李秀平，歐陽建，唐靜怡，周 方，黃建安,3，劉仲華,3,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南農(nóng)業(yè)大學，湖南 長沙 410128；3.植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

越來越多的食物選擇和熱量攝入使得近30 年間全球超重或肥胖人口增加了近21億[1]，肥胖與一些常見慢性疾病有著重要聯(lián)系，預防肥胖也成為了全球主要的公共衛(wèi)生問題之一。茯磚茶是中國地區(qū)特有的一類黑茶，眾多研究報道了茯磚茶在降脂減肥、降糖降壓、抑制炎癥、防治炎癥性腸炎、保護肝臟、調節(jié)腸道菌群等方面的保健功效[2-5]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，抗生素、高飽和脂肪飲食等會改變腸道微生物結構及增加腸胃炎癥性反應，進而對代謝及免疫系統(tǒng)造成不利影響[6]。肝臟作為身體重要的代謝器官，在門靜脈和膽管系統(tǒng)的連接下直接與腸道相連，腸-肝循環(huán)中膽汁酸（bile acid，BA）循環(huán)受體的信號改變能調節(jié)機體對食物營養(yǎng)物質的吸收，腸道菌群-腸-肝循環(huán)直接影響機體對脂質吸收與代謝[6-8]。有研究表明普洱茶茶褐素通過改變腸道微生物結構、調節(jié)腸-肝類法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）及BA合成作用來維持膽固醇穩(wěn)態(tài)，改善肥胖[9]。因而腸道菌群-腸肝軸的功能及BA循環(huán)機制與機體營養(yǎng)吸收及肥胖有著重要聯(lián)系。本實驗研究茯磚茶水提物（Fuzhuan brick tea water extract，F(xiàn)TE）對高脂飲食（high-fat diet，HFD）組大鼠體質量與血清脂質譜、脂質積累、肝臟與腸道功能及結構、腸道微生物群結構及BA代謝的影響，探究FTE預防肥胖和高膽固醇血癥作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級SD大鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004）。

茯磚茶由湖南省益陽茶廠有限公司提供。

甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、瘦素（leptin，LEP）、脂聯(lián)素（adiponectin，ADPN）、肉毒堿棕櫚酰轉移酶1（carnitine palmityl transferase-1，CPT-1）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）美國Bioss公司；膽固醇27-羥化酶（cholesterol-27-hydroxylase，CYP27A1） 英國ABCam公司；血脂康膠囊 北京北大維信生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

移液槍 德國Eppendorf公司；壓力蒸汽滅菌鍋上海中安醫(yī)療器械廠；AEU-210電子天平 長沙湘儀離心機儀器有限公司；冷凍干燥機 德國Christ公司；超純水機長沙源科儀有限公司；UV-2550紫外分光光度計、LC10AT-VP Plus高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；Allegra X-22R臺式離心機 美國貝克曼公司；快速混勻器 常州智博瑞儀器制造有限公司；微孔板恒溫振蕩器杭州米歐儀器有限公司；全自動快速研磨儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；酶標儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 茯磚茶成分測定

水浸出物質量分數(shù)按GB/T 8305ü2013《茶?水浸出物測定》測定；多酚質量分數(shù)按GB/T 8313ü2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》；可溶性糖質量分數(shù)按蒽酮-硫酸比色法測定[10]；游離氨基酸質量分數(shù)按GB/T 8314ü2013《茶?游離氨基酸總量的測定》測定；黃酮類化合物質量分數(shù)按三氯化鋁比色法測定[11]。

1.3.2 茯磚茶水提物凍干粉的制備

將茯磚茶與超純水按1∶10（m/V）混合，微沸浸提30 min，抽吸過濾，將濾液冷凍干燥，獲得FTE凍干粉，密封包裝，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 動物實驗及分組

