黃 振 ， 郭瓊霞

1福州長樂機(jī)場海關(guān)，福建 福州 350209； 2福州海關(guān)技術(shù)中心，福建 福州 350001； 3福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001

瘤脛實(shí)蠅Bactroceratuberculata(Bezzi)是危害果蔬的重要害蟲，被列入我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄，屬雙翅目Diptera實(shí)蠅科Tephritidae果實(shí)蠅屬Bactrocera果實(shí)蠅亞屬Bactrocera(Drew,2007)。目前，主要分布在老撾(鄧裕亮等，2010)、緬甸(肖樞等，2012)、不丹(Leblancetal.,2014)、中國的云南(Liangetal.,1993)等國家和地區(qū)。近年來，中邊貿(mào)易頻繁，進(jìn)境果蔬種類和數(shù)量都在不斷增加，鄰國的老撾、緬甸等多為瘤脛實(shí)蠅疫區(qū)(陳鵬和葉輝,2009)，頻繁的果蔬貿(mào)易給瘤脛實(shí)蠅的傳入帶來了潛在的危險(xiǎn)(蔣小龍，2002)。

從多年口岸果蔬進(jìn)境檢疫的情況看，截獲到的實(shí)蠅類害蟲多以幼蟲、卵或蛹等不同蟲態(tài)出現(xiàn)。對實(shí)蠅的鑒定主要依據(jù)成蟲的形態(tài)學(xué)特征編列出分類檢索表進(jìn)行分類檢索鑒定，有時(shí)還需請專家進(jìn)行鑒定復(fù)核，時(shí)效長；而對于幼蟲的鑒定，需將幼蟲飼養(yǎng)為成蟲后再行鑒定，往往受到飼養(yǎng)時(shí)間和環(huán)境條件的限制，周期長，直接影響了國際果蔬貿(mào)易的快速通關(guān)。所以，傳統(tǒng)的形態(tài)分類鑒定方法已經(jīng)難以適應(yīng)貿(mào)易性的果蔬攜帶的檢疫性實(shí)蠅快速鑒定的要求。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的分子鑒定技術(shù)被運(yùn)用于昆蟲的鑒定中(陳韶萍等，2014； 黃可輝等,2005)，可解決傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法難以解決的幼蟲等不同蟲態(tài)的鑒定問題。為解決實(shí)蠅的幼蟲、卵、蛹等未成熟蟲態(tài)鑒定困難和周期長等問題，張亮和張智英(2007)采用RAPD技術(shù)構(gòu)建了橘小實(shí)蠅B.dorsalisHendel、具條實(shí)蠅B.scutellata(Hende1)、黑漆實(shí)蠅B.scutellaris(Bezzi)、南瓜實(shí)蠅B.tau(Walker)、瓜實(shí)蠅B.cucurbitae(Coquillett)和番石榴實(shí)蠅B.correcta(Bezzi)等6種實(shí)蠅指紋圖譜的快速鑒定方法；Chuaetal.(2010)采用PCR-RFLP技術(shù)，實(shí)現(xiàn)橘小實(shí)蠅復(fù)合種木瓜實(shí)蠅B.papayae和洋桃實(shí)蠅的鑒定。但RAPD技術(shù)對實(shí)驗(yàn)環(huán)境因子變化要求較為敏感，擴(kuò)增產(chǎn)物的重復(fù)性和穩(wěn)定性等較低；RFLP技術(shù)需通過檢測內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的變異來確定昆蟲種間親緣關(guān)系和昆蟲種屬特異性，操作繁瑣、多態(tài)性低，檢出率不理想，所以，RAPD和RFLP技術(shù)的應(yīng)用受到一定的限制。線粒體基因組由于具有基因組成穩(wěn)定、基因排列相對保守、普遍為母系遺傳、極少發(fā)生重組等特征，被廣泛應(yīng)用于分子進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育、物種鑒定、種群遺傳結(jié)構(gòu)及生物動(dòng)力學(xué)等研究(Prabhakaretal.,2012)。不同類群的線粒體基因組表現(xiàn)出獨(dú)特的特征與進(jìn)化方式。在實(shí)蠅科昆蟲研究中，基因序列的研究為實(shí)蠅類害蟲的鑒定提供了大量分子生物學(xué)技術(shù)信息數(shù)據(jù)(Beardetal.,1993； Nardietal.,2010)。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(mtDNA COⅠ)基因的結(jié)構(gòu)相對保守，排列的順序比較穩(wěn)定緊密，種間變異較大，容易被通用引物擴(kuò)增，又有足夠的特異性能將不同物種區(qū)分開，利用mtDNA COⅠ基因可以進(jìn)行DNA條形碼識別、近緣種間的比較鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究，已成為許多系統(tǒng)學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)，mtDNA COⅠ是被應(yīng)用于昆蟲分子進(jìn)化系統(tǒng)研究較多的標(biāo)記基因之一(黃振等，2015)，也越來越多地被用到實(shí)蠅近緣種的系統(tǒng)發(fā)育研究中(范京安等，2009)。mtDNA COⅠ被作為一種快速進(jìn)化的分子標(biāo)記，已成為研究近緣種生物進(jìn)化的重要材料(Jamnongluketal.,2003a,2003b)。

