苗 晶，高麗峰，孫孟雄，劉 楠，張鴻清，王志華

(1.張家口市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 張家口 075000；2.張家口市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 張家口 075000；3.張家口市第一醫(yī)院病理科，河北 張家口 075000)

卵巢癌是一種比較常見(jiàn)的女性生殖系腫瘤，既往臨床針對(duì)卵巢癌大多通過(guò)陰道超聲、人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)、癌抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)等進(jìn)行診斷，其中陰道超聲具有一定診斷價(jià)值，但作用較局限，對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值尚不理想[1]。CA125是比較經(jīng)典的卵巢癌標(biāo)記物，但部分卵巢癌可能不產(chǎn)生CA125，或者表達(dá)水平極低[2]，HE4過(guò)表達(dá)與卵巢癌侵襲、遷移有關(guān)，但其易受腎功能、年齡等因素影響[3]，二者診斷價(jià)值均有限。因此，臨床亟需尋求更理想的分子標(biāo)志物對(duì)該病進(jìn)行診療，并評(píng)估預(yù)后。研究表明，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)表達(dá)于真核細(xì)胞中，其能對(duì)人類基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，在細(xì)胞凋亡、遷移、增殖等過(guò)程中具有重要作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1231與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)，其能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)EGFR/PI3K/AKT通路，阻止癌細(xì)胞增殖[5]。miR-146b參與炎癥進(jìn)展，并且與癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生有關(guān)[6]；此外，miR-146b的表達(dá)水平與腫瘤增殖、侵襲和惡性程度有關(guān)[7]。基于此，本研究選取141例卵巢癌患者，分析miR-1231、miR-146b在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與患者預(yù)后的關(guān)系，以期為卵巢癌的診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年5月至2018年5月我院收治的141例行卵巢癌根治術(shù)的患者作為卵巢癌組，取同期行腹腔鏡手術(shù)治療的69例良性卵巢組織病變患者作為對(duì)照組。卵巢癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理診斷證實(shí)為卵巢癌；無(wú)放/化療以及免疫治療史；首次診斷為卵巢癌；病歷資料完整；能配合完成各項(xiàng)檢查。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床診斷證實(shí)為良性卵巢組織病變；近3個(gè)月內(nèi)無(wú)藥物治療史；臨床資料完整；能配合完成各項(xiàng)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：患其他原發(fā)性腫瘤；因腫瘤復(fù)發(fā)就診；患血液系統(tǒng)疾病；有嚴(yán)重心肌梗死、心力衰竭、腦梗死等心、腦血管病史；肝、腎等重要臟器功能不全。2組患者基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。本研究獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2016021)。

表1 2組患者基線資料比較

1.2 檢測(cè)方法

主要儀器：恒溫水浴鍋(中國(guó)金壇市順華儀器，HH.W型)、高速離心機(jī)(美國(guó)DC Pount公司，RC.5C型)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司，7500型)。主要試劑：Trizol試劑(批號(hào)：15596-026，北京索萊寶科技有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：2018012，美國(guó)Sigma公司)和2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒(批號(hào)：2017003，美國(guó)Sigma公司)。

通過(guò)手術(shù)獲取2組患者樣本組織，采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)組織中miR-1231、miR-146b mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。經(jīng)Trizol試劑提取總RNA，按說(shuō)明書操作，并測(cè)定純度以及濃度，放置在-70 ℃環(huán)境下待檢。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后用2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min(預(yù)變性)，94 ℃ 30 s(變性)，55 ℃ 30 s(退火)，72 ℃ 2 min(延伸)，共35個(gè)循環(huán)。miR-1231上、下游引物序列分別為5’-GCCAGTGTCTGGGCGAC-3’、5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-146b上、下游引物序列分別為5’-GCGTGAGAACTGAATTCCA-3’、5’-GTGCAGG-GTCCGAGGTAT-3’；以U6為內(nèi)參，上、下游引物序列分別為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’、5’-AACGCTTCAC-GAATTTGCGT-3’。采用2-ΔΔCT表示miR-1231、miR-146b mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪分析

卵巢癌組患者術(shù)后隨訪3年，以隨訪期滿為截止時(shí)間，隨訪方式包括微信、電話等，記錄患者的3年累積生存情況。根據(jù)預(yù)后將卵巢癌患者分成預(yù)后良好組(無(wú)事件生存者)、預(yù)后不良組(出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡等不良事件者)，并比較2組年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、組織學(xué)類型、分化程度、國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)分期、腹水、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后放/化療、miR-1231及miR-146b表達(dá)的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組和對(duì)照組miR-1231、miR-146b mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

卵巢癌組miR-1231、miR-146b相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 卵巢癌組和對(duì)照組miR-1231、miR-146b mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2 卵巢癌患者預(yù)后情況單因素分析

術(shù)后隨訪3年，在141例患者中預(yù)后良好99例，預(yù)后不良42例。根據(jù)卵巢癌組患者的miR-1231、miR-146b相對(duì)表達(dá)水平均值分成高表達(dá)組與低表達(dá)組。預(yù)后不良組低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的占比高于預(yù)后良好組，術(shù)后放/化療及miR-1231、miR-146b高表達(dá)的占比低于預(yù)后良好組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 卵巢癌患者預(yù)后不良的單因素分析[例(%)]