所有大鼠在溫度20～25 ℃、相對濕度（50f5）%環(huán)境下（12 h光/12 h暗循環(huán)）適應性喂養(yǎng)1周。在干預實驗期間，將所有大鼠分為6 組，每組8只，所有組自由飲水和進食，對照組（ND組）飼喂低脂飼料（脂肪質量分數(shù)10%），其余組飼喂高脂飼料（脂肪質量分數(shù)60%）。ND組與HFD組灌胃2 mL無菌水，陽性對照組（XZK組）灌胃2 mL血脂康（150 mg/kgmb），茯磚茶干預組（FTE組）均灌胃2 mL FTE。每次根據(jù)所稱每只大鼠體質量調節(jié)配制灌胃液所需樣品粉劑質量，將樣品粉劑溶于2 mL無菌水充分溶解待灌。茯磚茶干預組所有劑量通過換算并參考已有研究[5,12]確定為低劑量（FTL）組75 mg/kgmb、中劑量（FTM）組150 mg/kgmb和高劑量（FTH）組300 mg/kgmb，時長8周。

每天換水與飼料，每周稱量體質量2 次，記錄飲食量；并在無菌環(huán)境下收集糞便，迅速轉至－80 ℃保存；灌胃實驗結束后禁食不禁水12 h，麻醉，腹腔主動脈取血，脫頸后解剖，將肝臟、腎周脂肪、附睪脂肪稱質量，分離出肝臟、結腸，用組織固定液固定，附睪脂肪用脂肪固定液固定，剩余結腸與肝臟放入液氮中，轉入－80 ℃保存。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 大鼠基礎指標測定

最后一次灌胃前測定大鼠體質量與體長；灌胃期間每周三與周五稱體質量和期間飼料食用量，通過2 d內飼料消耗量和體質量增長量來計算食物利用率（式（1））。解剖時，取大鼠腎周脂肪和附睪脂肪分別稱質量。Lee’s指數(shù)、內臟脂肪系數(shù)、肝-體指數(shù)分別按公式（2）～（4）計算。

1.3.4.2 生化指標測定

將EP管中血漿靜置2 h后，在3 500 r/min、4 ℃條件下離心10 min取上清液待測；剪切凍存的肝臟，與生理鹽水按質量比1∶9制成質量分數(shù)10%的肝臟勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液待測。嚴格按照試劑盒說明書檢測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST、ALT、TBA、CAT、SOD、MDA、TNF-α、IL-6、LEP、ADPN、CPT-1水平以及肝臟TG、TC水平（結果以蛋白質量計）。血漿致動脈粥樣硬化指數(shù)（atherogenic index of plasma，AIP）按式（5）計算。

式中：cTG、cHDL-C分別表示血清中TG、HDL-C的濃度/（mmol/L）。

1.3.4.3 肝臟、結腸與附睪組織病理學觀察

取每只大鼠相同肝臟、結腸、附睪組織部位，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，顯微鏡拍照觀察，每組隨機選取6 個附睪組織，于200 倍視野下拍照并計算單位面積內脂肪細胞數(shù)目。另對肝臟進行油紅染色，每組隨機選取6 個油紅染色肝臟組織，于200 倍視野下拍照，計算脂滴面積，取平均值；對結腸進行過碘酸席夫（periodic acid Schiff，PAS）染色，顯微鏡拍照觀察。

1.3.4.4 肝臟蛋白免疫熒光染色

將肝臟石蠟切片脫蠟至水，進行抗原修復，畫圈血清封閉，加一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后加二抗避光室溫孵育50 min，進行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚復染細胞核，猝滅組織自發(fā)熒光，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。對每組隨機選取10 個400 倍視野拍照，計算平均積分光密度（mean of integrated optical density，MOD）與陽性表達面積平均積分光密度（stained area average optical density，AOD）。

1.3.4.5 腸道微生物16S rDNA基因靶向測序分析

16S rDNA基因靶向測序由天根生化科技（北京）有限公司完成。采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法對樣本的基因組DNA進行提取，之后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的糞便樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。稀釋后的基因組DNA為模板；根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物。使用高效和高保真的酶進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），確保擴增效率和準確性；16S rDNA V3～V4擴增引物為正向引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和反向引物805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用質量分數(shù)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。構建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測，合格后使用Illumina平臺進行測序，序列分析通過QIIME軟件包進行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

