李秀平，歐陽建，唐靜怡，周 方，黃建安,3，劉仲華,3,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128；3.植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

越來越多的食物選擇和熱量攝入使得近30 年間全球超重或肥胖人口增加了近21億[1]，肥胖與一些常見慢性疾病有著重要聯(lián)系，預(yù)防肥胖也成為了全球主要的公共衛(wèi)生問題之一。茯磚茶是中國地區(qū)特有的一類黑茶，眾多研究報道了茯磚茶在降脂減肥、降糖降壓、抑制炎癥、防治炎癥性腸炎、保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)腸道菌群等方面的保健功效[2-5]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，抗生素、高飽和脂肪飲食等會改變腸道微生物結(jié)構(gòu)及增加腸胃炎癥性反應(yīng)，進(jìn)而對代謝及免疫系統(tǒng)造成不利影響[6]。肝臟作為身體重要的代謝器官，在門靜脈和膽管系統(tǒng)的連接下直接與腸道相連，腸-肝循環(huán)中膽汁酸（bile acid，BA）循環(huán)受體的信號改變能調(diào)節(jié)機(jī)體對食物營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，腸道菌群-腸-肝循環(huán)直接影響機(jī)體對脂質(zhì)吸收與代謝[6-8]。有研究表明普洱茶茶褐素通過改變腸道微生物結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)腸-肝類法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）及BA合成作用來維持膽固醇穩(wěn)態(tài)，改善肥胖[9]。因而腸道菌群-腸肝軸的功能及BA循環(huán)機(jī)制與機(jī)體營養(yǎng)吸收及肥胖有著重要聯(lián)系。本實驗研究茯磚茶水提物（Fuzhuan brick tea water extract，F(xiàn)TE）對高脂飲食（high-fat diet，HFD）組大鼠體質(zhì)量與血清脂質(zhì)譜、脂質(zhì)積累、肝臟與腸道功能及結(jié)構(gòu)、腸道微生物群結(jié)構(gòu)及BA代謝的影響，探究FTE預(yù)防肥胖和高膽固醇血癥作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級SD大鼠購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司（生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004）。

茯磚茶由湖南省益陽茶廠有限公司提供。

甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、瘦素（leptin，LEP）、脂聯(lián)素（adiponectin，ADPN）、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（carnitine palmityl transferase-1，CPT-1）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）美國Bioss公司；膽固醇27-羥化酶（cholesterol-27-hydroxylase，CYP27A1） 英國ABCam公司；血脂康膠囊 北京北大維信生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

移液槍 德國Eppendorf公司；壓力蒸汽滅菌鍋上海中安醫(yī)療器械廠；AEU-210電子天平 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；超純水機(jī)長沙源科儀有限公司；UV-2550紫外分光光度計、LC10AT-VP Plus高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；Allegra X-22R臺式離心機(jī) 美國貝克曼公司；快速混勻器 常州智博瑞儀器制造有限公司；微孔板恒溫振蕩器杭州米歐儀器有限公司；全自動快速研磨儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；酶標(biāo)儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 茯磚茶成分測定

水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)按GB/T 8305ü2013《茶?水浸出物測定》測定；多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)按GB/T 8313ü2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》；可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)按蒽酮-硫酸比色法測定[10]；游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)按GB/T 8314ü2013《茶?游離氨基酸總量的測定》測定；黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)按三氯化鋁比色法測定[11]。

1.3.2 茯磚茶水提物凍干粉的制備

將茯磚茶與超純水按1∶10（m/V）混合，微沸浸提30 min，抽吸過濾，將濾液冷凍干燥，獲得FTE凍干粉，密封包裝，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 動物實驗及分組

所有大鼠在溫度20～25 ℃、相對濕度（50f5）%環(huán)境下（12 h光/12 h暗循環(huán)）適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。在干預(yù)實驗期間，將所有大鼠分為6 組，每組8只，所有組自由飲水和進(jìn)食，對照組（ND組）飼喂低脂飼料（脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%），其余組飼喂高脂飼料（脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%）。ND組與HFD組灌胃2 mL無菌水，陽性對照組（XZK組）灌胃2 mL血脂康（150 mg/kgmb），茯磚茶干預(yù)組（FTE組）均灌胃2 mL FTE。每次根據(jù)所稱每只大鼠體質(zhì)量調(diào)節(jié)配制灌胃液所需樣品粉劑質(zhì)量，將樣品粉劑溶于2 mL無菌水充分溶解待灌。茯磚茶干預(yù)組所有劑量通過換算并參考已有研究[5,12]確定為低劑量（FTL）組75 mg/kgmb、中劑量（FTM）組150 mg/kgmb和高劑量（FTH）組300 mg/kgmb，時長8周。

