丁 浪 夏立萍 沈 斌 張建設(shè)

(浙江海洋大學(xué) 國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 浙江舟山 316022)

重金屬污染是指通過各種途徑進(jìn)入到環(huán)境中的鎘(Cd)、鉛(pb)、鉻(Cr)、砷(As)等重金屬或其化合物對環(huán)境造成的污染。進(jìn)入水環(huán)境中的重金屬被魚體吸收、富集或者生物放大(劉長發(fā)等, 1999), 再通過食物鏈傳遞, 危害人體健康。鎘(Cd)是一種毒性極大的重金屬, 在水環(huán)境中主要以離子形式(Cd2+)存在, 具有高毒性、易蓄積性、強(qiáng)組織親和性等特點(Silvestreet al, 2006), 在生物體內(nèi)積累后會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟等產(chǎn)生毒害作用(Stohset al, 1995)。Cd2+的生物毒性主要表現(xiàn)為與金屬硫蛋白(metallothionein,MT)結(jié)合成有機(jī)絡(luò)合物, 或通過離子鍵與生物體內(nèi)的核苷酸、蛋白質(zhì)等形成配位化合物(Hyllandet al,1994), 導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變, 酶活性喪失, 從而干擾細(xì)胞的正常生理代謝。此外, Cd2+還在生物體內(nèi)發(fā)生氧化還原反應(yīng), 產(chǎn)生自由基導(dǎo)致細(xì)胞氧化受損(李海蓉等, 2003)。

關(guān)于重金屬污染物對魚類抗氧化系統(tǒng)影響的研究發(fā)現(xiàn), 抗氧化防御系統(tǒng)最重要的一項特征就是其活性成分或含量可因污染脅迫而發(fā)生改變, 可間接反映污染物對水生生物的影響(魯雙慶等, 2002;Monteiroet al, 2010; 趙漢取等, 2014)。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)家族作為抗氧化防御系統(tǒng)的重要成員(Aktaret al, 2019; Chenet al,2019; Wuet al, 2019), 因其在抗氧化方面的重要作用,已有研究將其作為環(huán)境監(jiān)控生物標(biāo)志物(Cunhaet al,2007)。GPx 不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 還可以保護(hù)機(jī)體生物膜免受氧化損傷(Wuet al, 2010)。GPx7為近年來新發(fā)現(xiàn)的GPx 家族非含硒成員, 其活性中心Sec 被Cys 代替, 具有緩解多不飽和脂肪酸介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能(Utomoet al, 2004), 也能緩解si RNA靶向干擾目標(biāo) mRNA 脫靶產(chǎn)生的應(yīng)激(Weiet al,2012)。GPx8 是GPx 家族最后被確認(rèn)的成員, 作為活性氧自由基清除劑, 能夠有效阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化物蛋白Ero1 產(chǎn)生的過氧化氫外溢(Ramminget al, 2014),還通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度和通量參與調(diào)控細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Yoboueet al, 2017)。

中華烏塘鱧是一種廣鹽廣溫、低氧耐受性很強(qiáng)的魚類, 通常棲息于溫水性淺海咸淡水區(qū)域, 因其具有加速傷口愈合的功效, 被認(rèn)為是藥用價值非常高的食用魚之一, 成為東南沿海重要養(yǎng)殖對象。目前已有研究應(yīng)用魚類、貝類和藻類的特定基因作為生物標(biāo)志物進(jìn)行環(huán)境污染物監(jiān)測(蔡中華等, 2012), 因此研究中華烏塘鱧谷胱甘肽過氧化物酶基因?qū)τ陴B(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和海洋生態(tài)研究都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 組織樣品獲取

本研究所用中華烏塘鱧[體重為(50.48±0.37) g,體長為(14.08±0.22) cm], 購自浙江臺州某養(yǎng)殖場, 暫養(yǎng)于長60 cm×寬40 cm×60 cm的充氣玻璃缸中, 鹽度15, 水溫25 °C, 每天換水1 次, 投喂新鮮蝦仁沫1 次,暫養(yǎng)適應(yīng)7 d。取暫養(yǎng)適應(yīng)后的健康中華烏塘鱧3 尾,快速解剖采集血液、腦、心臟、頭腎、鰓、肝臟、脾臟、皮膚、肌肉和腸組織, 迅速投入液氮中保存, 用于研究BsGPx7 和BsGPx8 基因在組織中的表達(dá)分布。