本研究采用種特異性引物SS-COⅠ( species-specific COⅠ)技術(shù)，基于mtDNA COⅠ基因序列，篩選設(shè)計(jì)目標(biāo)物種特異性引物(張桂芬等，2012)，快速鑒定瘤脛實(shí)蠅，克服了對截獲的疑似瘤脛實(shí)蠅的卵、蛹、幼蟲、成蟲及殘?bào)w等不同蟲態(tài)的鑒定困難，建立了一種利用分子手段快速鑒定瘤脛實(shí)蠅的可行性方法，為口岸快速通關(guān)和有效防治瘤脛實(shí)蠅提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試實(shí)蠅

本試驗(yàn)供試的蟲樣有果實(shí)蠅屬果實(shí)蠅亞屬9種：腿端黑實(shí)蠅B.atrifemurDrew & Hancock、楊桃果實(shí)蠅B.carambolaeDrew & Hancock、番石榴果實(shí)蠅、橘小實(shí)蠅、辣椒果實(shí)蠅B.latifronsHendel、銹紅果實(shí)蠅B.rubiginaWang & Zhao、瑞麗果實(shí)蠅B.ruiliensis(Wang, Long et Zhang), sp.nov.、瘤脛實(shí)蠅和五指山實(shí)蠅B.wuzhishanaLin & Yang；鏃果實(shí)蠅亞屬Zeugodacus7種：近黑顏實(shí)蠅B.parater(Zhao & Lin)、二顏帶實(shí)蠅B.ciliferaHendel、瓜實(shí)蠅B.cucurbitaeCoquillett、黑顏實(shí)蠅B.diaphoraHendel、黑膝實(shí)蠅B.scutellarBezzi、具條實(shí)蠅和南亞果實(shí)蠅B.tauWaiker;滇寡鬃實(shí)蠅B.modica、何氏華實(shí)蠅B.hochiiZin，以及Carpomya屬棗實(shí)蠅C.vesuvianaCosta和Dacus屬瓜棍腹實(shí)蠅D.longicornisWiedemann，共3屬4個(gè)亞屬20種實(shí)蠅。其中，腿端黑實(shí)蠅為2010年在福州機(jī)場進(jìn)境旅客的攜帶水果中檢疫截獲，飼養(yǎng)為成蟲后鑒定，為中國大陸首次截獲(黃振等，2011)。另除楊桃果實(shí)蠅、番石榴果實(shí)蠅、橘小實(shí)蠅、辣椒果實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、具條實(shí)蠅、南亞果實(shí)蠅為口岸進(jìn)境果蔬中截獲，從卵、幼蟲等飼養(yǎng)為成蟲鑒定外，其余為誘捕劑誘到的實(shí)蠅，均為成蟲，寄主無法確定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取和質(zhì)量檢測 取已復(fù)核鑒定的瘤脛實(shí)蠅蟲樣的部分組織，采用OMEGA E.Z.N.A.TMInsect DNA Kit試劑盒提取各蟲樣基因組DNA。提取步驟按照試劑盒操作說明進(jìn)行。提取的DNA通用引物：上游引物L(fēng)CO1490堿基序列為5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′，下游引物HCO2198堿基序列為5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。對提取的實(shí)蠅蟲樣基因組DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，在定量梯度PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：2×EasyTaq PCR SuperMix (天根生化科技有限公司)12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板各2 μL，加ddH2O至總體積25 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 40 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)后延伸10 min。分別提取5 μL PCR產(chǎn)物在含DNA染色劑的1.5%的瓊脂糖凝膠多功能電泳儀上電泳30 min (120 V)，通過凝膠成像分析儀檢測擴(kuò)增，拍攝觀察擴(kuò)增條帶的位置。