每天換水與飼料，每周稱量體質(zhì)量2 次，記錄飲食量；并在無菌環(huán)境下收集糞便，迅速轉(zhuǎn)至－80 ℃保存；灌胃實驗結(jié)束后禁食不禁水12 h，麻醉，腹腔主動脈取血，脫頸后解剖，將肝臟、腎周脂肪、附睪脂肪稱質(zhì)量，分離出肝臟、結(jié)腸，用組織固定液固定，附睪脂肪用脂肪固定液固定，剩余結(jié)腸與肝臟放入液氮中，轉(zhuǎn)入－80 ℃保存。

1.3.4 指標(biāo)測定

1.3.4.1 大鼠基礎(chǔ)指標(biāo)測定

最后一次灌胃前測定大鼠體質(zhì)量與體長；灌胃期間每周三與周五稱體質(zhì)量和期間飼料食用量，通過2 d內(nèi)飼料消耗量和體質(zhì)量增長量來計算食物利用率（式（1））。解剖時，取大鼠腎周脂肪和附睪脂肪分別稱質(zhì)量。Lee’s指數(shù)、內(nèi)臟脂肪系數(shù)、肝-體指數(shù)分別按公式（2）～（4）計算。

1.3.4.2 生化指標(biāo)測定

將EP管中血漿靜置2 h后，在3 500 r/min、4 ℃條件下離心10 min取上清液待測；剪切凍存的肝臟，與生理鹽水按質(zhì)量比1∶9制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的肝臟勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液待測。嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST、ALT、TBA、CAT、SOD、MDA、TNF-α、IL-6、LEP、ADPN、CPT-1水平以及肝臟TG、TC水平（結(jié)果以蛋白質(zhì)量計）。血漿致動脈粥樣硬化指數(shù)（atherogenic index of plasma，AIP）按式（5）計算。

式中：cTG、cHDL-C分別表示血清中TG、HDL-C的濃度/（mmol/L）。

1.3.4.3 肝臟、結(jié)腸與附睪組織病理學(xué)觀察

取每只大鼠相同肝臟、結(jié)腸、附睪組織部位，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，顯微鏡拍照觀察，每組隨機(jī)選取6 個附睪組織，于200 倍視野下拍照并計算單位面積內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)目。另對肝臟進(jìn)行油紅染色，每組隨機(jī)選取6 個油紅染色肝臟組織，于200 倍視野下拍照，計算脂滴面積，取平均值；對結(jié)腸進(jìn)行過碘酸席夫（periodic acid Schiff，PAS）染色，顯微鏡拍照觀察。

1.3.4.4 肝臟蛋白免疫熒光染色

將肝臟石蠟切片脫蠟至水，進(jìn)行抗原修復(fù)，畫圈血清封閉，加一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后加二抗避光室溫孵育50 min，進(jìn)行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚復(fù)染細(xì)胞核，猝滅組織自發(fā)熒光，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。對每組隨機(jī)選取10 個400 倍視野拍照，計算平均積分光密度（mean of integrated optical density，MOD）與陽性表達(dá)面積平均積分光密度（stained area average optical density，AOD）。

1.3.4.5 腸道微生物16S rDNA基因靶向測序分析

16S rDNA基因靶向測序由天根生化科技（北京）有限公司完成。采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的糞便樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。稀釋后的基因組DNA為模板；根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物。使用高效和高保真的酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性；16S rDNA V3～V4擴(kuò)增引物為正向引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和反向引物805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測，合格后使用Illumina平臺進(jìn)行測序，序列分析通過QIIME軟件包進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

切片以及免疫熒光圖像應(yīng)用CaseViewer軟件分析；肝臟切片脂滴面積、附睪脂肪細(xì)胞數(shù)目、MOD與AOD應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件計算；通過SPSS 25軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組比較應(yīng)用方差分析（analysis of variance，ANOVA）中的最小顯著差異（least significant difference，LSD）檢驗進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯磚茶主要成分

表1為本實驗所測定的茯磚茶主要成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，與沈程文等的結(jié)果[13]基本一致，符合茯磚茶品質(zhì)化學(xué)特征。

