崔芙蓉　王升厚　李夢雪　柳葉飛　徐方旭

摘 要 以不同地區(qū)表現(xiàn)白毛病特征的蛹蟲草為材料，分離獲得2種病原真菌，對其進行形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定，其中BYJ1鑒定為日耳曼曲霉（Aspergillus germanicus），BYJ2為焦曲霉（Aspergillus ustus）。通過侵染實驗探討不同添加方法下，植物生長調節(jié)劑GN-01對蛹蟲草寄生性病原真菌的抗性誘導作用。結果表明，在培養(yǎng)基中加入或在蛹蟲草生長過程中加入稀釋3 000倍的GN-01可顯著提高蛹蟲草SOD和POD酶活性，降低蛹蟲草白毛病發(fā)病率，說明GN-01可作為防控蛹蟲草寄生性病原真菌的抗性誘導劑。

關鍵詞 蛹蟲草;寄生性病原真菌;植物生長調節(jié)劑;誘導抗病性

中圖分類號：Q93 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.17.022

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是一種藥食同源真菌，含有蟲草素、蟲草酸及蟲草多糖等活性成分[1-2]。在蛹蟲草栽培過程中，白毛病危害較為嚴重，極易造成蛹蟲草子實體倒伏和矮小畸形。植物生長調節(jié)劑是人工合成或天然提取的具有激素生理活性的化合物，目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用，并取得了顯著效果。本實驗對蛹蟲草栽培過程中感染的病原真菌進行分離純化及鑒定，通過侵染實驗探究植物生長調節(jié)劑GN-01對蛹蟲草寄生性病原真菌的誘導抗病作用，旨在為白毛病的控制及預防提供理論依據(jù)[3]。

1? 材料與方法

1.1? 實驗材料

不同區(qū)域發(fā)病的蛹蟲草、蛹蟲草菌株PT07（沈陽師范大學特種菌業(yè)研究所提供）、植物生長調節(jié)劑（GN-01）、真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖水（Potato Dextrose Broth，PDB）培養(yǎng)基[4]。

1.2? 實驗方法

1.2.1? 病原真菌分離純化

刮取發(fā)病蛹蟲草上的病原真菌菌絲，采用劃線法將其接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～7 d;待有菌落形成時，挑取單個菌落，用點接法將其接種至PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。重復上述操作，直到純化出單一菌落，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.2? 病原真菌形態(tài)鑒定

將純化后的病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下培養(yǎng)至生長出完整的菌落，觀察菌落形態(tài)特征。利用光學顯微鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》進行形態(tài)學鑒定。

1.2.3? 病原真菌分子生物學鑒定

將純化后的病原真菌接種于PDA斜面上，樣品送至上海派諾森生物科技有限公司進行真菌基因組DNA提取、真菌基因組PCR擴增、PCR產(chǎn)物的回收及DNA序列的對比分析。將所得序列文件與NCBI數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4? 病原真菌侵染蛹蟲草子實體

GN-01稀釋濃度（均為體積濃度）分別為1∶50（2號）、1∶100（3號）、1∶200（4號）、1∶500（5號）、1∶1 000（6號）、1∶3 000（7號）、1∶3 500（8號）和1∶4 000（9號），對照組（1號）為清水。分別在蛹蟲草栽培培養(yǎng)基中和生長過程中加入不同稀釋濃度的GN-01，并按照蛹蟲草常規(guī)方法進行培養(yǎng)。

將分離所得病原真菌接種于PDB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)7 d，將菌體打碎，用無菌水稀釋100倍備用。選擇生長到第35 d的、2種不同培養(yǎng)方式的蛹蟲草子實體進行病原菌侵染實驗，對照組補等量清水，在20 ℃培養(yǎng)55 d后測定防御酶活性及發(fā)病率。

1.3? 指標檢測

1.3.1? SOD和POD酶活性測定

SOD和POD酶活性測定的藥品配制及實驗步驟參照文獻[6]的方法進行。

1.3.2? 發(fā)病率測定

按照公式（1）計算不同實驗組別蛹蟲草總發(fā)病率。

發(fā)病率=（發(fā)病數(shù)/總數(shù)）×100%? （1）

1.4? 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2? 結果與分析

2.1? 病原真菌形態(tài)鑒定

分離所得病原真菌分別命名為BYJ1和BYJ2。如圖1所示，2種病原真菌在PDA培養(yǎng)基中生長3～7 d 后，菌絲部分為白色，不透明，菌絲致密，邊緣規(guī)則;菌落顏色正反一致，生長速度較慢;菌絲分枝，有隔;有明顯成熟脫落的孢子且孢子較小，孢子直徑為3.8～4.5 μm。BYJ1菌株菌絲寬度為2.0～5.0 μm，BYJ2菌株菌絲寬度為5.0～6.3 μm。

