何 平，熊隆信

(南昌市第一醫(yī)院普外科，南昌 330006)

結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中居第3位，死亡率居第5位[1]，且有逐年上升的趨勢[2]。有研究[3]顯示，惡性結(jié)直腸腫瘤一般都經(jīng)歷了息肉、腺瘤、上皮內(nèi)瘤變、早癌等病理過程，演變過程可經(jīng)15～20年時間，如能及時發(fā)現(xiàn)、盡快確診、適時干預(yù)，則可在很大程度上降低CRC的發(fā)病率和病死率。

微小核糖核酸(miRNA)是真核生物中一類內(nèi)源性的小非編碼RNA，其長度約18～25個核苷酸。miRNA可作用于靶基因mRNA，使其降解或抑制其翻譯過程，從而在細(xì)胞增殖、凋亡和組織分化等多種生理活動中發(fā)揮重要作用[4]。miRNA還有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[5]。近年來有研究[6-7]表明，miR-196a參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展，其在胃癌、胰腺癌等腫瘤組織中均呈高表達(dá)狀態(tài)。E盒結(jié)合鋅指蛋白2(ZEB2)含2個鋅指結(jié)構(gòu)簇，可通過與DNA的結(jié)合，對基因轉(zhuǎn)錄過程進行調(diào)節(jié)，屬于轉(zhuǎn)錄因子家族。ZEB2能夠通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞上游轉(zhuǎn)錄啟動子激活，加速癌細(xì)胞核DNA復(fù)制，最終促進癌細(xì)胞的分裂[8]。ZEB2是TCF8/Zfh1家族中的一員，被認(rèn)為是一種致癌基因，其異常表達(dá)推動著腫瘤的惡性發(fā)展，在多種癌癥中均發(fā)揮著重要作用[9]。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，ZEB2與CRC的侵襲性和轉(zhuǎn)移性相關(guān)，但具體作用機制尚不清楚。

目前已有很多關(guān)于CRC中基因表達(dá)異常的研究，但對miR-196a與ZEB2表達(dá)情況的研究仍然較少。本研究通過檢測miR-196a和ZEB2在CRC中的表達(dá)情況，分析二者的表達(dá)水平與CRC臨床病理特征的聯(lián)系，探討二者在CRC中的表達(dá)是否具有相關(guān)性，為闡明miR-196a和ZEB2在CRC浸潤轉(zhuǎn)移過程中的作用提供一些理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集南昌市第一醫(yī)院2019年1月至2021年8月確診為結(jié)直腸癌并行根治性手術(shù)的患者30例，分別取CRC組織及對應(yīng)癌旁組織(距離腫瘤邊緣>5 cm，經(jīng)病理檢查證實未受腫瘤侵犯)標(biāo)本。所有病例術(shù)前均未進行過放、化療等抗腫瘤治療。30例患者中男17例，女13例；年齡26～78歲，平均年齡(52.60±12.25)歲；分期:Ⅰ—Ⅱ期13例，Ⅲ—Ⅳ期17例；腫瘤分化程度：中/低分化19例，高分化11例；病灶直徑：≥5 cm 12例，<5 cm 18例；腫瘤部位：結(jié)腸部位17例，直腸部位13例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況：有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者2例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者28例；淋巴轉(zhuǎn)移情況：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例。

1.2 檢測方法

將癌組織及對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，置入凍存管中，做好標(biāo)注后置于-80 ℃液氮中保存。

1.2.1 實時定量PCR法檢測miR-196a表達(dá)

將冷凍的組織標(biāo)本研磨成粉末，用Trizol RNA試劑盒(購自美國Thermofisher公司)提取組織的RNA，用SYBR?Green法反轉(zhuǎn)錄出cDNA，最后以SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(購于大連寶生物工程公司)進行Real Time PCR反應(yīng)。miR-196a定量實驗的內(nèi)參基因設(shè)置為U6，miR-196a上游引物：5′-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3′，下游引物：5′-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物：5′-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3′(引物由上海生工生物工程股份有限公司合成)。反應(yīng)條件為：90 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃延伸30 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸6 min，分別計算各組標(biāo)本中miR-196a的相對表達(dá)量。每個實驗均獨立重復(fù)3次，取平均值作為最后結(jié)果。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測ZEB2蛋白的表達(dá)