表1 茯磚茶主要成分Table 1 Major constituents of Fuzhuan brick tea

2.2 茯磚茶對大鼠生長體質(zhì)量和食物利用率的影響

由表2可知，在灌胃FTE的第2周，F(xiàn)TE組體質(zhì)量相對于HFD組增長速度變緩，所有組體質(zhì)量在第3周均與HFD組表現(xiàn)出顯著差異。在FTE干預(yù)第6周時，F(xiàn)TE組和ND組體質(zhì)量均與HFD組出現(xiàn)高度顯著差異（P＜0.001）。第8周結(jié)束時，各組大鼠Lee’s指數(shù)與HFD組具有顯著差異（圖1B），且XZK、FTL、FTM和FTH組體質(zhì)量增加量與HFD組比較分別下降了18.45%、26.95%、30.27%和32.96%（P＜0.05）（圖1A），表明FTE在抑制體質(zhì)量增長方面具有一定劑量依賴性。通過動物體質(zhì)量與食物利用率能夠判斷受試動物的生存狀態(tài)，與HFD組相比，XZK與FTE干預(yù)降低了大鼠食物利用率，但各組均在健康大鼠食物利用率的參考值（15%～55%）[14]范圍內(nèi)（圖1C）。與HFD組相比，血脂康干預(yù)會降低大鼠每日進(jìn)食量，但FTE干預(yù)后大鼠每日進(jìn)食量不受明顯影響（圖1D）。以上結(jié)果顯示，F(xiàn)TE能夠在不干擾大鼠正常飲食的情況下抑制大鼠體質(zhì)量增長。

表2 茯磚茶干預(yù)期間大鼠體質(zhì)量變化Table 2 Changes in body mass during intervention with Fuzhuan brick tea in rats

圖1 FTE對大鼠體質(zhì)量及食物利用率的影響Fig. 1 Effect of FTE on body mass and food utilization in rats

2.3 茯磚茶對大鼠脂肪組織積累的影響

脂肪過度沉積會使機(jī)體處于低度炎癥狀態(tài)，分泌促炎性脂肪因子，并且內(nèi)臟脂肪過多的堆積會對肺動脈、肝腎等器官造成機(jī)械壓力損傷，直接影響器官的正常功能[15]。與HFD組相比，F(xiàn)TE的干預(yù)明顯減少了肝臟脂滴面積、附睪脂肪質(zhì)量以及腎周脂肪質(zhì)量（圖2A～C），增加了附睪脂肪組織單位面積內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)量（圖2D、圖3），表明FTE干預(yù)減少了肝臟脂肪、附睪脂肪以及腎周脂肪的堆積。由圖2E、F可知，與HFD組相比，F(xiàn)TE顯著降低了肝-體指數(shù)與內(nèi)臟脂肪系數(shù)（P＜0.05）。在預(yù)防高脂飲食大鼠脂肪積累方面，不同劑量FTE效果均優(yōu)于陽性對照XZK組，并且具有劑量依賴性。

圖2 FTE對大鼠脂肪組織的影響Fig. 2 Effect of FTE on adipose tissue in rats

圖3 大鼠附睪組織病理學(xué)觀察結(jié)果（×200）Fig. 3 Effect of FTE on the pathology of epididymal adipose tissue in rats (× 200)

2.4 茯磚茶對大鼠血清、肝臟生化指標(biāo)的影響

由圖4A～F可知，與ND組相比，HFD組大鼠的血清TG、TC、LDL-C濃度及肝臟TG、TC含量顯著升高（P＜0.05），血清HDL-C濃度顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)TE干預(yù)能顯著抑制因高脂飲食導(dǎo)致的這些指標(biāo)水平變化，其中FTH組各指標(biāo)基本恢復(fù)到ND組水平。由圖4G、H可知，與ND組相比，HFD組大鼠血清AST、ALT活力顯著升高（P＜0.05）；XZK與FTE干預(yù)均能抑制肝功能酶活力的升高，而且相較于XKZ干預(yù)，F(xiàn)TE干預(yù)對肝臟AST及ALT活力有更好的抑制效果（P＜0.05）。

有研究指出，身體質(zhì)量指數(shù)超過25 kg/m2后，每增加5 kg/m2，心血管疾病死亡率增加41%[16]。肥胖會提高心血管疾病等慢性疾病患病率，也有研究表明AIP與肥胖導(dǎo)致的非酒精性脂肪肝密切相關(guān)[17]。由圖4I可知，HFD組AIP接近高風(fēng)險值（AIP＞0.21），而其他組都小于低風(fēng)險值（AIP＝0.11）。