將暫養(yǎng)適應(yīng)后的中華烏塘鱧隨機(jī)分為四組, 即對照組和實驗組1、2 和3, 每組35 尾魚。根據(jù)實驗室前期研究所得中華烏塘鱧在Cd2+脅迫下96 h 半致死濃度(LC50)為61.44 mg/L (取LC50為60 mg/L), 配制Cd2+濃度為50 mg/L 的母液, 將實驗組Cd2+濃度梯度設(shè)置為1/8 LC50(7.5 mg/L, 實驗組1)、1/4 LC50(15 mg/L, 實驗組2)和1/2 LC50(30 mg/L, 實驗組3),試驗期間不換水。對照組視為0 h, 至少取3 尾魚, 實驗組分別在處理后的3、6、12、24、48、72、96 h取樣, 每組每個時間點至少取3 尾魚, 快速解剖采集肝臟、鰓、頭腎、脾臟和皮膚組織, 迅速投入液氮中保存。

1.2 總RNA 提取和cDNA 合成

參考魏可(2020)的方法, 用 Trizol Reagent(Invitrogen, USA)提取上述組織的總 RNA, 使用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen, USA), 根據(jù)說明書的方法步驟將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 BsGPx7 和BsGPx8 序列擴(kuò)增及測序

利用Primer 5.0 設(shè)計引物, 對BsGPx7 和BsGPx8基因的CDS 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 引物序列見表1。使用TaKaRa TaqTMHS Perfect Mix 試劑(TaKaRa, 中國), 以中華烏塘鱧肝臟cDNA 為模板, 按照說明書進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增, 擴(kuò)增條件為: 94 °C 變性30 s,62 °C 復(fù)性30 s, 72 °C 延伸16 s, 34 個循環(huán), 最后72 °C延伸10 min。PCR 產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳, 在紫外燈下切割預(yù)期條帶, 使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京全式金生物公司)進(jìn)行PCR 產(chǎn)物回收。將上述回收產(chǎn)物連接到 pGEM-T easy Vector 載體(Promega, USA), 轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa,中國), 經(jīng)藍(lán)白斑實驗篩選出陽性克隆, 通過測序獲得BsGPx7 和BsGPx8 的CDS 序列。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequences

1.4 BsGPx7 和BsGPx8 基因序列的生物信息學(xué)分析

利用在線工具Color Align Properties (Color Align Properties (bioinformatics.org) 和 EMBOSS Needle(EMBOSS Needle＜Pairwise Sequence Alignment＜EMBL-EBI)對測序所得的CDS 序列進(jìn)行多序列比對和同源性分析。利用ExPASY (https://www.expasy.org/)網(wǎng)站預(yù)測分子量和理論等電點; 利用SignalP-5.0 Serve (http://www.cBs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽。利用在線網(wǎng)絡(luò)工具SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測; 利用 SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)對蛋白質(zhì)的3D 結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測并用PyMol 2.7 軟件查看展示結(jié)果。基于物種的氨基酸序列進(jìn)行Cluster x 多重序列比對, 并利用 MEGA X 中的Neighbor-Joining 方法構(gòu)建序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.5 BsGPx7 和BsGPx8 的組織分布及Cd2+脅迫后的表達(dá)變化

以測序所得BsGPx7 和BsGPx8 的CDS 序列設(shè)計Real-time PCR 引物, 選取中華烏塘鱧 β-肌動蛋白(Bs-β-actin)為內(nèi)參基因, 引物序列見表 1。使用TaKaRa TB Green?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑(TaKaRa, 中國), 在ABI7500 Fast Real-time PCR 系統(tǒng)檢測不同組織(腦、心臟、頭腎、鰓、肝臟、脾臟、皮膚、肌肉、腸、血液)中BsGPx7 和BsGPx8基因的分布表達(dá)以及不同濃度Cd2+脅迫下, 主要免疫器官(肝臟、頭腎、脾臟)和直接暴露器官(鰓、皮膚)中BsGPx7 和BsGPx8 基因的表達(dá)變化。

BsGPx7 和BsGPx8 基因相對表達(dá)量使用 2-ΔΔCt法(Weiet al, 2020)進(jìn)行計算, 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 22.0 進(jìn)行單因素方差分析和獨立樣本T檢驗,P＜0.05 為差異顯著,P＜0.01 為差異極顯著。