切片以及免疫熒光圖像應用CaseViewer軟件分析；肝臟切片脂滴面積、附睪脂肪細胞數(shù)目、MOD與AOD應用Image-Pro Plus6.0軟件計算；通過SPSS 25軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準差表示，各組比較應用方差分析（analysis of variance，ANOVA）中的最小顯著差異（least significant difference，LSD）檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 茯磚茶主要成分

表1為本實驗所測定的茯磚茶主要成分質量分數(shù)，與沈程文等的結果[13]基本一致，符合茯磚茶品質化學特征。

表1 茯磚茶主要成分Table 1 Major constituents of Fuzhuan brick tea

2.2 茯磚茶對大鼠生長體質量和食物利用率的影響

由表2可知，在灌胃FTE的第2周，F(xiàn)TE組體質量相對于HFD組增長速度變緩，所有組體質量在第3周均與HFD組表現(xiàn)出顯著差異。在FTE干預第6周時，F(xiàn)TE組和ND組體質量均與HFD組出現(xiàn)高度顯著差異（P＜0.001）。第8周結束時，各組大鼠Lee’s指數(shù)與HFD組具有顯著差異（圖1B），且XZK、FTL、FTM和FTH組體質量增加量與HFD組比較分別下降了18.45%、26.95%、30.27%和32.96%（P＜0.05）（圖1A），表明FTE在抑制體質量增長方面具有一定劑量依賴性。通過動物體質量與食物利用率能夠判斷受試動物的生存狀態(tài)，與HFD組相比，XZK與FTE干預降低了大鼠食物利用率，但各組均在健康大鼠食物利用率的參考值（15%～55%）[14]范圍內（圖1C）。與HFD組相比，血脂康干預會降低大鼠每日進食量，但FTE干預后大鼠每日進食量不受明顯影響（圖1D）。以上結果顯示，F(xiàn)TE能夠在不干擾大鼠正常飲食的情況下抑制大鼠體質量增長。

表2 茯磚茶干預期間大鼠體質量變化Table 2 Changes in body mass during intervention with Fuzhuan brick tea in rats

圖1 FTE對大鼠體質量及食物利用率的影響Fig. 1 Effect of FTE on body mass and food utilization in rats

2.3 茯磚茶對大鼠脂肪組織積累的影響

脂肪過度沉積會使機體處于低度炎癥狀態(tài)，分泌促炎性脂肪因子，并且內臟脂肪過多的堆積會對肺動脈、肝腎等器官造成機械壓力損傷，直接影響器官的正常功能[15]。與HFD組相比，F(xiàn)TE的干預明顯減少了肝臟脂滴面積、附睪脂肪質量以及腎周脂肪質量（圖2A～C），增加了附睪脂肪組織單位面積內脂肪細胞數(shù)量（圖2D、圖3），表明FTE干預減少了肝臟脂肪、附睪脂肪以及腎周脂肪的堆積。由圖2E、F可知，與HFD組相比，F(xiàn)TE顯著降低了肝-體指數(shù)與內臟脂肪系數(shù)（P＜0.05）。在預防高脂飲食大鼠脂肪積累方面，不同劑量FTE效果均優(yōu)于陽性對照XZK組，并且具有劑量依賴性。

圖2 FTE對大鼠脂肪組織的影響Fig. 2 Effect of FTE on adipose tissue in rats

圖3 大鼠附睪組織病理學觀察結果（×200）Fig. 3 Effect of FTE on the pathology of epididymal adipose tissue in rats (× 200)

2.4 茯磚茶對大鼠血清、肝臟生化指標的影響

由圖4A～F可知，與ND組相比，HFD組大鼠的血清TG、TC、LDL-C濃度及肝臟TG、TC含量顯著升高（P＜0.05），血清HDL-C濃度顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)TE干預能顯著抑制因高脂飲食導致的這些指標水平變化，其中FTH組各指標基本恢復到ND組水平。由圖4G、H可知，與ND組相比，HFD組大鼠血清AST、ALT活力顯著升高（P＜0.05）；XZK與FTE干預均能抑制肝功能酶活力的升高，而且相較于XKZ干預，F(xiàn)TE干預對肝臟AST及ALT活力有更好的抑制效果（P＜0.05）。