圖4 FTE對大鼠血清、肝臟生化指標(biāo)的影響Fig. 4 Effect of FTE on serum lipid profile and liver function in rats

2.5 茯磚茶對大鼠氧化應(yīng)激水平及炎癥因子的影響

如圖5A～I(xiàn)所示，與ND組相比，HFD組表現(xiàn)出了較強(qiáng)的氧化應(yīng)激（通過血清MDA、CAT、SOD、ADPN、CPT-1水平反映）和炎癥反應(yīng)（通過血清IL-6、TNF-α、TBA水平反映），F(xiàn)TE干預(yù)不同程度降低了血清MDA、IL-6、LEP、TNF-α、ADPN水平，提高了CAT活力、SOD活力（除FTL組外）和TBA濃度。CPT-1位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)，催化長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體基質(zhì)，其水平是決定脂肪酸β氧化程度的主要因素，其在血清中的質(zhì)量濃度反映了機(jī)體各組織細(xì)胞線粒體氧化供能的能力，與HFD組相比，不同劑量FTE均提高了CPT-1的質(zhì)量濃度。并且，F(xiàn)TM及FTH組均能使以上標(biāo)記物水平達(dá)到或接近ND組水平，特別是與XZK組比較，F(xiàn)TE干預(yù)組具有更好的減輕氧化應(yīng)激和炎癥的作用（P＜0.05）。然而，在FTE不同劑量組之間這些指標(biāo)水平?jīng)]有全部出現(xiàn)顯著差異及劑量依賴性關(guān)系。

圖5 FTE對大鼠血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及炎癥因子水平的影響Fig. 5 Effect of FTE on serum oxidative stress markers and inflammatory factors in rats

2.6 茯磚茶對大鼠肝臟和腸道病理學(xué)的影響

由圖6A、B可知，ND組肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射性排列，幾乎無脂滴分布。而HFD組的肝細(xì)胞周圍形成了大量的脂滴空泡，大量的脂滴擠壓細(xì)胞核，影響了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。不同劑量FTE干預(yù)的大鼠肝細(xì)胞脂滴分布數(shù)量減少，細(xì)胞核形態(tài)正常。XZK、FTL與FTM組有少量細(xì)胞增大，出現(xiàn)少量脂滴空泡，F(xiàn)TH組的細(xì)胞結(jié)構(gòu)幾乎與ND組無異。

良好的腸道微生物環(huán)境與消化作用的前提是保持腸道組織結(jié)構(gòu)和功能的完整性。由圖6C、D可知，F(xiàn)TE的干預(yù)能明顯保護(hù)高脂飲食的大鼠結(jié)腸組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)。ND組結(jié)腸黏膜完整，結(jié)構(gòu)無異常，絨毛正常排列，肌層薄厚適中，杯狀細(xì)胞及分泌的黏蛋白結(jié)構(gòu)均正常分布。而HFD組出現(xiàn)了明顯的炎性細(xì)胞浸潤，絨毛出現(xiàn)缺失，肌層變薄，整個腸道結(jié)構(gòu)受到破壞。XZK組有少量炎性細(xì)胞浸潤，絨毛較為整齊，肌層稍薄，杯狀細(xì)胞及黏蛋白分泌較為豐富，結(jié)構(gòu)尚完整。FTE干預(yù)組的腸道結(jié)構(gòu)都未遭到破壞，無炎性細(xì)胞浸潤，絨毛分布整齊且較長，杯狀細(xì)胞及黏蛋白分泌非常豐富，對腸道結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。因此，認(rèn)為茯磚茶對高脂飲食大鼠的肝臟與腸道的結(jié)構(gòu)完整性及功能具有一定的保護(hù)作用，為正常的機(jī)體代謝與預(yù)防肥胖的發(fā)生提供了基礎(chǔ)保障。

圖6 FTE對大鼠肝臟及結(jié)腸組織病理的影響Fig. 6 Effect of FTE on the pathology of liver and colon tissues in rats