使用RIPA細(xì)胞裂解液處理各標(biāo)本并提取總蛋白，使用10%的SDS-PAGE分離膠電泳分離2 h，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上，室溫下用5%的脫脂奶粉進行封閉，1 h后使用TBST液漂洗5 min。將ZEB2一抗和β-actin(內(nèi)參)一抗分別以1:500和1:1000的比例稀釋于TBS，滴加到膜上4 ℃條件下孵育過夜。再用TBST漂洗5 min后加入1:1000稀釋的羊抗小鼠IgG二抗，室溫下溫育2 h。用TBST充分漂洗后進行ECL化學(xué)發(fā)光顯影，并計算ZEB2相對表達(dá)量。每個實驗均獨立重復(fù)3次，取平均值作為最后結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織miR-196a、ZEB2表達(dá)水平比較

實時定量PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織miR-196a、ZEB2表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織(P<0.001)，見表1。

2.2 miR-196a、ZEB2表達(dá)水平與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系

miR-196a和ZEB2表達(dá)水平與CRC患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤大小、腫瘤部位無明顯關(guān)系(P>0.05)，但與TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.001)，見表2。

表1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織miR-196a、ZEB2表達(dá)水平比較

表2 miR-196a、ZEB2表達(dá)水平與CRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 CRC組織中miR-196a與ZEB2表達(dá)的相關(guān)性分析

Person相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CRC組織中miR-196a與ZEB2的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.789，P<0.001)。見圖1。

miR-196a表達(dá)圖1 CRC組織中miR-196a與ZEB2表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道腫瘤之一，在超過50歲的人群中其發(fā)病率高于20%，死亡率高于10%[11-12]。結(jié)直腸癌的進展主要包括局部惡性增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移2個階段，DCC、APC等抑癌、原癌基因的突變，包括其他一些分子事件參與并決定了CRC的發(fā)展過程。迄今為止，結(jié)直腸癌最主要的治療方式仍為手術(shù)和化學(xué)藥物治療，但對晚期患者的治療效果較差，有較高的死亡率[13]。尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物，有助于在臨床上動態(tài)地評估CRC發(fā)展，采取合理的靶向治療手段，進而降低CRC患者的死亡率。

隨著基因芯片技術(shù)在核酸測序中的應(yīng)用日趨成熟，人們對miRNA的作用機制有了更深入的了解，miRNA在CRC中扮演的角色也逐漸浮出水面。miR-196a作為miRNA重要成員之一，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，在腫瘤發(fā)展過程中表現(xiàn)出促癌基因的功能，抑制miR-196a表達(dá)可加速腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖，減少侵襲及轉(zhuǎn)移發(fā)生[14]。

ZEB2蛋白可抑制黏著蛋白E-cadherin的表達(dá)，激活MMP1、MMP2、MMP14這些基質(zhì)金屬蛋白酶，并誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生，促進腫瘤細(xì)胞的遷徙與侵襲[15]，最終導(dǎo)致腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。楊洲等[16]的研究表明，CRC組織中的ZEB2表達(dá)水平高于正常結(jié)腸組織，下調(diào)CRC中ZEB2的表達(dá)水平可以抑制癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，他們的研究結(jié)果表明，ZEB2參與了CRC癌細(xì)胞的增殖和凋亡過程。ZEB2蛋白主要通過促進癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移影響結(jié)腸癌患者的臨床預(yù)后[17]。筆者前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，ZEB2蛋白表達(dá)水平異常上調(diào)的主要原因是腫瘤微環(huán)境的改變，后者提高了間質(zhì)細(xì)胞中胚胎來源細(xì)胞的分化成熟程度，激活了腫瘤信號通路，最終促進了ZEB2蛋白的合成和釋放。本研究通過檢測ZEB2蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在CRC組織中的ZEB2蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，與有關(guān)研究結(jié)果[19-20]一致，說明ZEB2可能參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖調(diào)控。

綜上所述，miR-196a與ZEB2均參與了CRC的發(fā)生發(fā)展過程，二者在CRC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，且雙方的表達(dá)水平均與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在緊密聯(lián)系，說明二者在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中可能存在相互作用。臨床診治CRC患者時，可考慮將miR-196a與ZEB2作為潛在標(biāo)志物進行動態(tài)監(jiān)測，以提高CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的早期檢出率。miR-196a與ZEB2還可作為新的CRC治療干預(yù)靶點，有望開拓個性化治療新思路，改善CRC患者預(yù)后。本研究局限性在于：選取的標(biāo)本數(shù)量較少，且未探明miR-196a與ZEB2之間的具體作用機制，這一問題有待進一步研究探索。