有研究指出，身體質量指數(shù)超過25 kg/m2后，每增加5 kg/m2，心血管疾病死亡率增加41%[16]。肥胖會提高心血管疾病等慢性疾病患病率，也有研究表明AIP與肥胖導致的非酒精性脂肪肝密切相關[17]。由圖4I可知，HFD組AIP接近高風險值（AIP＞0.21），而其他組都小于低風險值（AIP＝0.11）。

圖4 FTE對大鼠血清、肝臟生化指標的影響Fig. 4 Effect of FTE on serum lipid profile and liver function in rats

2.5 茯磚茶對大鼠氧化應激水平及炎癥因子的影響

如圖5A～I所示，與ND組相比，HFD組表現(xiàn)出了較強的氧化應激（通過血清MDA、CAT、SOD、ADPN、CPT-1水平反映）和炎癥反應（通過血清IL-6、TNF-α、TBA水平反映），F(xiàn)TE干預不同程度降低了血清MDA、IL-6、LEP、TNF-α、ADPN水平，提高了CAT活力、SOD活力（除FTL組外）和TBA濃度。CPT-1位于線粒體內膜外側，催化長鏈脂肪酸進入線粒體基質，其水平是決定脂肪酸β氧化程度的主要因素，其在血清中的質量濃度反映了機體各組織細胞線粒體氧化供能的能力，與HFD組相比，不同劑量FTE均提高了CPT-1的質量濃度。并且，F(xiàn)TM及FTH組均能使以上標記物水平達到或接近ND組水平，特別是與XZK組比較，F(xiàn)TE干預組具有更好的減輕氧化應激和炎癥的作用（P＜0.05）。然而，在FTE不同劑量組之間這些指標水平?jīng)]有全部出現(xiàn)顯著差異及劑量依賴性關系。

圖5 FTE對大鼠血清氧化應激相關指標及炎癥因子水平的影響Fig. 5 Effect of FTE on serum oxidative stress markers and inflammatory factors in rats

2.6 茯磚茶對大鼠肝臟和腸道病理學的影響

由圖6A、B可知，ND組肝細胞圍繞中央靜脈呈放射性排列，幾乎無脂滴分布。而HFD組的肝細胞周圍形成了大量的脂滴空泡，大量的脂滴擠壓細胞核，影響了細胞的結構。不同劑量FTE干預的大鼠肝細胞脂滴分布數(shù)量減少，細胞核形態(tài)正常。XZK、FTL與FTM組有少量細胞增大，出現(xiàn)少量脂滴空泡，F(xiàn)TH組的細胞結構幾乎與ND組無異。

良好的腸道微生物環(huán)境與消化作用的前提是保持腸道組織結構和功能的完整性。由圖6C、D可知，F(xiàn)TE的干預能明顯保護高脂飲食的大鼠結腸組織內部結構。ND組結腸黏膜完整，結構無異常，絨毛正常排列，肌層薄厚適中，杯狀細胞及分泌的黏蛋白結構均正常分布。而HFD組出現(xiàn)了明顯的炎性細胞浸潤，絨毛出現(xiàn)缺失，肌層變薄，整個腸道結構受到破壞。XZK組有少量炎性細胞浸潤，絨毛較為整齊，肌層稍薄，杯狀細胞及黏蛋白分泌較為豐富，結構尚完整。FTE干預組的腸道結構都未遭到破壞，無炎性細胞浸潤，絨毛分布整齊且較長，杯狀細胞及黏蛋白分泌非常豐富，對腸道結構具有保護作用。因此，認為茯磚茶對高脂飲食大鼠的肝臟與腸道的結構完整性及功能具有一定的保護作用，為正常的機體代謝與預防肥胖的發(fā)生提供了基礎保障。