2.7 茯磚茶對肝臟蛋白表達(dá)的影響

為了確定FTE對肝臟BA合成和膽固醇代謝的影響，對BA合成過程中關(guān)鍵限速酶CYP7A1和CYP27A1進(jìn)行了免疫熒光分析，并對每組10 張隨機(jī)截取的圖片進(jìn)行MOD與AOD分析（圖7）。結(jié)果表明，相對于HFD組，中、高劑量FTE都提高了CYP7A1的MOD與AOD，其中FTH高度顯著提升了CYP27A1的MOD和AOD（P＜0.001），而XZK組顯著提升了CYP7A1的MOD，所以FTH和FTM干預(yù)上調(diào)了BA合成中限速酶的表達(dá)。在ND、FTM和FTH組肝臟切片上均勻出現(xiàn)了CYP7A1熒光分布，其他組的CYP7A1熒光則主要分布在切片邊緣位置。ND及FTE干預(yù)組的CYP27A1有序分布在細(xì)胞核膜周圍，F(xiàn)TE使得上述限速酶恢復(fù)至正常狀態(tài)。在40?倍放大條件下觀察，HFD組的蛋白熒光較少分布在切片周圍，F(xiàn)T干預(yù)組則較為均勻分布在切片上。限速酶的分布差異可能是由于肝臟脂質(zhì)積累開始于肝臟內(nèi)部，影響了內(nèi)部細(xì)胞BA合成與膽固醇代謝。

圖7 大鼠肝臟CYP7A1與CYP27A1免疫熒光染色代表性圖像及分析Fig. 7 Representative images and analysis of liver CYP7A1 and CYP27A1 immunofluorescence staining in rats

2.8 茯磚茶對腸道微生物群調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用

腸道微生物群與宿主肥胖和代謝有著密切的聯(lián)系，哺乳動物中的共生微生物群通過相互動態(tài)平衡及與疾病的相互作用對宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能起到重要作用[6,8]。已有探究腸道微生物與脂質(zhì)代謝之間關(guān)系的相關(guān)研究[5,9,18-20]，在此基礎(chǔ)之上，本實驗對大鼠糞便進(jìn)行了微生物16S rDNA基因靶向測序，在門、屬的水平上分析FTE對大鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能的影響。

圖8 各組大鼠糞便微生物群測序深度（A）及α多樣性（B）比較Fig. 8 Comparison of sequencing depth (A) and α diversity (B) of rat fecal microbiota in six groups

16S rDNA基因靶向測序分析結(jié)果表明，各組間測序深度無顯著差異，基本覆蓋了樣品中物種信息（圖8A）。與HFD組相比，F(xiàn)TE干預(yù)對腸道微生物群的Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)以及Shannon指數(shù)有一定的提升作用，但無統(tǒng)計學(xué)差異（圖8B）（P＞0.05），表明FTE干預(yù)對微生物群物種數(shù)目及物種多樣性雖有一定影響，但主要還是在改變菌群結(jié)構(gòu)方面。

圖9 FTE對高脂飲食大鼠腸道微生物群的調(diào)節(jié)作用Fig. 9 Regulatory effects of FTE on gut microbiota of HFD-fed rats

圖10 FTE調(diào)控大鼠腸道微生物群組成對腸-肝BA代謝循環(huán)的影響Fig. 10 FTE affected the intestinal and hepatic BA metabolism cycle by modulating the composition of gut microbiota in rats

基于門水平和屬水平物種豐度進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）（圖9A、圖10A）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）（圖9B、圖10B），結(jié)果表明，各組在圖中呈分散分布，在FTE干預(yù)組中，F(xiàn)TL與FTM組距離最接近，且與ND組距離相比FTH組更近，說明不同飲食結(jié)構(gòu)能明顯改變大鼠腸道微生物群結(jié)構(gòu)，且FTH干預(yù)對高脂飲食大鼠微生物群結(jié)構(gòu)改變效果最明顯。由圖9C可知，高脂飲食會提高Firmicutes、Verrucomicrobia的相對豐度，與文獻(xiàn)[21-22]的結(jié)果相同，并且還會降低Bacteroidetes相對豐度；但XZK和FT干預(yù)會不同程度提高Bacteroidetes相對豐度以及降低Firmicutes相對豐度，進(jìn)而導(dǎo)致了Firmicutes與Bacteroidetes相對豐度比值（F/B）的降低（圖9D）。對不同組間門水平進(jìn)行定量分析后，選擇相對豐度較高分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）進(jìn)一步進(jìn)行定量比較，發(fā)現(xiàn)與HFD組相比，F(xiàn)TH組OTU413275、OTU428632和OTU3265227、OTU33984相對降低，New.ReferenceOTU22、OTU4366843、OTU174337、New.ReferenceOTU47相對豐度增加，F(xiàn)TM組OTU447776和NROTU22相對豐度增加，F(xiàn)TL組OTU4431545和OTU447776相對豐度增加（圖9E）。