1.2.2 種特異性SS-COⅠ引物的設(shè)計(jì) 選用通用引物L(fēng)CO1490和HCO2198對靶標(biāo)實(shí)蠅提取的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增并測序，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，測序的序列為5′-CTGAGCTGGTATAGTAGGAACATCTCTTAGAATTTTAGTGCGAG

CAGAACTAGGACACCCGGGAGCCCTAATTGGCGA

TGATCAAATCTATAACGTAATTGTAACAGCCCATG

CATTTGTAATAATTTTTTTCATAGTTATACCTATTAT

AATTGGAGGATTCGGTAATTGATTAGTGCCTTTAAT

GCTAGGAGCCCCAGATATAGCATTCCCCCGAATAA

ATAATATAAGCTTTTGATTACTACCGCCCTCTCTCA

CATTACTTTTAACAAGCAGTATAGTAGAAAATGGA

GCTGGAACAGGCTGAACCGTTTATCCCCCCCTTTCT

TCTGCTATCGCCCACGGAGGAGCTTCTGTAGACTT

AGCTATCTTCTCATTACATTTAGCCGGAATCTCATC

CATTTTAGGAGCCGTAAATTTCATTACCACAGTTA

TTAATATACGATCAACCGGAATTACATTCGACCGT

ATACCTTTATTTGTTTGAGCAGTTGTATTAACAGCC

CTTCTTCTTCTACTTTCCTTACCAGTATTAGCTGGA

GCTATTACAATATTATTAACTGACCGAAATTTAAAT

ACTTCATTCTTCGACCCAGCAGGTGGAGGAGACCC

T-3′。將所測序列通過數(shù)據(jù)庫(NCBI)比對查找瘤脛實(shí)蠅已公布的登錄序列，并進(jìn)行綜合比較分析，最后選定登錄號為KF659812，下載其登錄號的FASTA格式，利用Primer-Premier 5.0進(jìn)行人工篩選設(shè)計(jì)引物，再利用Oligo 6.44對引物進(jìn)行評定和評價(jià)，最后利用NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的Primer-BLAST程序檢查同源序列，篩選設(shè)計(jì)種特異性引物。最終選擇的鑒定瘤脛實(shí)蠅的種特異性引物為LJF400和LJR564。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。特異性引物L(fēng)JF400的序列為5′-ACTCTGTTTAGCCGGGATCT-3′；LJR564的序列為5′-CCGGCTAAAACTGATGGAGA-3′。

1.2.3 引物SS-COⅠ的種特異性的測試 選用瘤脛實(shí)蠅為陽性對照，其余的19種實(shí)蠅為陰性對照，設(shè)置反應(yīng)的體系和條件，在定量梯度PCR儀上測試本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)引物的種特異性。利用凝膠成像分析儀檢測擴(kuò)增出的目標(biāo)片段。

1.2.4 引物SS-COⅠ的靈敏度測試 利用核酸蛋白分析儀對提取的瘤脛實(shí)蠅DNA模板的濃度進(jìn)行測試，并將其DNA模板濃度按10-1、10-2、10-3倍3種梯度稀釋，使用種特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測試引物的靈敏度。

1.2.5 引物SS-COⅠ的種特異性的驗(yàn)證 利用由云南口岸局提供的在我國云南邊境監(jiān)測到的瘤脛實(shí)蠅蟲樣，包括解剖到的果蔬中的幼蟲(飼養(yǎng)到成蟲并經(jīng)過形態(tài)鑒定)等不同蟲態(tài)蟲樣12份提取的DNA為模板，使用種特異性引物L(fēng)JF400和LJR564進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物SS-COⅠ的種特異性測試

提取各蟲樣基因組DNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測，可見所有實(shí)蠅DNA均能擴(kuò)增出約700 bp單一且清晰的目標(biāo)條帶(張桂芬等，2013)，結(jié)果見圖1。

測試篩選設(shè)計(jì)引物的種特異性，結(jié)果表明：僅瘤脛實(shí)蠅在長度約165 bp位置擴(kuò)增出一條清晰且單一的目標(biāo)條帶，其他19種實(shí)蠅種類均未出現(xiàn)任何條帶(圖2)。本試驗(yàn)對從西雙版納、?？?、勐臘口岸3個(gè)口岸誘捕的瘤脛實(shí)蠅樣本和陰性對照的19份實(shí)蠅樣本的DNA模板重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果均一致，表明本試驗(yàn)篩選設(shè)計(jì)的種特異性引物L(fēng)JF400和LJR564具有較強(qiáng)的特異性和穩(wěn)定性。