圖6 FTE對大鼠肝臟及結腸組織病理的影響Fig. 6 Effect of FTE on the pathology of liver and colon tissues in rats

2.7 茯磚茶對肝臟蛋白表達的影響

為了確定FTE對肝臟BA合成和膽固醇代謝的影響，對BA合成過程中關鍵限速酶CYP7A1和CYP27A1進行了免疫熒光分析，并對每組10 張隨機截取的圖片進行MOD與AOD分析（圖7）。結果表明，相對于HFD組，中、高劑量FTE都提高了CYP7A1的MOD與AOD，其中FTH高度顯著提升了CYP27A1的MOD和AOD（P＜0.001），而XZK組顯著提升了CYP7A1的MOD，所以FTH和FTM干預上調了BA合成中限速酶的表達。在ND、FTM和FTH組肝臟切片上均勻出現(xiàn)了CYP7A1熒光分布，其他組的CYP7A1熒光則主要分布在切片邊緣位置。ND及FTE干預組的CYP27A1有序分布在細胞核膜周圍，F(xiàn)TE使得上述限速酶恢復至正常狀態(tài)。在40?倍放大條件下觀察，HFD組的蛋白熒光較少分布在切片周圍，F(xiàn)T干預組則較為均勻分布在切片上。限速酶的分布差異可能是由于肝臟脂質積累開始于肝臟內部，影響了內部細胞BA合成與膽固醇代謝。

圖7 大鼠肝臟CYP7A1與CYP27A1免疫熒光染色代表性圖像及分析Fig. 7 Representative images and analysis of liver CYP7A1 and CYP27A1 immunofluorescence staining in rats

2.8 茯磚茶對腸道微生物群調控脂質代謝的作用

腸道微生物群與宿主肥胖和代謝有著密切的聯(lián)系，哺乳動物中的共生微生物群通過相互動態(tài)平衡及與疾病的相互作用對宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能起到重要作用[6,8]。已有探究腸道微生物與脂質代謝之間關系的相關研究[5,9,18-20]，在此基礎之上，本實驗對大鼠糞便進行了微生物16S rDNA基因靶向測序，在門、屬的水平上分析FTE對大鼠腸道微生物結構和功能的影響。

圖8 各組大鼠糞便微生物群測序深度（A）及α多樣性（B）比較Fig. 8 Comparison of sequencing depth (A) and α diversity (B) of rat fecal microbiota in six groups

16S rDNA基因靶向測序分析結果表明，各組間測序深度無顯著差異，基本覆蓋了樣品中物種信息（圖8A）。與HFD組相比，F(xiàn)TE干預對腸道微生物群的Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)以及Shannon指數(shù)有一定的提升作用，但無統(tǒng)計學差異（圖8B）（P＞0.05），表明FTE干預對微生物群物種數(shù)目及物種多樣性雖有一定影響，但主要還是在改變菌群結構方面。

圖9 FTE對高脂飲食大鼠腸道微生物群的調節(jié)作用Fig. 9 Regulatory effects of FTE on gut microbiota of HFD-fed rats

圖10 FTE調控大鼠腸道微生物群組成對腸-肝BA代謝循環(huán)的影響Fig. 10 FTE affected the intestinal and hepatic BA metabolism cycle by modulating the composition of gut microbiota in rats