為了探究大鼠腸道微生物改變對BA代謝的影響，利用Metastats軟件對微生物群落進(jìn)行分析（圖10C～E）。FTE干預(yù)逆轉(zhuǎn)并明顯增加了部分菌屬的相對豐度，其中Akkermansia、Bacteroides相對豐度顯著增加。膽汁鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）相關(guān)微生物的活性與腸道結(jié)合膽汁酸（conjugated bile acid，CBA）含量呈負(fù)相關(guān)，腸道CBA含量的增加會抑制BA回流，從而增加肝臟BA的合成[9]，說明茯磚茶可以通過影響B(tài)SH相關(guān)微生物的豐度從而干預(yù)BA代謝。與HFD組相比，XZK及FTE組BSH相關(guān)微生物L(fēng)actobacillus絕對豐度出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），同時Lactococcus、Streptococcus、Enterococcus絕對豐度出現(xiàn)不同程度下降，另外，其他屬Ruminococcus、Blautia、Coprococcus等的相對豐度也有不同程度降低。

對相對豐度較高的OTU和BSH相關(guān)微生物與環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析（圖10E），大鼠肝質(zhì)量和血清LDL-C、TG、TC、IL-6、LEP、TNF-α水平主要與Firmicutes相對豐度有顯著的正相關(guān)性，與Bacteroidetes、Verrucomicrobia和部分Firmicutes豐度具有顯著負(fù)相關(guān)性；而血清CPT-I、TBA、CAT和HDL-C水平與上述微生物的相對豐度表現(xiàn)出相反的相關(guān)性。結(jié)合血清指標(biāo)可以得出，F(xiàn)TH明顯增加了OTU4366843、NROTU22和OTU174337的相對豐度，而明顯降低了OTU4397402、OTU3265227、OTU428632和OTU413275的相對豐度，其他被高脂飲食改變的OTU一定程度被FTE逆轉(zhuǎn)（P＞0.05）。因此，認(rèn)為FTE可能直接或間接通過調(diào)控菌群OTU來調(diào)節(jié)大鼠腸-肝BA代謝，并對大鼠機(jī)體抗氧化、脂代謝和BA循環(huán)產(chǎn)生影響。

為了研究組間具有顯著性差異的功能，通過16S rDNA測序獲得的物種構(gòu)成與KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫比對，對所有樣品微生物群綱水平進(jìn)行功能注釋，推測樣本中功能基因的構(gòu)成（圖11）。將FT干預(yù)組與HFD組進(jìn)行了STAMP差異分析，經(jīng)Welch’st-test檢驗發(fā)現(xiàn)，與HFD組比較，F(xiàn)T干預(yù)導(dǎo)致部分功能豐度發(fā)生了改變。對FTH組63 個（21 個增加、42 個降低）、FTM組13 個（8 個增加，5 個降低）以及FTL組3 個（3 個降低）功能發(fā)生顯著改變的功能模塊作圖。FTE處理主要引起了部分代謝途徑的變化，如氨基酸、牛磺酸、鞘脂和脂質(zhì)代謝等，還改變了一些次生代謝產(chǎn)物的生物合成以及一些機(jī)體系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)與復(fù)雜疾病的途徑如離子通道、生物轉(zhuǎn)運(yùn)與合成、糖尿病等。因此，F(xiàn)TE的干預(yù)影響了高脂飲食大鼠的腸道菌群功能。

圖11 FTE對PICRUST預(yù)測的大鼠腸道微生物群落功能的影響Fig. 11 Effect of FTE on microbial community functions in gut of rats predicted by PICRUST

綜上，F(xiàn)TE調(diào)節(jié)腸道微生物群在預(yù)防高脂飲食導(dǎo)致的肥胖中起重要作用，并且與宿主腸道代謝功能有著緊密聯(lián)系，可能影響腸-肝BA循環(huán)。BA、短鏈脂肪酸以及腸道代謝物與微生物相互影響，部分菌群與宿主代謝和肥胖表型之間有著直接或間接的因果關(guān)系。FTE中物質(zhì)成分或經(jīng)微生物代謝可能在宿主消化系統(tǒng)中改變微生物群生活環(huán)境，影響微生物群生物功能，從而調(diào)控菌群OTUs豐度來影響宿主代謝功能，進(jìn)而到達(dá)預(yù)防肥胖的作用。