1.6 BsGPx7 蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)純化

序列經(jīng)大腸桿菌常用密碼子優(yōu)化后, 人工合成一條長度為 567 bp 的 BsGPx7 DNA 片段, 包含BsGPx7 開放閱讀框序列、NdeI/EcoRI 限制性內(nèi)切酶位點、6×His tag 序列和凝血酶切割位點序列。參照Wei 等(2020)的方法進(jìn)行 pET-28b(+)表達(dá)載體(Novangen, 中國)的連接轉(zhuǎn)化以及BsGPx7 重組蛋白的表達(dá)純化。誘導(dǎo)條件為終濃度1 mmol/L 的IPTG,37 °C 誘導(dǎo)4 h, 所得菌液在離心后用PBS 洗滌, 10%Glycerol 裂解液重懸, 在冰上進(jìn)行超聲波破碎。用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色的SDS-PAGE 檢測上清液和裂解液碎片中重組蛋白的表達(dá)水平。選擇上清液, 用Ni-NTA His·Bind?Resins (Novangen, 中 國) 進(jìn) 行rBsGPx7 蛋白純化。

1.7 溫度和pH 對rBsGPx7 蛋白酶活性的影響

參照張秋霞(2013)的實驗方法, 測定溫度和pH對rBsGPx7 蛋白酶活性的影響。將rBsGPx7 蛋白樣品(pH 7.5)在25～65 °C (間隔為10 °C)的水浴中孵育10 min。測定最適pH 時, rBsGPx7 蛋白樣品在pH 范圍5.0～9.0 (間隔1.0)的0.2 mol/L 緩沖液中處理5 min,然后立即轉(zhuǎn)移至冰上終止反應(yīng)。使用谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(南京建成)開展酶活性測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 BsGPx7 和BsGPx8 序列分析

通過分子克隆得到中華烏塘鱧GPx 基因兩個亞型GPx7 和GPx8 的CDS 序列, GenBank 注冊號分別為: OK754601 和OK754602。BsGPx7 基因的開放閱讀框包含561 bp 核苷酸共編碼186 個氨基酸(圖1a),預(yù)測蛋白理論分子量為21.05 kDa, 等電點為9.44。經(jīng)預(yù)測, 第 1～19 位氨基酸為信號肽序列, 表明BsGPx7 為分泌蛋白。第24～132 位殘基為GPx 家族蛋白結(jié)構(gòu)域, 包含2 個保守的半胱氨酸殘基(Cys56和Cys85)催化位點。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示GPx7 包含6個α-螺旋和6 個β-折疊(圖1b)。BsGPx8 基因的開放閱讀框包含633 bp 核苷酸, 編碼210 個氨基酸(圖1c),蛋白理論分子量為23.88 kDa, 等電點為9.52。經(jīng)預(yù)測, BsGPx8 蛋白不存在信號肽序列, 說明其可能不是分泌蛋白。第 21～40 位殘基為跨膜螺旋區(qū), 第48～156 位殘基為GPx 家族蛋白結(jié)構(gòu)域, 包含 1 個半胱氨酸殘基(Cys109)催化位點, 三級結(jié)構(gòu)包括6 個α-螺旋和6 個β-折疊(圖1d)。

圖1 BsGPx7、BsGPx8 核苷酸序列和預(yù)測氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and deduced amino acid sequences of BsGPx7/BsGPx8

2.2 BsGPx7 和BsGPx8 基因氨基酸多序列比對和同源性分析

多序列比對和同源性分析發(fā)現(xiàn), BsGPx7 和BsGPx8與其他物種的GPx7 和GPx8 均具有較高同源性, GPx家族蛋白結(jié)構(gòu)域高度保守, 并且具有保守的半胱氨酸催化位點(圖2, 圖3)。BsGPx7 與鱸形目魚類同源性最高, 其中與蝦虎魚科的大鰭彈涂魚(Periophthalmus magnuspinnatus)的同源性高達(dá)92.0% (表2)。BsGPx8同樣與鱸形目魚類的GPx8 同源性最高, 與大鰭彈涂魚同源性高達(dá)95.7% (表3)。

圖2 BsGPx7 氨基酸序列與其他同源物種的比對Fig.2 Alignment of amino acid sequence of BsGPx7 with other homologues

圖3 BsGPx8 氨基酸序列與其他同源物種的比對Fig.3 Alignment of amino acid sequence of BsGPx8 with other homologues