基于門水平和屬水平物種豐度進行主成分分析（principal component analysis，PCA）（圖9A、圖10A）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）（圖9B、圖10B），結果表明，各組在圖中呈分散分布，在FTE干預組中，F(xiàn)TL與FTM組距離最接近，且與ND組距離相比FTH組更近，說明不同飲食結構能明顯改變大鼠腸道微生物群結構，且FTH干預對高脂飲食大鼠微生物群結構改變效果最明顯。由圖9C可知，高脂飲食會提高Firmicutes、Verrucomicrobia的相對豐度，與文獻[21-22]的結果相同，并且還會降低Bacteroidetes相對豐度；但XZK和FT干預會不同程度提高Bacteroidetes相對豐度以及降低Firmicutes相對豐度，進而導致了Firmicutes與Bacteroidetes相對豐度比值（F/B）的降低（圖9D）。對不同組間門水平進行定量分析后，選擇相對豐度較高分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）進一步進行定量比較，發(fā)現(xiàn)與HFD組相比，F(xiàn)TH組OTU413275、OTU428632和OTU3265227、OTU33984相對降低，New.ReferenceOTU22、OTU4366843、OTU174337、New.ReferenceOTU47相對豐度增加，F(xiàn)TM組OTU447776和NROTU22相對豐度增加，F(xiàn)TL組OTU4431545和OTU447776相對豐度增加（圖9E）。

為了探究大鼠腸道微生物改變對BA代謝的影響，利用Metastats軟件對微生物群落進行分析（圖10C～E）。FTE干預逆轉并明顯增加了部分菌屬的相對豐度，其中Akkermansia、Bacteroides相對豐度顯著增加。膽汁鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）相關微生物的活性與腸道結合膽汁酸（conjugated bile acid，CBA）含量呈負相關，腸道CBA含量的增加會抑制BA回流，從而增加肝臟BA的合成[9]，說明茯磚茶可以通過影響B(tài)SH相關微生物的豐度從而干預BA代謝。與HFD組相比，XZK及FTE組BSH相關微生物Lactobacillus絕對豐度出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），同時Lactococcus、Streptococcus、Enterococcus絕對豐度出現(xiàn)不同程度下降，另外，其他屬Ruminococcus、Blautia、Coprococcus等的相對豐度也有不同程度降低。

對相對豐度較高的OTU和BSH相關微生物與環(huán)境因子進行相關性分析（圖10E），大鼠肝質量和血清LDL-C、TG、TC、IL-6、LEP、TNF-α水平主要與Firmicutes相對豐度有顯著的正相關性，與Bacteroidetes、Verrucomicrobia和部分Firmicutes豐度具有顯著負相關性；而血清CPT-I、TBA、CAT和HDL-C水平與上述微生物的相對豐度表現(xiàn)出相反的相關性。結合血清指標可以得出，F(xiàn)TH明顯增加了OTU4366843、NROTU22和OTU174337的相對豐度，而明顯降低了OTU4397402、OTU3265227、OTU428632和OTU413275的相對豐度，其他被高脂飲食改變的OTU一定程度被FTE逆轉（P＞0.05）。因此，認為FTE可能直接或間接通過調控菌群OTU來調節(jié)大鼠腸-肝BA代謝，并對大鼠機體抗氧化、脂代謝和BA循環(huán)產(chǎn)生影響。

為了研究組間具有顯著性差異的功能，通過16S rDNA測序獲得的物種構成與KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫比對，對所有樣品微生物群綱水平進行功能注釋，推測樣本中功能基因的構成（圖11）。將FT干預組與HFD組進行了STAMP差異分析，經(jīng)Welch’st-test檢驗發(fā)現(xiàn)，與HFD組比較，F(xiàn)T干預導致部分功能豐度發(fā)生了改變。對FTH組63 個（21 個增加、42 個降低）、FTM組13 個（8 個增加，5 個降低）以及FTL組3 個（3 個降低）功能發(fā)生顯著改變的功能模塊作圖。FTE處理主要引起了部分代謝途徑的變化，如氨基酸、?；撬?、鞘脂和脂質代謝等，還改變了一些次生代謝產(chǎn)物的生物合成以及一些機體系統(tǒng)運轉與復雜疾病的途徑如離子通道、生物轉運與合成、糖尿病等。因此，F(xiàn)TE的干預影響了高脂飲食大鼠的腸道菌群功能。

圖11 FTE對PICRUST預測的大鼠腸道微生物群落功能的影響Fig. 11 Effect of FTE on microbial community functions in gut of rats predicted by PICRUST