3 討 論

肥胖被廣泛認(rèn)為是能量攝入和消耗代謝之間不平衡導(dǎo)致的。肥胖機(jī)制較為復(fù)雜，作為一種疾病，常常伴隨認(rèn)知和運(yùn)動能力衰退[23]、腎臟功能異常引起的高血壓[24]、心臟增大與代謝減弱[25]以及哮喘[26]等其他疾病的發(fā)生。肥胖的年輕化所帶來的健康問題給個人及醫(yī)療體系造成了沉重負(fù)擔(dān)。游牧民族飯后飲茶的習(xí)慣幫助解決其高熱量油膩飲食帶來的健康問題，隨著生活水平的提高，肥胖發(fā)生率呈上升狀態(tài)。因此，肥胖的預(yù)防變得越來越關(guān)鍵，主要措施包括飲食和運(yùn)動。

部分實驗結(jié)果表明茯磚茶或所含成分對肥胖及血脂異常具有治療效果[27-29]。本實驗表明大鼠在高脂飲食過程中預(yù)防肥胖及脂質(zhì)異常的作用，F(xiàn)TE顯著抑制了其體質(zhì)量的快速增長（表2、圖1），改善了脂質(zhì)譜（圖4），對ADPN及炎癥因子水平具有降低作用（圖5）。肥胖的發(fā)生會導(dǎo)致LEP水平增加，而LEP水平增加會導(dǎo)致中樞瘦素敏感性降低和瘦素受體抵抗作用增加[30]，F(xiàn)TE顯著緩解了機(jī)體高LEP水平（圖5）。FTE干預(yù)能降低肝功能指標(biāo)水平，保護(hù)肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并提升血清中CPT-1水平，促進(jìn)肝臟及其他部位對脂肪酸的利用，為肝臟綜合代謝功能提高保障，顯示出茯磚茶在預(yù)防肥胖方面具有積極作用（圖5）。持續(xù)高脂肪飲食通過破壞腸黏膜、增加機(jī)體內(nèi)臟脂肪組織含量，尤其是腸系膜脂肪增生，持續(xù)分泌促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤破壞腸道屏障，從而影響腸道功能[31]。茯磚茶被報道對炎癥性腸病具有保護(hù)和治療作用[4,32]，本研究得出相似結(jié)果，F(xiàn)TE預(yù)防了高脂飲食導(dǎo)致的腸道炎癥的發(fā)生，并通過促進(jìn)杯狀細(xì)胞黏蛋白的釋放來保護(hù)腸道屏障與功能（圖6）。

FTE干預(yù)改變了腸道微生物群結(jié)構(gòu)和功能，顯著提升了Akkermansia、Bacteroides和Lachnospiraceae等菌屬的豐度，顯著降低Firmicutes的豐度，并降低了F/B比值（圖8～10）。有研究發(fā)現(xiàn)超重、肥胖與腸道Akkermansia、Bacteroides相對豐度存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[33-34]，一項臨床試驗表明補(bǔ)充Akkermansia、Muciniphila能改善胰島素血癥和血漿TC水平，并有改善體質(zhì)量、肝功能和炎癥作用[35]。選擇性進(jìn)食有益于腸道功能和微生物群落的食品能改善肝臟脂質(zhì)沉積和全身性炎癥，如綠茶提取物和異麥芽寡糖組合降低了F/B比值，恢復(fù)肝臟脂質(zhì)代謝[22]。所以，茯磚茶是預(yù)防肥胖具有前景的輔助功能性食品。