得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序，將測序所得到的序列提交數(shù)據(jù)庫(NCBI)經(jīng)BLAST檢查同源序列，結(jié)果表明：該段序列與數(shù)據(jù)庫中的瘤脛實(shí)蠅序列具100%的一致性。

圖1 采用通用型引物L(fēng)CO1490和HCO2198對20種實(shí)蠅提取的DNA模板的質(zhì)量檢測結(jié)果Fig.1 Common primers LCO1490 and HCO2198 used to detect the quality of DNA templates extracted from 20 kinds of flies M：100 bp DNA ladder:1:瘤脛實(shí)蠅；2:洋桃果實(shí)蠅；3:番石榴果實(shí)蠅；4:橘小實(shí)蠅；5:辣椒果實(shí)蠅；6:銹紅果實(shí)蠅；7:瑞麗果實(shí)蠅； 8: 腿端黑實(shí)蠅；9:五指山實(shí)蠅；10:二顏帶實(shí)蠅；11:瓜實(shí)蠅；12:黑顏實(shí)蠅；13:近黑顏實(shí)蠅；14:黑膝實(shí)蠅；15:具條實(shí)蠅； 16:南亞寡鬃實(shí)蠅；17:滇寡鬃實(shí)蠅；18:何氏華實(shí)蠅；19:瓜棍腹實(shí)蠅；20:棗實(shí)蠅；21：空白對照。 M： 100bp DNA ladder:1: B. tuberculata； 2: B. carambolae； 3: B. correcta； 4: B. dorsalis； 5: B. latifrons； 6: B. rubigina； 7: B. ruiliensis； 8: B. atrifemur； 9: B. wuzhishana； 10: B. cilifera； 11: B. cucurbitae； 12: B. diaphora； 13: B. parater； 14: B. scutellaris； 15: B. scutellata； 16: B. tau； 17: B. modica； 18: B. hochii； 19: D. longicornis； 20: C. vesuviana； 21： ddH2O.

圖2 瘤脛實(shí)蠅引物L(fēng)JF400和LJR564的種特異性測試Fig.2 Test of species-specificity of primers LJF400 and LJR564 for B. tuberculata M：100 bp DNA ladder:1:瘤脛實(shí)蠅；2:洋桃果實(shí)蠅； 3:番石榴果實(shí)蠅；4:橘小實(shí)蠅；5:辣椒果實(shí)蠅；6:銹紅果實(shí)蠅；7:瑞麗果實(shí)蠅； 8:腿端黑實(shí)蠅；9:五指山實(shí)蠅；10:二顏帶實(shí)蠅；11:瓜實(shí)蠅；12:黑顏實(shí)蠅；13:近黑顏實(shí)蠅；14:黑膝實(shí)蠅；15:具條實(shí)蠅； 16:南亞寡鬃實(shí)蠅；17:滇寡鬃實(shí)蠅；18:何氏華實(shí)蠅；19:瓜棍腹實(shí)蠅；20:棗實(shí)蠅；21：空白對照。 M：100 bp DNA ladder:1: B. tuberculata； 2: B. carambolae； 3: B. correcta； 4: B. dorsalis； 5: B. latifrons； 6: B. rubigina； 7: B. ruiliensis； 8: B. atrifemur； 9: B. wuzhishana； 10: B. cilifera； 11: B. cucurbitae； 12: B. diaphora； 13: B. parater； 14: B. scutellaris； 15: B. scutellata； 16: B. tau； 17: B. modica； 18: B. hochii； 19: D. longicornis； 20: C. vesuviana； 21： ddH2O.

2.2 引物SS-COⅠ的靈敏度測試

利用核酸蛋白分析儀提取的瘤脛實(shí)蠅DNA模板的濃度,測試結(jié)果為55.97 ng·μL-1。將其稀釋至3種不同梯度濃度后，進(jìn)行DNA模版最低閾值的測定，結(jié)果在原濃度稀釋10-1倍后，仍可見有明顯條帶(圖3)，說明該引物具有較高的靈敏度。

2.3 引物SS-COⅠ的種特異性的驗(yàn)證

取瘤脛實(shí)蠅蟲樣：西雙版納瘤脛實(shí)蠅8份、?？诹雒剬?shí)蠅2份、勐臘瘤脛實(shí)蠅2份，共12份實(shí)蠅提取的DNA模板進(jìn)行種特異性測試驗(yàn)證，均顯示出目標(biāo)條帶。結(jié)果表明：本試驗(yàn)SS-COⅠ種特異性引物可以快速鑒定靶標(biāo)實(shí)蠅瘤脛實(shí)蠅，鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致(圖4)，驗(yàn)證結(jié)果也表明SS-COⅠ引物具有較強(qiáng)的特異性和穩(wěn)定性，可以應(yīng)用于瘤脛實(shí)蠅的鑒定。

