)胞分泌促黑素生成的ACTH肽α-MSH、內(nèi)皮素-1等因子作為增效因子并通過吸收黑素細(xì)胞分泌的黑素小體在黑素生成中發(fā)揮重要作用。然后，我們研究了4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚相對(duì)于彎曲酸在染色的3D表皮模型（Melaniodermtm，皮膚IV型）上的美白效果。每天將含0.1%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的磷酸鹽緩沖溶液局部應(yīng)用于3D表皮模型。7d后有明顯的美白效果（未量化）。19d后，觀察到黑色素的生物合成幾乎完全被抑制（黑色素減少了95%）。相反，需要含有1.0%曲酸的磷酸鹽緩沖溶液來達(dá)到類似的效果（黑色素減少80%）。最初的深棕色模型幾乎完全脫色（見圖4）。僅含0.01%4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的磷酸鹽緩沖溶液在培養(yǎng)19天后仍然可以使黑素皮層表皮組織的黑色素含量降低40%，這種效果肉眼可以清楚地觀察到（變?yōu)闇\棕色）。相比之下，0.1%的曲酸美白效果可以忽略不計(jì)。

這些結(jié)果在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。用0.1%的4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚溶液在染色的3D表皮模型上連續(xù)處理14d后，黑色素減少98%。14d采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，3D模型細(xì)胞活性不受影響。

4.4體內(nèi)法評(píng)價(jià)4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的美白功效

為了證實(shí)4-（1-苯乙基）-1，3-醌在體內(nèi)也有美白作用，我們?cè)谂R床試驗(yàn)范圍內(nèi)考察了4-（1-苯乙基）-1，3-醌對(duì)亞洲受試者的皮膚是否有美白作用。在同一實(shí)驗(yàn)中，我們比較了兩種含4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚的水分散凝膠的效果。一種凝膠含油量為5.3%，另一種含油量為9.8%（見表4）。經(jīng)比色儀測(cè)定，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚相對(duì)0.5%比曲酸和安慰劑的1.0%有明顯的美白效果（見圖5）。從圖中可以看出，4-（1-苯乙基）-1，3-二羥基酚的美白效果明顯（A、B相對(duì)于安慰劑P<0.05），且優(yōu)于曲酸（無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。在含油量較低（5.3%）的配方中添加4-（1-苯乙基）-1，3-對(duì)苯二酚，效果更顯著。

制備方法：將A相和B相分別加熱至約80℃，然后將B相加入A相之中，并混合均勻。在葉片攪拌下加入C相。

在配方B中，F(xiàn)O24409先在中性油中預(yù)溶，再添加至油相B中。

05總結(jié)與展望

5.1關(guān)于SymWhite？？377的開發(fā)

二氫二苯乙烯和二苯甲烷衍生物是高效穩(wěn)定的酪氨酸酶抑制劑。因此，它們是二苯乙烯衍生物美白劑的有價(jià)值的選擇。通過高效液相色譜定量分析推斷，二苯基甲烷衍生物4-（1-苯乙基）-1，3-對(duì)苯二酚在紫外照射下可以穩(wěn)定存在，最高溫度為40℃，pH為5—9。調(diào)節(jié)pH值至6.0以下，加入廣譜UVA/UVB濾光劑二苯甲酮-3和金屬螯合劑EDTABD，可以防止化妝品洗劑對(duì)4-（1-苯乙基）-1，3-醌的少量降解引起的變色。

特別是4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚是迄今為止報(bào)道的最有效的酪氨酸酶抑制劑之一。能有效降低b16v黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量，并能染色3D表皮模型。未受照射的亞洲人皮膚經(jīng)28d后，0.5%的4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚可顯示顯著的美白效果（比色計(jì)讀數(shù)和視覺評(píng)分），其效果優(yōu)于1.0%曲酸。當(dāng)4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚應(yīng)用于低含油量配方時(shí)，效果最顯著。結(jié)果表明，4-（1-苯乙基）-1，3-苯二酚（Symwhite？？377）是一種有效、穩(wěn)定、安全的皮膚增白劑。

5.2創(chuàng)新與美白的SymRadiance？388&399

基于對(duì)膚色改善靶點(diǎn)更全面的調(diào)控，德之馨在專利成分SymWhite？？377的基礎(chǔ)上進(jìn)行了全新的升級(jí)，并開發(fā)出SymRadiance？388、399兩款全新成分?；趧?chuàng)新性的協(xié)同作用，SymRadiance？388、399在抗氧美白的基礎(chǔ)上把功效做的更全面，御氧抗皺，提亮膚色，最終更有效更全面提供肌膚亮白以及環(huán)境暴露導(dǎo)致的膚色暗沉問題。