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用Neighbor-joining 方法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,分別對已知的11 個物種的GPx7 和GPx8 基因序列進(jìn)行比對建樹(物種登錄號見表2, 表3), 研究中華烏塘鱧GPx7、GPx8 基因與其他物種間的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明GPx7 與GPx8 分別與其他物種的該基因聚為一支, 在硬骨魚類、鳥類、哺乳動物中明顯分支。在魚類進(jìn)化分支中, 中華烏塘鱧GPx7 和GPx8 均先與鱸形目蝦虎魚科的魚類聚在一起(圖4)。

圖4 基于BsGPx7 和BsGPx8 的編碼區(qū)氨基酸序列建立的NJ 進(jìn)化樹Fig.4 Neighbor-joining tree based on amino acid sequences of BsGPx7 and BsGPx8 coding region

表2 BsGPx7 多序列比對和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的物種登錄號Tab.2 The sequences GenBank accession number of BsGPx7 for pairwise alignment and neighbor-joining tree

表3 BsGPx8 多序列比對和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的物種登錄號Tab.3 The sequences GenBank accession number of BsGPx8 for pairwise alignment and neighbor-joining tree

2.4 BsGPx7 和BsGPx8 在組織中的分布表達(dá)

對健康中華烏塘鱧的組織(肝臟、脾臟、頭腎、腦、心臟、鰓、皮膚、肌肉、腸、血液) 進(jìn)行RT-PCR檢測, 相對表達(dá)量以目的基因在腸中的表達(dá)量進(jìn)行歸一校準(zhǔn)。結(jié)果顯示BsGPx7 在組織中呈泛在性表達(dá)(圖5a), 在肝臟中表達(dá)量最高(9 倍), 其次在鰓(7 倍)和皮膚(5 倍)表達(dá)豐富。BsGPx8 在組織中同樣呈泛在性表達(dá)(圖6a), 在肝臟中的表達(dá)量(7 倍)顯著高于其他組織。

2.5 BsGPx7 和BsGPx8 在Cd2+刺激后的基因表達(dá)分析

研究結(jié)果表明, 不同濃度的Cd2+脅迫后, BsGPx7基因表達(dá)量發(fā)生了不同程度的變化(圖 5)。肝臟中BsGPx7 基因的表達(dá)量在1/8 LC50Cd2+脅迫3 h 后顯著下調(diào), 6 h 恢復(fù)至初始水平后再次下調(diào), 直至96 h 恢復(fù)初始水平; 1/4 LC50組在24 h 出現(xiàn)下調(diào), 48 h 上調(diào)至峰值后再次下調(diào); 1/2 LC50組在3 h 后顯著下調(diào)并一直維持在初始水平以下(圖5b)。鰓中BsGPx7 基因表達(dá)量在1/8 LC50、1/4 LC50的Cd2+脅迫3 h 后顯著下調(diào), 均在96 h 快速上調(diào)至峰值; 1/2 LC50組在6 h 發(fā)生快速上調(diào), 12 h 達(dá)到峰值, 24 h 后恢復(fù)至初始水平(圖5c)。頭腎中BsGPx7 基因表達(dá)量在1/8 LC50的Cd2+脅迫3 h后顯著下調(diào)后逐漸回調(diào)但始終低于初始水平; 1/4 LC50組在3 h 顯著下調(diào), 24 h 快速上調(diào)并達(dá)到峰值,96 h 恢復(fù)至初始水平; 1/2 LC50組在6 h 顯著下調(diào)后逐漸并回調(diào), 并在48 h 上調(diào)至峰值(圖5d)。脾臟中BsGPx7 基因表達(dá)量在1/8 LC50的Cd2+脅迫3 h 后顯著下調(diào), 12 h 快速上調(diào)后再下調(diào), 72 h 再次快速上調(diào)至峰值; 1/4 LC50組在6 h 出現(xiàn)顯著下調(diào)后逐漸恢復(fù)至初始水平; 1/2 LC50組在3 h 后顯著下調(diào), 24 h 恢復(fù)至初始水平后下調(diào)并趨于穩(wěn)定水平(圖 5e)。皮膚中BsGPx7 的表達(dá)量在1/8 LC50的Cd2+脅迫24 h 后出現(xiàn)上調(diào), 之后逐漸恢復(fù)至初始水平; 1/4 LC50組在96 h后快速上調(diào)至峰值; 1/2 LC50組在6 h 快速上調(diào)至峰值,24 h 后逐漸趨于穩(wěn)定水平(圖5f)。