BA代謝循環(huán)是機(jī)體調(diào)節(jié)膽固醇的關(guān)鍵機(jī)制（圖12）。人體主要產(chǎn)生膽酸（cholic acid，CA）和鵝去氧膽酸（chenodeoxy-cholic acid，CDCA），而嚙齒動物體內(nèi)的CDCA會轉(zhuǎn)化為鼠膽酸。通過膽管分泌進(jìn)入腸道的CBA經(jīng)過微生物作用生成非結(jié)合BA（unbound bile acid，UBA），未分解的CBA在回腸遠(yuǎn)端被頂端鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（apicalsodium dependent bile acid transporte，ASBT）重新吸收，通過門靜脈由?；悄懰徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（sodium taurocholate cotransport peptide，NCTP）回收至肝臟[8]。一般性乳酸桿菌和梭狀芽孢桿菌相對豐度的降低，與BSH活性及?；撬?β-鼠膽酸在腸道的積累下降有關(guān)[36]。BA的微生物代謝與微生物結(jié)構(gòu)具有相互作用[8]，微生物代謝可形成疏水性BA池，促進(jìn)BA的清除。FTE下調(diào)了BSH相關(guān)微生物的絕對豐度，對BSH分解CBA形成UBA具有一定抑制作用。而普洱茶中的茶褐素對BSH相關(guān)微生物具有抑制作用，并且在回腸遠(yuǎn)端積累CBA抑制了腸道FXR-成纖維細(xì)胞生長因子15（fibroblast growth factor 15，fgf15）信號傳導(dǎo)，從而減少了肝臟成纖維細(xì)胞生長因子受體4（fibroblast growth factor receptor 4，fgfr4）的表達(dá)，下調(diào)對BA合成過程的抑制作用，同時促進(jìn)了BA的排泄[9]。表明FTE可能同樣能夠通過改變微生物結(jié)構(gòu)增加糞便總BA的排泄，增強(qiáng)BA循環(huán)中的合成過程來維持BA平衡。普洱茶對肝臟BA合成基因、氧化甾醇7α-羥化酶（oxysterol 7α-hydroxylase，CYP7B1）、CYP27A1和CYP7A1均具有上調(diào)作用，對甾醇12α-羥化酶（sterol 12alpha-hydroxylase，CYP8B1）無顯著影響[9]，而腸道微生物群也能調(diào)節(jié)幾種酶的表達(dá)，包括CYP7A1、CYP7B1和CYP27A1[37]。本實驗中，F(xiàn)TE干預(yù)提高了CYP7A1和CYP27A1的表達(dá)量，逆轉(zhuǎn)了高脂飲食造成的限速酶分布差異，BA合成代謝加強(qiáng)，可能使CA與CDCA合成增加，血清TBA濃度提高（圖5、7）。而CDCA對BA合成經(jīng)典途徑中的CYP7A1和CYP8B1有輕微抑制作用，導(dǎo)致CDCA合成的進(jìn)一步增加，促進(jìn)肝臟FXR通路[9]。增加BA合成與清除的正向循環(huán)，加強(qiáng)了機(jī)體BA循環(huán)對膽固醇的清除，緩解了膽固醇的堆積。而肝臟FXR的表達(dá)可增強(qiáng)肝臟脂質(zhì)代謝及其他代謝通路[38-39]，防止肝臟脂肪變性和甘油三酯水平升高[18]。

圖12 FTE預(yù)防肥胖及高膽固醇血癥作用相關(guān)機(jī)制Fig. 12 Related mechanism of FTE in preventing obesity and hypercholesterolemia

4 結(jié) 論

FTE抑制了大鼠高脂飲食狀態(tài)下的體質(zhì)量快速增長，降低了全身性脂質(zhì)積累、內(nèi)臟脂肪系數(shù)以及AIP，對機(jī)體抗氧化反應(yīng)與炎癥作用具有積極作用。組織病理結(jié)果表明FTE能明顯保護(hù)肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及腸道結(jié)構(gòu)。FTE干預(yù)調(diào)節(jié)了高脂飲食導(dǎo)致的微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的改變，對BSH相關(guān)微生物具有一定的抑制作用。另外，F(xiàn)TE改變了高脂飲食引起的肝臟BA生成過程中主要限速酶CYP7A1和CYP27A1的分布變化，且促進(jìn)了其表達(dá)。相對于XZK降脂藥物，同劑量下的FTE在預(yù)防高脂膳食大鼠體質(zhì)量增長、脂質(zhì)積累與消耗以及BA代謝方面更具優(yōu)勢。這些結(jié)果初步表明了FTE在預(yù)防肥胖和高膽固醇血癥方面具有積極作用。但是，茯磚茶中的多種成分具有相似功能活性，樣品中茶色素與多酚類、黃酮類化合物通過以上機(jī)制預(yù)防作用過程中是拮抗還是協(xié)同作用尚不得知。肝臟FXR是代謝機(jī)制的中心，茯磚茶如何深入調(diào)控腸道肝臟FXR及其通路代謝還有待進(jìn)一步研究。