吳澤榮，王明潮，林榮坤，張冬雅，孫東平，劉紅財(cái)，龐瑞明

(深圳市寶安中醫(yī)院(集團(tuán))骨科，廣東 深圳，518133)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是從骨髓中分離出的干細(xì)胞，具有良好的可塑性和分化成不同類型細(xì)胞的潛能[1]。BMSCs是骨組織工程的重要種子細(xì)胞，在一定條件誘導(dǎo)下可以分化成軟骨、脂肪和成骨細(xì)胞等[2]。BMSCs的成骨分化是目前干細(xì)胞和骨關(guān)節(jié)疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。盤龍七片是一種具有消腫鎮(zhèn)痛，活血化瘀和抗炎作用的中成藥，臨床多應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎，軟骨損傷和骨折等的治療中，但其作用機(jī)制尚不明確[3]。本文通過體外培養(yǎng)觀察盤龍七片對(duì)BMSCs成骨分化的影響并探討其作用機(jī)制，為盤龍七片的藥理研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs(ATCC?PCS-500-012TM)購于美國(guó)菌種保藏中心；盤龍七片購于陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；DEME血清、青霉素、鏈霉素和成骨誘導(dǎo)液購于美國(guó)Sigma公司；RT-PCR所用引物由上海生工生物工程有限公司合成；骨鈣素(osteocalcin)檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測(cè)試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)

BMSCs細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素和鏈霉素的DEME培養(yǎng)基中。盤龍七片用DEME培養(yǎng)基配置為90 μg·mL-1的母液。對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BMSCs細(xì)胞接種至96孔板分組培養(yǎng)。對(duì)照組：加入成骨誘導(dǎo)液(含8×10-8mol·L-1地塞米松，50 mg·L-1維生素C和10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉)培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞；盤龍七片組：加入成骨誘導(dǎo)液的同時(shí)加入不同質(zhì)量濃度的盤龍七片(30、60、90 μg·mL-1)培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞。每24 h換液1次，培養(yǎng)7 d。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

待測(cè)細(xì)胞中加入終質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT，37 ℃孵育4 h。棄上清，加入150 μL的DMSO，490 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 成骨基因mRNA表達(dá)檢測(cè)

Runx2、Osterix和COL1A1的mRNA表達(dá)水平用RT-PCR檢測(cè)。細(xì)胞分組培養(yǎng)1周后，按Trizol試劑盒說明提取總RNA并檢測(cè)其濃度。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR檢測(cè)基因的表達(dá)。反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。以內(nèi)參基因β-actin為對(duì)照，用2-△△Ct法計(jì)算基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

待測(cè)細(xì)胞中加入蛋白裂解液反應(yīng)30 min，用SDS-PAGE電泳分離蛋白。轉(zhuǎn)膜1 h后，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入Runx2、Osterix、COL1A1、Wnt3、p-GSK-3β、β-catenin和β-actin的一抗4 ℃過夜。加入二抗孵育1 h后，用凝膠成像儀對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)骨鈣素水平

細(xì)胞分組培養(yǎng)1周后，1000 r·min-1離心20 min，提取細(xì)胞上清液。檢測(cè)該上清液中骨鈣素的水平，具體操作按照試劑盒說明進(jìn)行，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 ALP活性檢測(cè)

細(xì)胞分組培養(yǎng)1周后，加入Triton X-100后收集細(xì)胞裂解液。按照ALP檢測(cè)試劑盒說明在細(xì)胞裂解液中加入p-硝基苯磷酸二鈉，37 ℃孵育15 min后加入氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)，測(cè)定405 nm波長(zhǎng)吸光度，計(jì)算ALP活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察

BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)后逐漸貼壁，呈梭形或多角形。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞克隆式生長(zhǎng)，按一定方向緊密排列，呈旋渦狀或放射狀，呈長(zhǎng)梭形(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下BMSCs形態(tài)觀察(200×)

2.2 盤龍七片對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖的作用

與對(duì)照組相比，加入盤龍七片30、60、90 μg·mL-1處理的BMSCs細(xì)胞增殖提升(P<0.05)，并且細(xì)胞增殖隨盤龍七片質(zhì)量濃度的升高提升，如圖2。提示盤龍七片可提升BMSCs細(xì)胞的增殖，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用90 μg·mL-1作為盤龍七片的處理濃度。

*P<0.05與對(duì)照組比較。圖2 盤龍七片對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖的作用

2.3 盤龍七片對(duì)BMSCs細(xì)胞中成骨分化基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響

BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)1周后，檢測(cè)成骨基因Runx2、Osterix和COL1A1的表達(dá)。與對(duì)照組相比，Runx2，Osterix和COL1A1的mRNA表達(dá)在盤龍七片組中提升(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，盤龍七片組中Runx2、Osterix和COL1A1的蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖3。提示盤龍七片可促進(jìn)BMSCs細(xì)胞的成骨分化基因表達(dá)。