圖5 BsGPx7 基因的表達(dá)分析Fig.5 The expression analyses of BsGPx7

不同濃度的Cd2+脅迫后, BsGPx8 基因表達(dá)水平都發(fā)生了顯著變化(圖6)。肝臟BsGPx8 基因表達(dá)量在1/8 LC50的Cd2+脅迫6 h 后快速上調(diào), 96 h 達(dá)到峰值; 1/4 LC50、1/2 LC50組均在3 h 快速上調(diào), 分別在12 h 和48 h 達(dá)到峰值(圖6b)。鰓中BsGPx8 基因表達(dá)量在1/8 LC50的Cd2+脅迫96 h 后快速上調(diào)至峰值; 1/4 LC50組在72 h 快速上調(diào), 96 h 達(dá)到峰值; 1/2 LC50組則在3 h 后快速上調(diào), 6 h 達(dá)到表達(dá)量峰值(圖6c)。頭腎BsGPx8 基因表達(dá)量在1/8 LC50的Cd2+脅迫12 h 后顯著下調(diào), 72 h 快速上調(diào)至峰值; 而1/4 LC50、1/2 LC50組在3 h 后顯著下調(diào)并一直處于初始水平以下(圖6d)。脾臟BsGPx8 基因表達(dá)量在1/8 LC50的Cd2+脅迫12 h 后快速上調(diào)并達(dá)到峰值, 之后逐漸下調(diào)至初始水平以下; 1/4 LC50組在3 h 上調(diào)至峰值, 12 h 后恢復(fù)初始水平至96 h 后再次上調(diào); 1/2 LC50組在12 h 出現(xiàn)快速上調(diào), 48 h 后穩(wěn)定在高表達(dá)水平(圖6e)。皮膚中BsGPx8 基因表達(dá)量在1/8 LC50的Cd2+脅迫3 h 后快速上調(diào), 之后逐漸恢復(fù)并穩(wěn)定在初始水平; 1/4 LC50、1/2 LC50組均在96 h 快速上調(diào)并達(dá)到峰值(圖6f)。

2.6 rBsGPx7 蛋白表達(dá)純化

經(jīng)1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)后, rBsGPx 在E. coliBL21 細(xì)胞中大量表達(dá)。用SDS-PAGE 和考馬斯亮藍(lán)R-250 染色對細(xì)胞裂解產(chǎn)物的可溶性部分進(jìn)行檢測,檢測到融合BsGPx7 的預(yù)期條帶(圖7a)。用Ni-NTA柱純化裂解液上清液中的可溶性蛋白并進(jìn)行 SDSPAGE 分析, 觀察到純化后BsGPx7 的單個條帶(圖7b), 符合預(yù)期大小(21.33 kDa)。共獲得蛋白2.88 mg(0.32 mg/mL)。

圖7 rBsGPx7 蛋白的表達(dá)和純化Fig.7 Expression and purification of recombinant BsGPx7 protein

2.7 溫度和pH 對rBsGPx7 酶活性的影響

以還原型谷胱甘肽(GSH)和過氧化氫為反應(yīng)底物,分別在25～65 °C, pH 5.0～9.0 范圍內(nèi)反應(yīng)后測定GSH剩余量, 用酶促反應(yīng)的速度來表示谷胱甘肽過氧化物酶活性, 結(jié)果見圖8。由圖8 可知, 在25～65 °C 范圍內(nèi), rBsGPx7 酶活性先隨溫度升高而升高, 35 °C 時達(dá)到最大值, 之后隨溫度升高而降低; 在pH 5.0～9.0范圍內(nèi), 隨著pH 升高, rBsGPx7 的酶活性先逐漸升高,在pH 為8.0 時達(dá)到最大值, 之后pH 升高至9.0, 酶活性驟降。

圖8 rBsGPx7 酶活性測定Fig.8 Assays of rBsGPx7 enzymatic activity

3 討論

GPx 抗氧化的作用機(jī)理是催化谷胱甘肽(GSH)為氧化型谷胱甘肽(GSSG), 使有毒的過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的羥基化合物, 從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的損傷(Huanget al,2019)。本研究成功克隆了中華烏塘鱧GPx7 和GPx8基因的CDS 序列, 通過序列分析證實了中華烏塘鱧GPx7 和GPx8 隸屬于GPx 家族, 都編碼一個典型的GPx 家族結(jié)構(gòu)域, 可以催化過氧化物轉(zhuǎn)化為水從而保護(hù)機(jī)體不被過度氧化損傷。多序列比對發(fā)現(xiàn)BsGPx7、BsGPx8 與鱸形目的大鰭彈涂魚一致性高達(dá)90%以上,不同物種GPx 序列在進(jìn)化上高度保守, 說明其在生物體內(nèi)起重要作用。