2.3 卵巢癌患者預(yù)后不良的Cox多元回歸分析

對(duì)單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量進(jìn)行賦值，作為自變量X，以預(yù)后作為因變量Y(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)，進(jìn)行Cox多元回歸分析，結(jié)果顯示低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，術(shù)后放/化療及miR-1231、miR-146b高表達(dá)是預(yù)后的保護(hù)因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 卵巢癌患者預(yù)后不良的Cox多元回歸分析

2.4 不同miR-1231、miR-146b表達(dá)患者的預(yù)后比較

miR-1231高表達(dá)組3年累積生存率為87.34%(69/79)，miR-1231低表達(dá)組3年累積生存率為56.45%(35/62)，miR-1231高表達(dá)組3年累積生存率高于miR-1231低表達(dá)組(log-rankχ2=17.126，P<0.05)；miR-146b高表達(dá)組3年累積生存率為88.00%(66/75)，miR-146b低表達(dá)組3年累積生存率為57.58%(38/66)，miR-146b高表達(dá)組3年累積生存率高于miR-146b低表達(dá)組(log-rankχ2=16.789，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

a:miR-1231；b：miR-146b

3 討論

卵巢癌是一種患病率較高的婦科腫瘤，以上皮性卵巢癌居多，致死率在各類婦科腫瘤中居首位；卵巢癌早期發(fā)病隱匿，無(wú)典型癥狀，診斷難度大，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)展成中晚期，并伴轉(zhuǎn)移，5年生存率為30%～40%，預(yù)后較差[8]。目前，臨床手術(shù)切除以及放/化療在卵巢癌的治療中應(yīng)用廣泛，且取得了一定治療效果，能提高患者短期生存率，但遠(yuǎn)期總體生存率仍無(wú)明顯提升，再加上受腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)等影響，預(yù)后更差[9]。卵巢癌的發(fā)病與進(jìn)展機(jī)制較為復(fù)雜，通常涉及基因表達(dá)異常。有研究指出，miRNA對(duì)基因表達(dá)有調(diào)控作用，且參與了腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展[10]。miRNA能與mRNA 3’-UTR區(qū)堿基結(jié)合，降解靶基因，從而調(diào)控基因表達(dá)；不同miRNA在腫瘤中發(fā)揮的作用也不同，可起到促癌或抑癌作用，影響腫瘤的進(jìn)展[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1231調(diào)控腫瘤的機(jī)制比較復(fù)雜，其可能受circular RNA circ_0025033調(diào)控，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移[12]。miR-146b能靶向調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸磷酸酶1B，從而調(diào)控胃癌細(xì)胞的凋亡以及增殖[13]。這提示miR-1231、miR-146b與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，卵巢癌組的miR-1231、miR-146b mRNA相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)，表明二者低表達(dá)可能參與了卵巢癌發(fā)生。miR-1231在多種腫瘤中可見(jiàn)異常表達(dá)，陳石林等[14]發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者的血漿miR-1231表達(dá)較健康者低，且其低表達(dá)與胰腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)；顧園等[15]指出結(jié)腸癌組織中miR-1231呈低表達(dá)，其低表達(dá)可能與結(jié)腸癌進(jìn)展、侵襲相關(guān)。以上研究表明miR-1231低表達(dá)可能具有促癌作用，在腫瘤中存在重要調(diào)控功能。此外，hsa-circ-0137606能通過(guò)調(diào)控miR-1231參與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)miR-1231分泌，從而抑制腫瘤進(jìn)展，進(jìn)一步提示miR-1231表達(dá)具有抑癌作用[16]。有研究顯示，miR-146b能抑制ST8SIA4基因表達(dá)，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲[17]；miR-146b可通過(guò)誘導(dǎo)白介素-1受體相關(guān)激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK-1)表達(dá)上調(diào)，調(diào)控腫瘤進(jìn)展過(guò)程中的炎癥反應(yīng)[18]，這可能是其影響腫瘤患者病情的機(jī)制。

目前，臨床關(guān)于卵巢癌的發(fā)病與進(jìn)展機(jī)制尚未完全明確，尋找合適的靶點(diǎn)改善患者預(yù)后一直是研究的難點(diǎn)，而影響卵巢癌患者預(yù)后的因素眾多，包括臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等[19]，但這些均為常規(guī)因素，無(wú)法作為卵巢癌治療的靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后是否放/化療與卵巢癌患者的預(yù)后有關(guān)，而miR-1231、miR-146b高表達(dá)對(duì)卵巢癌患者的預(yù)后有保護(hù)作用，且二者低表達(dá)會(huì)降低患者3年累積生存率。有研究發(fā)現(xiàn)miR-1231受LINC00673外顯子4的調(diào)控，能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡[20]。 表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號(hào)通路和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號(hào)通路在卵巢癌中異常激活，而miR-146b作為一種腫瘤抑制因子，可能通過(guò)聯(lián)合阻斷EGFR和IL-6/STAT3信號(hào)通路進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移過(guò)程[21]。miR-1231、miR-146b在卵巢癌中可能均有抑癌作用，二者低表達(dá)能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，加重病情。臨床通過(guò)對(duì)miR-1231、miR-146b表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，可能對(duì)卵巢癌患者的預(yù)后評(píng)估有益。

綜上所述，卵巢癌組織中miR-1231、miR-146b低表達(dá)，二者高表達(dá)對(duì)卵巢癌患者的預(yù)后有保護(hù)作用，而低表達(dá)則會(huì)降低患者3年累積生存率。但本研究對(duì)miR-1231、miR-146b在卵巢癌中的作用機(jī)制研究還處于初步探索階段，未來(lái)還需進(jìn)一步明確二者的靶基因，深入闡述其與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系。