2.2? 病原真菌的分子鑒定

將病原菌BYJ1和BYJ2所得序列進行拼接后與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列數(shù)據(jù)進行比對。由圖2可知，BYJ1為日耳曼曲霉（Aspergillus germanicus），BYJ2為焦曲霉（Aspergillus ustus）。

2.3? GN-01對蛹蟲草抗病能力的影響

2.3.1? GN-01對蛹蟲草防御氧化酶活性的影響

隨著在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加GN-01稀釋倍數(shù)的增大，蛹蟲草子實體的SOD和POD酶活性呈先增強后降低的趨勢，在稀釋倍數(shù)為3 000時（7號樣品）防御氧化酶活性最高，說明蛹蟲草子實體在受到病原真菌侵害時，適當濃度的GN-01可誘導SOD和POD酶活性明顯上升，以抵抗病原真菌侵害（見圖3、圖4）。

2.3.2? GN-01對蛹蟲草發(fā)病率的影響

由表1可知，在培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋50～4 000倍的GN-01，蛹蟲草白毛病發(fā)病率呈逐漸降低趨勢。這說明蛹蟲草受到病原真菌侵害時，在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋50～4 000倍的GN-01可顯著減輕病原真菌的侵害，提高蛹蟲草的抗病性。

2.4? 侵染實驗

根據(jù)前述預實驗結果，選擇稀釋3 000倍的

GN-01進行病原真菌侵染抗性實驗。如圖5所示，與對照組相比，在栽培培養(yǎng)基中添加和在生長過程中補加稀釋3 000倍的GN-01，蛹蟲草子實體的發(fā)病程度均呈著減輕，與前述的預實驗結果相吻合。

3? 討論與結論

植物誘導抗病性被認為是植物保護技術的新途徑。蛹蟲草自身具有一套完整的防御體系，生物或非生物脅迫都可刺激這種防御反應，因此通常將防御酶活性變化作為衡量植株防御能力的重要指標。SOD可清除自由基，延緩植物衰老;POD可減少活性氧積累，保護膜結構完整。本實驗以在蛹蟲草培養(yǎng)基添加GN-01和在生長過程中補加GN-012種實驗所得的蛹蟲草子實體為原材料，對蛹蟲草的防御酶活性進行測定，以探究GN-01對蛹蟲草的誘導抗病性作用。結果表明，當蛹蟲草受到病原真菌侵害時，在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋50～3 000倍的GN-01時，SOD和POD酶活性呈上升趨勢，且在GN-01稀釋倍數(shù)為3 000時，SOD和POD酶活性達到峰值，能有效減輕病原真菌的侵害，提升蛹蟲草的抗病性，侵染實驗結果與酶活性實驗結果吻合。

將植物生長調節(jié)劑作為病原菌抑制劑進行開發(fā)有較好的應用前景，在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋3 000倍的GN-01，都可提高蛹蟲草相關防御酶活性，有效防治蛹蟲草寄生性病原真菌病害的發(fā)生。目前，蛹蟲草寄生性病原真菌研究體系還不完整，大部分的致病機制有待深入研究，未來應著重研究病原菌致病機制和篩選蛹蟲草優(yōu)良抗病菌株。

參考文獻：

[1] Sung G H， Hywel-Jones N L， Sung J M， et al. Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi[J]. Studies in Mycology， 2007， 57（1）： 55-59.

[2] 王尊生，王升厚，袁勤生.冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）菌絲體固體發(fā)酵粉中麥角甾醇的定量分析[J].沈陽師范大學學報（自然科學版），2005（3）：293-296.

[3] 張卉，郝國良，徐俊斌.生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].沈陽師范大學學報（自然科學版），2011，29（2）：293-296.

[4] 趙穎，于飛，郭明敏，等.堿蓬內(nèi)生真菌JP3的分離、鑒定及促生作用研究[J].沈陽師范大學學報（自然科學版），2015，33（1）：116-120.

[5] 馬蓮菊，朱淼，汪雅楠，等.根瘤菌多樣性研究技術進展[J].沈陽師范大學學報（自然科學版），2021，39（6）：538-543.

[6] 高華晨.不同高粱品種抗氧化指標及內(nèi)源激素分析[D].沈陽：沈陽師范大學，2019.

（責任編輯：張春雨? 丁志祥）

收稿日期：2022-07-12

基金項目：遼寧省科技廳重大科技攻關項目“遼寧蟲草產(chǎn)業(yè)群生產(chǎn)性種源繁育體系風險防范技術研究”（2019JH2/10200003）。

作者簡介：崔芙蓉（1997—），女，遼寧撫順人，在讀碩士，研究方向為微生物資源與利用。