綜上，F(xiàn)TE調節(jié)腸道微生物群在預防高脂飲食導致的肥胖中起重要作用，并且與宿主腸道代謝功能有著緊密聯(lián)系，可能影響腸-肝BA循環(huán)。BA、短鏈脂肪酸以及腸道代謝物與微生物相互影響，部分菌群與宿主代謝和肥胖表型之間有著直接或間接的因果關系。FTE中物質成分或經(jīng)微生物代謝可能在宿主消化系統(tǒng)中改變微生物群生活環(huán)境，影響微生物群生物功能，從而調控菌群OTUs豐度來影響宿主代謝功能，進而到達預防肥胖的作用。

3 討 論

肥胖被廣泛認為是能量攝入和消耗代謝之間不平衡導致的。肥胖機制較為復雜，作為一種疾病，常常伴隨認知和運動能力衰退[23]、腎臟功能異常引起的高血壓[24]、心臟增大與代謝減弱[25]以及哮喘[26]等其他疾病的發(fā)生。肥胖的年輕化所帶來的健康問題給個人及醫(yī)療體系造成了沉重負擔。游牧民族飯后飲茶的習慣幫助解決其高熱量油膩飲食帶來的健康問題，隨著生活水平的提高，肥胖發(fā)生率呈上升狀態(tài)。因此，肥胖的預防變得越來越關鍵，主要措施包括飲食和運動。

部分實驗結果表明茯磚茶或所含成分對肥胖及血脂異常具有治療效果[27-29]。本實驗表明大鼠在高脂飲食過程中預防肥胖及脂質異常的作用，F(xiàn)TE顯著抑制了其體質量的快速增長（表2、圖1），改善了脂質譜（圖4），對ADPN及炎癥因子水平具有降低作用（圖5）。肥胖的發(fā)生會導致LEP水平增加，而LEP水平增加會導致中樞瘦素敏感性降低和瘦素受體抵抗作用增加[30]，F(xiàn)TE顯著緩解了機體高LEP水平（圖5）。FTE干預能降低肝功能指標水平，保護肝臟細胞結構，并提升血清中CPT-1水平，促進肝臟及其他部位對脂肪酸的利用，為肝臟綜合代謝功能提高保障，顯示出茯磚茶在預防肥胖方面具有積極作用（圖5）。持續(xù)高脂肪飲食通過破壞腸黏膜、增加機體內臟脂肪組織含量，尤其是腸系膜脂肪增生，持續(xù)分泌促炎細胞因子，導致炎癥細胞浸潤破壞腸道屏障，從而影響腸道功能[31]。茯磚茶被報道對炎癥性腸病具有保護和治療作用[4,32]，本研究得出相似結果，F(xiàn)TE預防了高脂飲食導致的腸道炎癥的發(fā)生，并通過促進杯狀細胞黏蛋白的釋放來保護腸道屏障與功能（圖6）。

FTE干預改變了腸道微生物群結構和功能，顯著提升了Akkermansia、Bacteroides和Lachnospiraceae等菌屬的豐度，顯著降低Firmicutes的豐度，并降低了F/B比值（圖8～10）。有研究發(fā)現(xiàn)超重、肥胖與腸道Akkermansia、Bacteroides相對豐度存在負相關關系[33-34]，一項臨床試驗表明補充Akkermansia、Muciniphila能改善胰島素血癥和血漿TC水平，并有改善體質量、肝功能和炎癥作用[35]。選擇性進食有益于腸道功能和微生物群落的食品能改善肝臟脂質沉積和全身性炎癥，如綠茶提取物和異麥芽寡糖組合降低了F/B比值，恢復肝臟脂質代謝[22]。所以，茯磚茶是預防肥胖具有前景的輔助功能性食品。