*P<0.05與對(duì)照組比較。圖3 盤龍七片對(duì)BMSCs細(xì)胞中成骨分化基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.4 盤龍七片對(duì)BMSCs細(xì)胞中骨鈣素水平和ALP活性的作用

盤龍七片組BMSCs細(xì)胞中骨鈣素的水平高于對(duì)照組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，盤龍七片組BMSCs細(xì)胞中ALP的活性顯著提升(P<0.05)。見圖4。提示盤龍七片提升BMSCs細(xì)胞中骨鈣素水平和ALP活性。

*P<0.05與對(duì)照組比較。圖4 盤龍七片對(duì)BMSCs細(xì)胞中骨鈣素水平和ALP活性的作用

2.5 盤龍七片對(duì)BMSCs細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)的作用

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Wnt3和β-catenin的蛋白表達(dá)在盤龍七片組中提升，p-GSK-3β的蛋白表達(dá)在盤龍七片組中降低(P<0.05)。見圖5。提示盤龍七片可激活BMSCs細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

*P<0.05與對(duì)照組比較。圖5 盤龍七片對(duì)BMSCs細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)的作用

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨組織工程的常用細(xì)胞，具有來源廣泛、易于培養(yǎng)和自體移植排斥少等特點(diǎn)[4]。BMSCs具有高度的自我更新和多向分化的潛能。探索藥物對(duì)BMSCs成骨分化的調(diào)控作用，可為臨床各類骨科疾病的治療提供方向和依據(jù)。

中成藥盤龍七片是由著名老中醫(yī)、中國(guó)《中醫(yī)辭典》編寫顧問王家成所獻(xiàn)祖?zhèn)髅胤窖兄贫桑饕杀P龍七、草烏、當(dāng)歸、川烏、丹參等中藥組成[5]。臨床應(yīng)用表明，盤龍七片對(duì)多種骨科疾病有明顯的治療效果，但其作用機(jī)制還未完全研究清楚。本文選取人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs為靶標(biāo)進(jìn)行盤龍七片藥理作用研究，首先觀察不同濃度的盤龍七片對(duì)成骨誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞增殖的影響。30、60和90 μg·mL-1的盤龍七片均對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，且其作用隨著藥物質(zhì)量濃度的升高而提升，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取了效果最大的90 μg·mL-1作為盤龍七片處理濃度。

成骨相關(guān)基因的表達(dá)是BMSCs向成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志。成骨分化過程中，Runx2、Osterix和COL1A1等成骨相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，這些基因在成骨分化的不同時(shí)期表達(dá)[6]。其中，Runx2是成骨分化形成過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄分子，亦是骨形成過程中最早期的特征性蛋白[7]。Osterix和COL1A1同樣是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的重要參與因子，在骨形成的膠原蛋白分泌和骨鈣化等過程中起重要調(diào)節(jié)作用[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在經(jīng)盤龍七片處理后BMSCs細(xì)胞中Runx2、Osterix和COL1A1的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，蛋白表達(dá)量增加，表明盤龍七片具有促進(jìn)BMSCs成骨細(xì)胞分化的作用。

骨鈣素是由成熟成骨細(xì)胞分泌出的一種多肽，能夠抑制軟骨礦化的速度，并促進(jìn)骨組織礦物質(zhì)沉積鈣化，其含量的高低能夠反映成骨細(xì)胞的分化程度[9]。從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的早期開始，細(xì)胞內(nèi)酶ALP水平顯著增加，通過破壞鈣化抑制劑促進(jìn)骨鈣化的發(fā)生。ALP被認(rèn)為是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的標(biāo)志，ALP的活性越強(qiáng)，表明成骨分化程度越高[10]。本文中盤龍七片的處理明顯提升了BMSCs細(xì)胞中骨鈣素和ALP的水平，再次驗(yàn)證了盤龍七片對(duì)BMSCs細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用。

成骨分化的過程被多種分子信號(hào)通路調(diào)節(jié)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在成骨分化以及BMSCs細(xì)胞的自我更新中起關(guān)鍵作用[11]。β-catenin是該通路的核心蛋白，當(dāng)通路激活后，Wnt蛋白可以與受體結(jié)合抑制GSK-3β的磷酸化，提升β-catenin的表達(dá)[12]。有研究[13]表明，盤龍七片可通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)脛骨骨折大鼠的愈合。本研究中盤龍七片的處理顯著提升了BMSCs細(xì)胞中Wnt3和β-catenin的蛋白表達(dá)，抑制了p-GSK-3β的表達(dá)，表明盤龍七片激活細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

綜上所述，盤龍七片能夠提升BMSCs細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，且其作用可能是通過激活Wnt/β-cateinin信號(hào)通路產(chǎn)生的。今后還需進(jìn)一步在動(dòng)物模型中探索和驗(yàn)證盤龍七片對(duì)BMSCs細(xì)胞的作用，以期為盤龍七片在骨科疾病臨床治療中的應(yīng)用提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。