目前研究已證明重金屬會誘導(dǎo)氧化脅迫(Ercalet al, 2001), 當(dāng)活性氧平衡被破壞, 魚體需要經(jīng)過一定的氧化脅迫時間才能逐漸恢復(fù)平衡, 有些個體不能回到最初平衡點, 可經(jīng)過調(diào)節(jié)產(chǎn)生新平衡點(Lushchak,2011)。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度Cd2+刺激下, BsGPx7 基因在鰓和皮膚中均出現(xiàn)高表達(dá), BsGPx8 在肝臟、鰓和皮膚中同樣高表達(dá), 說明肝臟、鰓、皮膚在防御Cd2+誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中起一定作用。1/2 LC50組的鰓BsGPx7 基因表達(dá)量在24 h 恢復(fù)至初始水平后趨于穩(wěn)定, 1/8 LC50組皮膚BsGPx7 和BsGPx8 基因表達(dá)量也均在48 h 恢復(fù)初始水平并逐漸趨于穩(wěn)定。這可能是因為Cd2+誘導(dǎo)的氧化脅迫激活了機(jī)體的抗氧化途徑,活性氧自由基被清除后, 機(jī)體再次回到了最初的活性氧平衡點。本研究發(fā)現(xiàn)BsGPx8 基因在鰓中的表達(dá)量峰值隨Cd2+濃度的升高而減小, 與劉偉等(2018)對斑節(jié)對蝦GPx3a 基因的研究結(jié)果一致, 原因可能是直接暴露在高濃度的Cd2+環(huán)境中, 鰓細(xì)胞受到一定程度的破壞, 致使表達(dá)量有所下降。孟曉林等(2012)研究已證實水中Cd2+濃度越高, 鰓中Cd2+生物沉積濃度也越高, 本研究中BsGPx7 和BsGPx8 基因在鰓中的表達(dá)量變化趨勢為Cd2+濃度越高, 出現(xiàn)快速上調(diào)和達(dá)到峰值的時間越短, 原因可能是鎘離子濃度升高, 鰓中Cd2+生物沉積濃度也隨之升高, 所以激活抗氧化防御途徑所需的時間也越短。

BsGPx8 的21～40 位氨基酸與人類GPx8 中編碼跨膜區(qū)的序列高度相似(Mihaliket al, 2020), 存在跨膜螺旋區(qū), 原核表達(dá)純化難度較大, 因此本研究僅選取BsGPx7 開展原核表達(dá)及蛋白純化。本研究成功構(gòu)建了BsGPx7 基因的原核表達(dá)載體PET28b-BsGPx7,并通過原核表達(dá)和蛋白純化獲得了高純度的rBsGPx7 蛋白, 為制備BsGPx7 單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。通過熱和酸堿刺激發(fā)現(xiàn)rBsGPx7 蛋白熱穩(wěn)定差,耐酸堿范圍較窄, 在35 °C, pH 值為8 的條件下保持較高活性, 為中華烏塘鱧GPx7 的使用和保存條件提供了一定依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了中華烏塘鱧GPx7 與GPx8 基因的 CDS 序列, 通過序列分析證明了兩者隸屬于GPx 家族, 均為不含硒的谷胱甘肽過氧化物酶基因。在不同濃度Cd2+脅迫下, BsGPx7 在鰓和皮膚中的表達(dá)量均發(fā)生顯著變化, BsGPx8 在肝臟、鰓和皮膚中的表達(dá)量同樣發(fā)生顯著變化, 表明BsGPx7 與BsGPx8參與了機(jī)體對抗鎘離子誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的過程, 可能在抗氧化防御中起一定作用。成功構(gòu)建BsGPx7 基因的原核表達(dá)載體PET28b-BsGPx7, 通過原核表達(dá)和蛋白純化獲得了高純度的BsGPx7 重組蛋白, 通過酶活測定得到BsGPx7 重組蛋白的最適溫度為35 °C,最適pH 為8。