BA代謝循環(huán)是機體調節(jié)膽固醇的關鍵機制（圖12）。人體主要產(chǎn)生膽酸（cholic acid，CA）和鵝去氧膽酸（chenodeoxy-cholic acid，CDCA），而嚙齒動物體內的CDCA會轉化為鼠膽酸。通過膽管分泌進入腸道的CBA經(jīng)過微生物作用生成非結合BA（unbound bile acid，UBA），未分解的CBA在回腸遠端被頂端鈉依賴性膽汁酸轉運體（apicalsodium dependent bile acid transporte，ASBT）重新吸收，通過門靜脈由?；悄懰徕c協(xié)同轉運多肽（sodium taurocholate cotransport peptide，NCTP）回收至肝臟[8]。一般性乳酸桿菌和梭狀芽孢桿菌相對豐度的降低，與BSH活性及?；撬?β-鼠膽酸在腸道的積累下降有關[36]。BA的微生物代謝與微生物結構具有相互作用[8]，微生物代謝可形成疏水性BA池，促進BA的清除。FTE下調了BSH相關微生物的絕對豐度，對BSH分解CBA形成UBA具有一定抑制作用。而普洱茶中的茶褐素對BSH相關微生物具有抑制作用，并且在回腸遠端積累CBA抑制了腸道FXR-成纖維細胞生長因子15（fibroblast growth factor 15，fgf15）信號傳導，從而減少了肝臟成纖維細胞生長因子受體4（fibroblast growth factor receptor 4，fgfr4）的表達，下調對BA合成過程的抑制作用，同時促進了BA的排泄[9]。表明FTE可能同樣能夠通過改變微生物結構增加糞便總BA的排泄，增強BA循環(huán)中的合成過程來維持BA平衡。普洱茶對肝臟BA合成基因、氧化甾醇7α-羥化酶（oxysterol 7α-hydroxylase，CYP7B1）、CYP27A1和CYP7A1均具有上調作用，對甾醇12α-羥化酶（sterol 12alpha-hydroxylase，CYP8B1）無顯著影響[9]，而腸道微生物群也能調節(jié)幾種酶的表達，包括CYP7A1、CYP7B1和CYP27A1[37]。本實驗中，F(xiàn)TE干預提高了CYP7A1和CYP27A1的表達量，逆轉了高脂飲食造成的限速酶分布差異，BA合成代謝加強，可能使CA與CDCA合成增加，血清TBA濃度提高（圖5、7）。而CDCA對BA合成經(jīng)典途徑中的CYP7A1和CYP8B1有輕微抑制作用，導致CDCA合成的進一步增加，促進肝臟FXR通路[9]。增加BA合成與清除的正向循環(huán)，加強了機體BA循環(huán)對膽固醇的清除，緩解了膽固醇的堆積。而肝臟FXR的表達可增強肝臟脂質代謝及其他代謝通路[38-39]，防止肝臟脂肪變性和甘油三酯水平升高[18]。

圖12 FTE預防肥胖及高膽固醇血癥作用相關機制Fig. 12 Related mechanism of FTE in preventing obesity and hypercholesterolemia

4 結 論

FTE抑制了大鼠高脂飲食狀態(tài)下的體質量快速增長，降低了全身性脂質積累、內臟脂肪系數(shù)以及AIP，對機體抗氧化反應與炎癥作用具有積極作用。組織病理結果表明FTE能明顯保護肝臟細胞結構和功能以及腸道結構。FTE干預調節(jié)了高脂飲食導致的微生物群落結構與功能的改變，對BSH相關微生物具有一定的抑制作用。另外，F(xiàn)TE改變了高脂飲食引起的肝臟BA生成過程中主要限速酶CYP7A1和CYP27A1的分布變化，且促進了其表達。相對于XZK降脂藥物，同劑量下的FTE在預防高脂膳食大鼠體質量增長、脂質積累與消耗以及BA代謝方面更具優(yōu)勢。這些結果初步表明了FTE在預防肥胖和高膽固醇血癥方面具有積極作用。但是，茯磚茶中的多種成分具有相似功能活性，樣品中茶色素與多酚類、黃酮類化合物通過以上機制預防作用過程中是拮抗還是協(xié)同作用尚不得知。肝臟FXR是代謝機制的中心，茯磚茶如何深入調控腸道肝臟FXR及其通路代謝還有待進一步研究。