圖3 瘤脛實(shí)蠅引物L(fēng)JF400和LJR564的 靈敏度測試Fig.3 The sensitivity test of the primers LJF400 and LJR564 of B. tuberculata M：100 bp DNA ladder;1：100;2：10-1倍;3：10-2倍; 4：10-3倍;5：空白對照。 M： 100 bp DNA ladder； 1： 100； 2： 10-1 times； 3： 10-2 times； 4： 10-3 times； 5： ddH2O.

圖4 瘤脛實(shí)蠅的種特異性引物(SS-COⅠ) 驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Verification results of SS-COⅠ for B. tuberculata M：100 bp DNA ladder；1～8：西雙版納瘤脛實(shí)蠅；9～10： ?？诹雒剬?shí)蠅；11～12：勐臘瘤脛實(shí)蠅；13：空白對照。 M：100 bp DNA ladder； 1-8: B. tuberculata of Xishuangbanna； 9-10： B. tuberculata of Haikou； 11-12： B. tuberculata of Mengla； 13： ddH2O.

3 討論

3.1 引物的特異性是鑒定靶標(biāo)實(shí)蠅的關(guān)鍵

本試驗(yàn)選用線粒體基因mtDNA COⅠ作為標(biāo)記基因，研究篩選設(shè)計(jì)了特異性引物L(fēng)JF400和LJR564，測試監(jiān)測到的瑞麗果實(shí)蠅、滇寡鬃實(shí)蠅和口岸進(jìn)境果蔬中檢疫截獲的20種的實(shí)蠅蟲樣，并對西雙版納、海南海口和勐臘口岸誘捕監(jiān)測的瘤脛實(shí)蠅的成蟲和成蟲的腿節(jié)、翅膀等殘?bào)w共12份提取到的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測試驗(yàn)證，僅瘤脛實(shí)蠅能穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出一條長度約165 bp的單一且清晰的特異性目標(biāo)條帶，其他19種實(shí)蠅均無任何條帶發(fā)現(xiàn)，驗(yàn)證了本試驗(yàn)篩選設(shè)計(jì)引物的種特異性，表明引物的特異性是鑒定靶標(biāo)實(shí)蠅的關(guān)鍵。

3.2 應(yīng)用種特異性SS-COⅠ引物建立快速鑒定方法的可行性

近年來，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速，也逐步被應(yīng)用于實(shí)蠅類害蟲不同蟲態(tài)的鑒定。本研究基于mtDNA COⅠ基因技術(shù)，設(shè)計(jì)靶標(biāo)瘤脛實(shí)蠅種特異性SS-COⅠ引物，對18個(gè)同屬近緣種和其他屬2種共20種實(shí)蠅樣本進(jìn)行鑒定，時(shí)間只需8 h，解決了口岸在進(jìn)境果蔬中截獲的幼蟲蟲態(tài)實(shí)蠅，需要飼養(yǎng)至成蟲后進(jìn)行形態(tài)鑒定的周期長和飼養(yǎng)環(huán)境條件局限等存在的問題。研究表明：檢測到的DNA模板濃度可低至5.597 ng·μL-1，用量低，且具有較高的靈敏度?？梢?，建立的SS-COⅠ種特異性引物的檢測方法，只要能提取到DNA，就能實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)種的鑒定，用時(shí)短，快速準(zhǔn)確，并具有可行性。

實(shí)蠅科昆蟲具有重要經(jīng)濟(jì)意義，種類多，目前已完成線粒體基因組測序的實(shí)蠅科種類只有3屬l4個(gè)物種(姜帆等，2016)，更多實(shí)蠅科昆蟲種類的線粒體基因組序列的分析研究有待進(jìn)一步深入。應(yīng)用特異性引物SS-COⅠ檢測技術(shù)快速鑒定，不僅適用于不同蟲態(tài)實(shí)蠅的鑒定，也能利用實(shí)蠅成蟲的殘?bào)w部分，如腿節(jié)殘肢、翅膀等，提取到微量的DNA，即可快速鑒定，該方法為其他實(shí)蠅的種特異性引物檢測技術(shù)的研究提供了參考，對開展和促進(jìn)進(jìn)境果蔬的實(shí)蠅檢疫鑒定有著積極的作用和現(xiàn)實(shí)意義。